检索结果-南通市图书馆

基因干预mst2的施万细胞稳转株建立及其在线粒体膜电位检测的应用

在线全文

同方期刊数据库

学校读者我要写书评

暂无评论

中国神经精神疾病杂志 2024年第2期50卷 102-109页

作者：黄贝旭刘昶梁嫩廖松洁中山大学附属第一医院神经科广东省重大疾病诊治研究重点实验室国家临床重点专科和国家重点学科广州510080

目的构建稳定敲低及过表达哺乳动物Ste20样激酶2(mammalian ste20-like kinase 2, mst2)的大鼠施万细胞株,并初步探讨mst2对线粒体膜电位的调控作用。方法大鼠施万细胞株(RSC96)分为正常对照组(对照组)、氧糖剥夺(oxygen and glucose d... 详细信息

目的构建稳定敲低及过表达哺乳动物Ste20样激酶2(mammalian ste20-like kinase 2, mst2)的大鼠施万细胞株,并初步探讨mst2对线粒体膜电位的调控作用。方法大鼠施万细胞株(RSC96)分为正常对照组(对照组)、氧糖剥夺(oxygen and glucose deprivation, OGD)模型组、mst2敲低对照组、mst2敲低组、mst2过表达对照组、mst2过表达组。逆转录PCR法扩增大鼠mst2基因全长序列,构建过表达mst2基因的慢病毒表达载体重组质粒并鉴定。使用第二代慢病毒包装系统获取mst2基因敲低及过表达的慢病毒毒液,并分别感染RSC96细胞株,建立基因干预mst2的稳转株。实时荧光定量PCR结合western blot检测基因干预效率,光镜结合S100荧光染色观察稳转株形态学变化。使用OGD模型处理细胞,以线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)检测细胞线粒体膜电位水平(mitochondrial membrane potential, MMP)。结果经测序分析,成功构建mst2慢病毒表达载体重组质粒。施万细胞稳转株具有施万细胞的形态特征,并且表达施万细胞特异性标志物S100。在慢病毒感染的施万细胞,mst2表达在mRNA及蛋白水平上均较对照组有稳定且显著的差异,敲低效率超过90%,过表达约为对照组的40倍。稳转株在OGD模型中,对于mst2蛋白的基因干预仍然维持稳定。OGD可显著增加mst2蛋白表达,并降低施万细胞MMP,提示线粒体功能受损;而敲低mst2则显著改善MMP。结论本研究成功构建了稳定敲低及过表达mst2的大鼠施万细胞株,并且在OGD模型中,敲低mst2可改善线粒体膜电位,提示其对线粒体具有保护作用。

关键词： mst2 施万细胞稳转株氧糖剥夺线粒体膜电位

维普期刊数据库

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

mst2-RAPL的结构与功能研究

MST2-RAPL的结构与功能研究

作者：刘国光安徽大学

学位级别：硕士

mst1和mst2属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族STE20的成员。在Hippo信号通路中发挥重要作用,参与抑制细胞过生长和促进细胞凋亡等生理过程。mst1和mst2在控制器官的大小和抑制肿瘤的生长方面,表现出相同的作用。mst1/2的SARAH domain参与MS... 详细信息

mst1和mst2属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族STE20的成员。在Hippo信号通路中发挥重要作用,参与抑制细胞过生长和促进细胞凋亡等生理过程。mst1和mst2在控制器官的大小和抑制肿瘤的生长方面,表现出相同的作用。mst1/2的SARAH domain参与mst1/2与其它蛋白的相互作用,影响同源二聚化或异源二聚化的形成,这些特定的蛋白包括RASSF家族成员及支架蛋白Salvador。 mst1一直被认为参与淋巴细胞的转移,在Hippo通路中发挥独特的作用。RAPL (RASSF5)被认为是与mst1/2相互作用的蛋白,但是,其相互作用的生化机理是什么,仍然没有明确的答案。因此,我们在自然状态下对mst1/2与RAPL是如何相互作用在毫微摩尔级的Kd值进行了检测,结果表明RAPL与mst2是按照摩尔比1：1形成相互作用的复合物,并且RAPL与mst2的结合能轻微的提高mst2的激酶活性。SARAH domain对于RAPL与mst2的异源二聚体的形成是必不可少的。我们已经解析出mst2SARAH domain的晶体结构,其结构是一个反向平行的同源二聚体螺旋结构,与mst1的SARAH domain结构相比,在构象上更具有灵活性。以SARAH的结构为导向,对其重要的氨基酸残基进行突变研究,结果表明,重要位点的突变对于mst2自身二聚化及与RAPL形成异源二聚化都是至关重要的。其中,mst2459位的甲硫氨酸残基的突变,不仅打破了其同源二聚体结构,而且破坏了与RAPL的结合。进一步的生化和细胞实验表明SARAH domain调节mst2自身同源二聚化及与RAPL的异源二聚体,进而行使凋亡功能。我们所有的实验结果都一致表明,mst2-RAPL的相互作用与T细胞功能相关。 mst1和mst2共同拥有具有较高同源序列的N端激酶催化作用区和不同的C端SARAH调节区。SARAH调节区可以与RASSF(属于Ras蛋白家族)和Salvador蛋白结合形成异源二聚体。通过动物实验表明,mst1和mst2在功能上表现为冗余,但是当把mst1和mst2同时敲除将导致动物出现胚胎致死现象;当把mst1或mst2进行单一的敲除时,并不表现出上述现象,也不会损害器官的发育;mst1和mst2的双切除会导致肝脏肿瘤的发生,这种现象是通过抑制YAP的磷酸化作用和增加YAP的核定位来实现的。虽然mst1和mst2序列高度同源和功能冗余,但是mst1和mst2展现出了在某些方面不同的调节功能,例如：在对蛋白磷酸酶的敏感性方面表现不同。mst1的SARAH调节区结构已经通过核磁的方法解析出,其结构表现为反向平行的二体结构;但是,mst2的SARAH调节区的结构一直未被解析出。

关键词： mst2 RAPL/RASSF5 晶体结构同源二聚体异源二聚体细胞凋亡

PGRN对调节性T细胞发育及功能的影响和机制及mst1与mst2的共同作用对B细胞发育及BCR信号的影响和机制研究

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

PGRN对调节性T细胞发育及功能的影响和机制及Mst1与Mst2的共同作...

作者：杨迪重庆医科大学

学位级别：硕士

第一部分PGRN对调节性T细胞发育及功能的影响和机制目的:探讨颗粒蛋白前体(PGRN)对调节性T细胞发育和功能的影响及分子机制。方法:在野生型和PGRN基因敲除小鼠模型中,采用流式细胞术检测小鼠中枢及外周各淋巴器官中T细胞各亚群的比例及... 详细信息

第一部分PGRN对调节性T细胞发育及功能的影响和机制目的:探讨颗粒蛋白前体(PGRN)对调节性T细胞发育和功能的影响及分子机制。方法:在野生型和PGRN基因敲除小鼠模型中,采用流式细胞术检测小鼠中枢及外周各淋巴器官中T细胞各亚群的比例及调节性T细胞比例及其功能相关分子的表达。采用RT-PCR检测调节性T细胞中CTLA4的表达。最后采用调节性T细胞体外抑制试验验证其功能变化。结果:与野生型小鼠相比,PGRN敲除小鼠脾脏、胸腺和淋巴结中调节性T细胞的比例均升高,同时发现在脾脏调节性T细胞中CTLA4在基因转录和蛋白表达水平均显著升高。体外功能试验发现PGRN敲除小鼠的脾脏调节性T细胞的抑制功能也较野生型增强。结论:PGRN在调节性T细胞的发育和功能中扮演重要角色,其机制可能涉及CTLA4。第二部分mst1与mst2的共同作用对B细胞发育及BCR信号的影响和机制目的:探讨mst1与mst2的共同作用对B细胞发育和BCR信号的影响及其机制。方法:首先通过基因型为mst1f/+mst2f/f与mst1f/+mst2f/f CD19Cre/+小鼠之间杂交,得到基因型为mst2f/f CD19Cre/+的mst2条件性敲除小鼠(mst2KO)及基因型为mst1f/f mst2f/f CD19Cre/+的mst1mst2条件性敲除小鼠(mst1/2DKO),另外,mst1基因敲除小鼠(mst1KO)是复旦大学陶教授建立的背景为129 Sv Ev小鼠。在各实验小鼠模型中,采用流式细胞术检测小鼠中枢及外周B细胞发育及其各亚群比例的情况;通过Western blot及磷酸化流式细胞术检测在BCR激活的不同时间点的各信号分子的变化;利用激光共定位显微镜术检测可溶性抗原(s Ag)刺激BCR活化过程中各信号分子的变化及其与BCR的共定位情况。结果:与野生型小鼠相比,各实验小鼠模型的B细胞发育与BCR活化情况各有不同。mst1KO小鼠B细胞发育与BCR活化存在明显障碍;mst2KO小鼠B细胞在骨髓及脾脏的发育与BCR活化均未见明显异常;在mst1/2DKO小鼠中则观察到B细胞发育基本正常,BCR活化的障碍较mst1KO小鼠明显减轻。结论:mst1与mst2在B细胞发育和BCR活化中扮演重要角色,其中,mst1已被证实这一过程中发挥正向调控作用,本研究探讨了mst1KO、mst2KO、mst1/2DKO各小鼠模型中B细胞发育及BCR信号转导的变化,发现mst2在这一过程中可能扮演与mst1相反的负向调控作用。

关键词：颗粒蛋白前体调节性T细胞细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4 γ-干扰素抑制功能 mst1 mst2 B淋巴细胞 BCR信号

Hippo信号通路中mst1和mst2的表达在肝癌干细胞干性维持和自我更新中的意义

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

肝脏 2021年第8期26卷 866-870页

作者：闾少冬魏勇鹏王卓袁建勇卢军华东方肝胆外科医院肝外五科上海200438

目的初步探索Hippo信号通路中mst1和mst2的表达在肝癌干细胞干性维持和自我更新中的作用。方法qRT-PCR和免疫组化检测肝癌组织样本中mst1和mst2的表达;qRT-PCR和Western blot检测肝癌细胞中mst1和mst2的表达;通过流式细胞术筛选CD90+、C... 详细信息

目的初步探索Hippo信号通路中mst1和mst2的表达在肝癌干细胞干性维持和自我更新中的作用。方法qRT-PCR和免疫组化检测肝癌组织样本中mst1和mst2的表达;qRT-PCR和Western blot检测肝癌细胞中mst1和mst2的表达;通过流式细胞术筛选CD90+、CD105+、CD133+型的SMMC-7721细胞;qRT-PCR和Western blot检测干细胞标志物水平;转染shRNA在肝癌干细胞中敲低mst1和mst2的表达,镜检观察细胞微球体形成情况,并通过qRT-PCR和Western blot检测干细胞标志物水平。结果mst1和mst2在肝癌组织样本和肝癌细胞中显著高表达;CD90+、CD105+、CD133+型的SMMC-7721细胞微球体形成能力显著增强,干细胞标志物AMPK磷酸化的水平增加,OCT-4和Nanog的表达上调为2.56±0.21、2.32±0.11;敲低mst1和mst2都能显著CD90+、CD105+、CD133+型的SMMC-7721细胞的微球体形成能力,干细胞标志物AMPK磷酸化的水平减弱,敲低mst1后,OCT-4和Nanog的表达下调为0.48±0.02和0.26±0.08;敲低mst1后,OCT-4和Nanog的表达下调为0.35±0.06和0.42±0.03。结论mst1和mst2的表达在肝癌干细胞的干性维持和自我更新中有着重要的生物学意义。

关键词： mst1 mst2 肝癌干性维持自我更新

维普期刊数据库

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

mst1和mst2在胃癌中的表达及意义

现代肿瘤医学 2018年第12期26卷 1863-1867页

作者：刘得利宋强高芳马立聪田旭阳党彤贾彦彬包头医学院基础医学与法医学院内蒙古包头014060 包头医学院医学技术学院内蒙古包头014060 包头医学院第二附属医院内蒙古消化病研究所内蒙古包头014030

目的:探讨mst1、mst2在胃癌组织中的表达及意义。方法:采用SP免疫组化方法检测mst1、mst2在70例非贲门胃癌组织及70例远端切缘的表达情况,分析mst1、mst2的表达水平与胃癌的关系。结果:mst1在胃癌组织中的表达明显低于远端切缘的表达,... 详细信息

目的:探讨mst1、mst2在胃癌组织中的表达及意义。方法:采用SP免疫组化方法检测mst1、mst2在70例非贲门胃癌组织及70例远端切缘的表达情况,分析mst1、mst2的表达水平与胃癌的关系。结果:mst1在胃癌组织中的表达明显低于远端切缘的表达,其表达与胃癌的分化程度、淋巴结转移、肿瘤分期、肿瘤大小关联;mst2在胃癌组织中的表达水平明显低于远端切缘的表达,其表达与胃癌的分化程度、淋巴结转移、肿瘤分期关联。结论:mst1和mst2可能参与了胃癌的发生发展。

关键词： mst1 mst2 蛋白表达胃癌免疫组化

维普期刊数据库

薯蓣皂苷通过RASSF1A/mst2/YAP轴抑制SCC15细胞生长

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

薯蓣皂苷通过RASSF1A/MST2/YAP轴抑制SCC15细胞生长

TRIM21调控Hippo/YAP信号转导的分子机制及其在结直肠癌细胞侵袭和转移中的作用

2020年中华口腔医学会口腔生物医学专业委员会第十次全国口腔生物医学学术年会暨第六次全国口腔杰青优青论坛

作者：张同分田慧陈希彦文勇山东大学口腔医学院

目的:本研究旨在探讨薯蓣皂苷对口腔鳞状细胞癌(OSCC)细胞的生物学效应。材料与方法:材料:舌鳞状细胞癌SCC15系,DMEM培养基,薯蓣皂苷,GAPDH特异性一抗,组蛋白H3,p-LATS(Ser909)、p-mst1、mst、YAP、p-YAP(Ser397)、cyclin D、BAX等特异... 详细信息

目的:本研究旨在探讨薯蓣皂苷对口腔鳞状细胞癌(OSCC)细胞的生物学效应。材料与方法:材料:舌鳞状细胞癌SCC15系,DMEM培养基,薯蓣皂苷,GAPDH特异性一抗,组蛋白H3,p-LATS(Ser909)、p-mst1、mst、YAP、p-YAP(Ser397)、cyclin D、BAX等特异性一抗,bcl-2抗体,RASSF1A特异性抗体,山羊抗兔HRP二抗,PBS,RIPA裂解液,SDS-PAGE凝胶,PVDF膜,脱脂牛奶,缓冲液,TBST,4%多聚甲醛,甘氨酸,TritonX-100,Hoechst33342工作液,L-homo-YAP慢病毒颗粒,LV-5-NC慢病毒颗粒、LV-homo-YAP-shRNA慢病毒颗粒、空慢病毒载体,嘌呤霉素,75%的冷乙醇,碘化丙啶工作液,结合缓冲液,Annexin-VAPC工作液,7-AAD工作液等等。方法:细胞计数(CCK8)和5-乙炔-2′-脱氧尿苷(EdU)掺入测定用于评估增值活性,流式细胞仪检测细胞周期变化和凋亡,Western blotting和共免疫沉淀(Co-IP)检测蛋白水平。结果:用不同剂量的薯蓣皂苷处理SCC15细胞24、48小时,细胞存活数随浓度增加而减少;EdU-阳性细胞随浓度增加而减少。G2/M期细胞的数量明显下降,G0/G1期细胞的数量逐渐增加,细胞凋亡早期和晚期数量随浓度增加而增加。p-LATS(Ser909)、p-mst和p-YAP(Ser397)水平显著升高,但总YAP水平降低。cyclinD1和BCL-2的水平逐渐降低,而BAX表达水平则相反。核YAP水平显著下降,而YAP在细胞质中的积累增加。RASSF1A随浓度和暴露时间增加,其表达增加。薯蓣皂苷降低了G2/M期的细胞数量;而过表达YAP增加了增殖期的细胞数量;薯蓣皂苷使凋亡细胞的数量增加,YAP过表达抑制了SCC15细胞的增殖。YAP敲除组和薯蓣皂苷组导致细胞周期阻滞于G0/G1期,都增加了细胞凋亡比例;其两组的增殖能力也均减弱。并且这两种干预措施的联合对细胞凋亡和增殖都具有协同作用。测定YAP、cyclinD1、BCL-2、BAX的表达水平,同样,与单独干预相比,薯蓣皂苷治疗和YAP抑制联合治疗可产生更大的抑制效果。凋亡前蛋白BAX的表达则呈现相反的趋势。结论:薯蓣皂苷在SCC15细胞中,增强细胞周期阻滞和凋亡,抑制细胞增殖。在机制上,激活了肿瘤抑制蛋白RASSF1A,增强了mst2与RASSF1A和LATS1的结合,最终导致癌蛋白YAP的磷酸化,从而削弱其共转录共激活功能。研究提示薯蓣皂苷可能是一种潜在的治疗OSCC或其他类型肿瘤的药物。

关键词：薯蓣皂苷 RASSF1A mst2 YAP OSCC

来源： cnki会议评论

在线全文

cnki会议

学校读者我要写书评

暂无评论

TRIM21调控Hippo/YAP信号转导的分子机制及其在结直肠癌细胞侵袭...

作者：刘语璇苏州大学

学位级别：硕士

背景:结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是常见的恶性肿瘤之一,其位列全球恶性肿瘤发病率和死亡率的前三位。近年来,随着肠镜检查的普及,我国早期结肠癌的诊断比例在逐年上升,但结肠癌的早期症状较为隐匿,不易察觉,多数病人发现时已属于... 详细信息

背景:结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是常见的恶性肿瘤之一,其位列全球恶性肿瘤发病率和死亡率的前三位。近年来,随着肠镜检查的普及,我国早期结肠癌的诊断比例在逐年上升,但结肠癌的早期症状较为隐匿,不易察觉,多数病人发现时已属于中晚期,这导致治疗效果不理想,术后复发率高。结肠癌细胞的浸润和转移作为结肠癌发展进程中的关键事件,与中晚期患者的不良预后紧密相关,成为癌症相关死亡的主要原因之一。与其他肿瘤类似,结肠癌转移同样是多因素、多基因相互协调作用的多阶段过程。因此,筛选和鉴定调控结肠癌细胞浸润和转移的关键分子,深入阐明其调控机制对靶向干预中晚期结肠癌具有极其重要的临床意义。TRIM21(Triartite Motif21)是三基序蛋白(TriartiteMotif,TRIM)家族的重要一员,具有E3泛素连接酶活性,TRIM21最早作为自身抗原被发现,研究证实TRIM21参与调控诸如细胞增殖、细胞迁移、细胞的凋亡、自噬、分化等多种生理病理过程。近年来的研究揭示TRIM21在肿瘤发生中扮演着重要的角色,其在肿瘤中的具体功能依赖于肿瘤细胞的类型以及特定的肿瘤微环境。然而TRIM21在CRC侵袭与转移中的作用及其调控机制尚不清楚。Hippo信号是一条由一系列蛋白激酶和转录因子组成的激酶链,从低等动物到高等动物,Hippo信号都具有高度保守性,它在维持组织生长和器官大小中发挥重要作用,YAP作为Hippo信号通路中关键的转录共激活因子,以磷酸化的形式参与细胞内的信号转导及其下游靶基因的转录调控,在维持组织器官正常大小以及机体内环境稳态中发挥重要作用。近年来的研究表明,YAP的异常高表达以及显著的异常细胞核定位与多种肿瘤的发生发展密切相关。然而,其潜在的调控机制仍有待进一步深入研究。方法:通过收集TCGA以及GEO数据库中有关结肠癌的RNA-seq数据,我们分析了 TRIM21在CRC组织中的表达并揭示了其临床意义。通过体外迁移和侵袭实验、体内的裸鼠尾静脉注射肺转移模型和结肠癌组织原位种植诱发肝转移的小鼠模型、AOM/DSS诱导TRIM21基因敲除小鼠发生肠肿瘤的模型以及结肠肿瘤类器官模型,我们研究了 TRIM21在结肠癌细胞体外迁移、侵袭以及体内浸润和转移中的作用。在此基础上,进一步运用RNA-seq、免疫共沉淀、Western blot、qPCR等实验方法,深入探究了 TRIM21调控Hippo/YAP信号转导的分子机制。结果:临床上,TRIM21的表达与结肠癌的进展期呈显著的负相关性。患者预后分析提示TRIM21的低表达与结肠癌患者的预后不良紧密相关。基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis,GSEA)进一步揭示,TRIM21的表达与结肠癌的复发和转移紧密相关。另外,RNA-seq联合通路富集分析揭示TRIM21参与调控上皮细胞-间充质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)和Hippo信号通路。体内外功能实验证实TRIM21调控结肠癌细胞EMT依赖于YAP。机制研究揭示,TRIM21能够通过与mst2的直接相互作用催化mst2发生K63连接的多聚泛素化,促进mst2同源二聚体的形成以及自磷酸化,进而增强mst2的激酶活性,削弱YAP在细胞核内的累积及其癌基因活性,抑制结肠癌的发生发展。结论:在本研究中,我们揭示了 TRIM21在结肠癌细胞的浸润和转移中的重要作用,这一过程依赖于其对Hippo-YAP信号通路的调控。机制研究揭示Hippo信号的核心激酶mst2是TRIM21的新相互作用蛋白,TRIM21能够通过与mst2的相互作用催化其发生K63连接的泛素化,进而促进mst2同源二聚体的形成并增强其激酶活性,这极有可能是TRIM21调控结肠癌细胞发生上皮-间质转换的重要分子病理基础。这一研究进一步拓展了人们对CRC细胞侵袭和转移分子机制的认识,也为治疗中晚期结肠癌提供了新思路和新策略。

关键词：转移性结直肠癌 TRIM21 mst2 Hippo-YAP EMT 泛素化

维拉佐酮靶向TRIM21抑制结直肠癌侵袭和转移的分子机制

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

维拉佐酮靶向TRIM21抑制结直肠癌侵袭和转移的分子机制

作者：王艺苏州大学

学位级别：硕士

背景:结直肠癌(Colorectal Cancer,CRC)是常见的消化系统恶性肿瘤,其发病率与致死率在全球范围内均排名前三。早期治疗一般采取手术切除,然而晚期治疗手段有限,预后较差,部分原因是结直肠癌发生侵袭和转移的分子机制复杂,尚缺乏有效的... 详细信息

背景:结直肠癌(Colorectal Cancer,CRC)是常见的消化系统恶性肿瘤,其发病率与致死率在全球范围内均排名前三。早期治疗一般采取手术切除,然而晚期治疗手段有限,预后较差,部分原因是结直肠癌发生侵袭和转移的分子机制复杂,尚缺乏有效的治疗靶点。因此,研究结直肠癌细胞发生侵袭和转移的分子机制,设计新的治疗方案对预防或治疗该疾病具有极其重要的临床意义。三基序蛋白21(Tripartite Motif Containing 21,TRIM21),作为一种广泛存在的E3泛素连接酶,参与细胞代谢、胞质分裂和氧化还原等多种重要的生理过程。近年来,研究表明TRIM21在肿瘤的发生发展中发挥重要的作用。虽然最近的研究发现TRIM21在炎症相关性肠癌发生中发挥重要调控作用。然而,TRIM21在结肠癌演进环节(肿瘤转移阶段)中扮演着怎样的角色仍不清楚,亟待深入研究。Hippo-Yap信号转导的异常与多种肿瘤的发生发展密切相关。Yap作为Hippo信号通路中关键的转录共激活因子,其异常表达和细胞核内活性在驱动肿瘤发生发展中发挥重要作用。因此,靶向抑制Yap的细胞核内活性成为抗肿瘤药物开发的重要策略。然而,目前的抗Yap药物维替泊芬虽然能通过靶向Yap/Taz的相互作用抑制肿瘤生长,但由于其广泛的转录阻断作用,在患者体内引起严重的毒性和副作用。因此,靶向Yap的上游调控分子也许更具有药物开发的优势。方法:采用体外细胞培养、体内小鼠模型和肿瘤组织学方法研究TRIM21在结直肠癌侵袭转移中的作用。采用Western blot、qPCR、免疫共沉淀、免疫组化、分子克隆等分子生物学方法研究TRIM21的调控机制。对FDA(Food and Drug Administration)批准的药物进行基于TRIM21蛋白结构的虚拟筛选,以筛选和鉴定TRIM21的潜在调节药物。通过结构分析和生化分析对维拉佐酮(Vilazodone)的功能进行评价。结果:通过免疫共沉淀实验,我们发现TRIM21与mst2之间存在直接相互作用;通过分子克隆构建TRIM21以及mst2的截短突变,我们明确了 TRIM21的PRY-SPRY结构域和mst2的LINKER结构域是两者结合的关键结构域。分子对接和分子生化实验揭示mst2蛋白中的第366位缬氨酸(V366)是维持TRIM21/mst2相互作用的关键氨基酸。机制研究进一步揭示,TRIM21能够通过与mst2的直接相互作用催化mst2发生泛素化修饰,进而促进mst2同源二聚体形成,并进一步增强其激酶活性。基于此,我们建立了针对靶向TRIM21蛋白的计算机虚拟筛选小分子模型。我们筛选出抗抑郁药物维拉佐酮具有直接靶向TRIM21蛋白,抑制Yap活性的作用。结肠癌患者类器官模型以及小鼠肺转移模型进一步证实维拉佐酮具有显著的抗结肠癌细胞浸润和转移的活性,这一抗肿瘤活性依赖于TRIM21。结论:在本研究中,我们揭示了 TRIM21通过激活Hippo信号通路中的核心激酶mst2抑制结直肠癌细胞侵袭和转移的分子机制;同时我们筛选出抗抑郁药维拉佐酮能够通过与TRIM21蛋白的直接结合增强TRIM21与mst2的相互作用,激活Hippo信号,进而削弱Yap的癌基因活性,抑制结肠癌细胞浸润和转移。这一研究将会为进展期结肠癌的治疗提供新的理论基础,也为将来开发具有我国自主知识产权的靶向型抗肿瘤药物提供知识积累。

关键词：结直肠癌维拉佐酮 TRIM21 mst2