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低盐、高亚硝酸盐胁迫日本囊对虾转录组分析及mjtps基因克隆和功能研究

低盐、高亚硝酸盐胁迫日本囊对虾转录组分析及MjTPS基因克隆和功...

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作者：陈亭君广东海洋大学

学位级别：硕士

日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)是中国沿海地区最具有经济价值的虾类之一。低盐和高亚硝酸盐氮是环境胁迫的两个重要因子,与虾类的生长、存活和免疫调节密切相关。研究低盐和高亚硝酸盐氮胁迫日本囊对虾的分子机制,为日本囊对虾的... 详细信息

日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)是中国沿海地区最具有经济价值的虾类之一。低盐和高亚硝酸盐氮是环境胁迫的两个重要因子,与虾类的生长、存活和免疫调节密切相关。研究低盐和高亚硝酸盐氮胁迫日本囊对虾的分子机制,为日本囊对虾的健康养殖提供重要理论依据。本研究对低盐和高亚硝酸盐氮胁迫下的日本囊对虾进行转录组分析,并筛选出一个与抗逆性密切相关的海藻糖6-磷酸合成酶(TPS)基因进行克隆,用RNA干扰技术对其抗逆和免疫功能进行初步的研究。主要研究结果如下:(1)低盐胁迫日本囊对虾转录组分析:在盐度为8的低盐胁迫下,分别于6、12、24、48和96h取日本囊对虾的肝胰腺以及对照组的肝胰腺进行转录组测序。我们获得88890960–105130044个Clean Reads,数据量为6.68G-7.88G,G30为93.34-94.53%,利用Trinity组装后获得48807条unigenes,N50为1746bp。与对照组相比,分别得到811、589、1095、745和875个差异基因(DEGs)。我们对DEGs进行注释,得到与渗透调节、代谢和免疫相关的通路和基因。并通过q PCR对随机选择的9个基因(Tau D、Sar DH、CLEC、GNMT、BHMT、MAT2α、PPP2Cβ、TAUT和AGMAT)进行验证,其表达量与RNA-seq趋势一致。(2)高亚硝酸盐胁迫日本囊对虾转录组分析:在浓度为80mg/L的高亚硝酸盐胁迫下,分别于6、12、24、48和96h取日本囊对虾的肝胰腺以及对照组的肝胰腺进行转录组测序。10个文库共获得920785608个Clean Reads,数据量为6.48G-7.34G,Q30大于93.07%。利用Trinity软件组装后获得46308条unigenes,N50为1833bp。与对照组相比,分别得到593、606、1089、497和988个DEGs。我们对DEGs进行注释,得到与免疫和代谢相关通路和基因。并通过q PCR对随机选择的9个差异基因(DPD、ABCH、Pro POb、ACADL、CYP2J、PAT4、BHMT、CLEC和PEPCK)进行验证,其表达量与RNA-seq趋势一致。(3)日本囊对虾TPS基因的克隆和表达:Mj TPS基因c DNA全长3308bp,编码844个氨基酸,其分子质量为95.82ku,p I为6.45,具有Glyco＿transf＿20 domain和Trehalose＿PPase domain两个保守的功能结构域。系统进化树显示Mj TPS基因与甲壳类动物聚为一支。q PCR结果显示,Mj TPS在肝胰腺中表达水平最高,在低盐胁迫6-96h内Mj TPS基因的表达量显著上调再下调,而在高亚硝酸盐胁迫6-96h内Mj TPS基因表达水平呈现上调-下调-上调的趋势。(4)Mj TPS基因干扰后功能研究:Mj TPS基因干扰后的3-48h自身表达量显著下降,海藻糖的含量也显著下降。低盐和高亚硝酸盐氮胁迫Mj TPS基因沉默后的日本囊对虾,结果显示,与对照组相比,死亡率显著增加;Mj TPS基因自身的表达水平以及下游产物合成量都显著降低;免疫基因PMO25、ERP、CD、HSP90、HSP70、HSP60、HMC和CLEC2的表达量发生了显著的改变,通过促进或抑制来参与日本囊对虾的免疫应答。其中,CD和ERP属于溶酶体通路,推测当Mj TPS基因被沉默后,日本囊对虾通过抑制溶酶体通路来参与免疫应答。另外,我们发现Mj TPS基因沉默会影响CHI1、ERP和CHS这3个与蜕皮相关的基因的表达量,推测TPS基因可能与蜕皮相关。

关键词：低盐高亚硝酸盐转录组 mjtps基因 RNA干扰

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