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mir-505逆转录引物的设计和mir-505转基因小鼠的生物特性研究

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miR-505逆转录引物的设计和miR-505转基因小鼠的生物特性研究

作者：熊黎东华大学

学位级别：硕士

mirNA是一种长度为20–24nt的单链RNA小分子，它们是一类基因转录后调控的调控器。自从mirNA在动物和人类体内的调控作用被确认以后，便引起了人们对它的特别关注,因为它对生物功能的发展，细胞增殖和分化，以及凋亡和代谢等都具有关键... 详细信息

mirNA是一种长度为20–24nt的单链RNA小分子，它们是一类基因转录后调控的调控器。自从mirNA在动物和人类体内的调控作用被确认以后，便引起了人们对它的特别关注,因为它对生物功能的发展，细胞增殖和分化，以及凋亡和代谢等都具有关键的调控影响。目前检测mirNA的技术有很多，主要有几种方法：微阵列、Northern印迹杂交、实时荧光定量PCR法和克隆测序法。但最常用和最灵敏的mirNA检测技术为茎-环状引物反转录检测法（RT-PCR），该技术是由Chen等将反转录定量PCR技术引入到mirNA的检测当中所建立的,这种茎环结构大大提高了反转录的效率和特异性。如今虽然关于茎-环RT-PCR的相关试验的研究报道很多，但是研究其逆转录茎环引物的茎部结构和环部结构分别对试验中检测样本的灵敏度影响的报道极少。本实验运用茎-环状引物反转录检测法（RT-PCR）构建一个高效且特异性的逆转录茎环引物，以准确定量检测小鼠的mirNA-505基因，同时探讨茎环引物的结构对逆转录效率的影响。主要方法:以mirNA-505基因序列为模板，通过改变通用茎环引物来设计该基因的特异性逆转录引物.具体步骤：将通用茎环引物先保持茎部碱基对的数目不变，再梯度改变环部的碱基个数，经过SYBR-GreenⅠ实时Q-PCR检测可以判断哪个组合的逆转录效率最佳，从而得知引物环部结构对逆转录效率的影响。然后以最佳环部结构作为基础，再梯度改变茎部碱基对的数目，经过后续Q-PCR检测即可以判断出mirNA-505基因茎环引物的最佳茎部碱基的结构和环部结构的组合，从而也得知引物茎部结构对逆转录效率的影响。结果：当固定茎环引物的茎部结构为14对碱基，规律性改变环部碱基个数分别为15，18，21时，经RT-PCR检测的CT值无差异，均为28.5;当固定茎环引物的环部结构为21个碱基，CT值随茎部碱基对(8，11，14)规律性地延长而逐渐增大;当环部结构为21个碱基，茎部结构为8对碱基时CT值最小，为26.7。结论：环部结构对茎环引物的逆转录效率无贡献;而茎部结构碱基相对越少越有利于提高茎环引物的逆转录效率;当环部结构为21个碱基，茎部结构为8对碱基时，茎环引物的效率和特异性是最佳的，适用于准确检测小家鼠的mirNA-505基因。研究目的：为了验证mir-505基因对小鼠性发育的时间有推迟作用。研究方法：首先构建mir505-3P转基因首建鼠，将首建鼠和B6小鼠进行杂交，然后通过实时荧光定量PCR技术测定F1代mir505-3P的DNA插入拷贝数;因为哺乳动物的性发育是由下丘脑—垂体—性腺轴(HPGA)调控的，所以同时采用逆转录实时荧光定量PCR（RT-QPCR)的方法对下丘脑进行mir-505表达量的检测;最后结合对转基因和野生型小鼠的相关表型，确认mir-505对小鼠的性发育的影响。其中检测的表型有以下4种：生长曲线，阴门开启，传代情况，阴道上皮细胞角质化时间。研究结果：转基因小鼠mir505-3P的DNA拷贝数检测结果：不同F0代的F1代转基因小鼠插入的mir505-3P的DNA拷贝数差别很大，从1-125个拷贝不等;同一个F0转基因亲本的F1代转基因小鼠的mir505-3P的DNA插入拷贝数基本相同;F1代的转基因和野生型小鼠下丘脑中mir505-3P的表达量检测结果：转基因小鼠中，插入mir505-3P拷贝数少的（5个拷贝左右）表达量是野生型的2倍左右，插入mir505-3P拷贝数特别多的表达量却和野生型的小鼠无差异。F1代转基因小鼠与野生型B6的表型对照结果：转基因小鼠阴门开启的时间平均值比野生型小鼠的迟1.65天，但差异并不是特别显著;转基因小鼠的阴道脱落的上皮细胞角质化时间的平均值比野生型小鼠的迟1天左右，但二者差异不明显;统计的生长曲线数据中看出，两种小鼠在相同的时间都稳定的增长，几乎没有差异;从统计的生育情况发现两种小鼠在生育后代的只数和窝数也没有明显的差异。结论：从检测F1代中mir505-3P的DNA拷贝数结果看出外源基因的表达情况和其插入的DNA拷贝数相关，拷贝数太多会导致转基因不表达，只有适量的插入几个拷贝才能有助于基因的表达。从转基因小鼠和B6小鼠的性发育表型结果看出，转基因小鼠的VO时间平均比B6小鼠有推迟的趋势，并且从VO到角质化的时间也有推迟的趋势，这与我们预测mir505-3P调控小鼠性发育延迟的作用相符，但具体是否准确还需进一步证明;通过对比转基因小鼠和B6小鼠的生长曲线和生育情况，说明mir505-3P对小鼠的生长情况和生育情况没有明显的影响。该研究的结果与结论将对本实验室今后进一步探索mir505对哺乳动物性发育的作用奠定了一定的实验和理论基础。

关键词：茎环引物 mir-505 逆转录 RT-PCR 性发育表型 mir-505 转基因小鼠 RT-PCR

mir-505在电离辐射促进NSCLC侵袭转移中的作用及其机制

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miR-505在电离辐射促进NSCLC侵袭转移中的作用及其机制

作者：吕小立苏州大学

学位级别：硕士

研究背景肺癌是我国发病率最高的恶性肿瘤之一,临床上约80%的肺癌为非小细胞肺癌（NSCLC）,约80%NSCLC患者会接受放疗,不同剂量电离辐射对恶性肿瘤细胞生物学特性有不同影响,较大剂量照射（如8 Gy以上）对恶性肿瘤细胞产生损伤效应的研... 详细信息

研究背景肺癌是我国发病率最高的恶性肿瘤之一,临床上约80%的肺癌为非小细胞肺癌（NSCLC）,约80%NSCLC患者会接受放疗,不同剂量电离辐射对恶性肿瘤细胞生物学特性有不同影响,较大剂量照射（如8 Gy以上）对恶性肿瘤细胞产生损伤效应的研究已有不少报道,而较小剂量照射（如4 Gy以下）对恶性肿瘤细胞的生物学特性影响的研究较少。我们前期实验研究发现,较小剂量照射可能会对恶性肿瘤细胞产生“兴奋”效应,为进一步证实前期发现并探讨其发生机制,本研究重点关注较小剂量X线体外照射对人肺腺癌A549细胞和H1299细胞体外侵袭迁移能力的影响。近年发现,微小RNA（micro RNA,mirNA）在恶性肿瘤细胞的侵袭转移中发挥重要作用。课题组前期通过Taqman低密度流体芯片筛选了差异表达的mirNA,共检测了 2、4 Gy X线照射前后A549细胞760个mirNA的表达变化,结果发现有13个mirNA表达水平有显著差异,以qRT-PCR进一步验证发现mir-505（has-mir-505-3p）是显著差异表达的mirNA之一,且与2、4 Gy X线照射增强A549细胞和H1299细胞侵袭迁移能力相关,目前尚无关于mir-505参与调控电离辐射诱导的肺癌细胞侵袭迁移能力的研究报道。为此,本实验拟在前期工作基础上,重点研究mir-505在4 Gy X线照射增强肺腺癌细胞侵袭迁移能力中的作用并探讨其发生机制,为肺癌转移的预防、治疗提供潜在新靶点,也为临床肺癌放疗方案的优化提供实验依据。研究目的研究mir-505在较低剂量电离辐射增强A549细胞和H1299细胞侵袭转移中的作用及其机制,为肺癌转移的预防和治疗提供实验依据。研究内容、方法及结果一、mir-505在4 Gy电离辐射增强A549细胞和H1299细胞侵袭迁移能力中的作用1.4 Gy X线照射对A549细胞和H1299细胞侵袭迁移能力影响分别以4 Gy X线照射A549细胞和H1299细胞,采用划痕实验和Transwell实验检测肺癌细胞侵袭迁移能力,照射后24h,A549细胞和H1299细胞侵袭能力较对照组显著增强。2.4 Gy X线照射对A549细胞和H1299细胞mir-505表达影响分别以4 Gy X线照射A549细胞和H1299细胞,提取细胞小RNA,以逆转录及qPCR法检测mir-505表达水平,结果显示,照射后2、4、8、16、24 h的mir-505表达水平逐渐降低。***-505对A549细胞和H1299细胞侵袭迁移能力影响利用小RNA转染技术,将mir-505的mimics和inhibitor分别转染A549细胞和H1299细胞,后以划痕实验和Transwell实验方法检测其侵袭迁移能力变化。结果显示转染了 mir-505 mimics后细胞侵袭迁移能力受到抑制,而转染了 mir-505 inhibitor后细胞侵袭迁移能力显著增强。***-505对4 Gy X线照射增强细胞侵袭迁移能力影响分别将A549细胞和H1299细胞转染mir-505的mimics,24 h后,以4 Gy X线照射转染细胞,,与单纯4 Gy照射组相比,转染mir-505 mimics的细胞侵袭迁移能力没有明显增加。二、mir-505靶基因的预测与验证1.生物信息学软件初步预测mir-505的可能靶基因利用mirNA靶基因预测网站Target Scan,TarBase,mirDB各选取按评分排序的mir-505靶基因100个,对三个网站评分靠前并且同时出现的靶基因综合选取27个。2.预测的靶基因的验证将mir-505的mimic及inhibitor转染A549细胞后以RT-qPCR法验证预测的靶基因表达,结果发现LAMP1基因表达发生显著变化。3.以双荧光素酶报告系统证实LAMP1是mir-505的靶基因选定LAMP1作为mir-505可能的靶基因后,使用双荧光素酶基因报告实验证实了 mir-505与LAMP1有明确结合位点,从而证实了 LAMP1是mir-505靶基因。三、4 Gy电离辐射增强NSCLC侵袭迁移能力的mirNA机制研究1.4 Gy X线照射对LAMP1表达影响以4 Gy X线照射A549细胞和H1299细胞,提取细胞总RNA,RT-qPCR检测照射后不同时间点LAMP1表达水平,结果提示,LAMP1在照射后2、4、8、16、24 h逐渐升高。***1对A549细胞和H1299细胞体外侵袭迁移能力影响通过慢病毒感染构建LAMP1敲低和过表达的稳转细胞株,检测不同稳转株间侵袭迁移能力的变化,结果表明,敲低LAMP1能够抑制A549细胞和H1299细胞的侵袭迁移能力,而过表达LAMP1则增强A549细胞和H1299细胞的侵袭迁移能力。***1对4 Gy X线增强A

关键词： NSCLC mir-505 电离辐射 LAMP1 侵袭迁移

mir-505负向调节HMGB1介导的自噬抑制BoDV-1复制

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miR-505负向调节HMGB1介导的自噬抑制BoDV-1复制

作者：唐甜重庆医科大学

学位级别：硕士

背景:博尔纳病病毒1（BoDV-1）是一种高度嗜神经性的单股负链RNA病毒,可以感染包括马、羊、猕猴等在内的几乎所有温血动物。近年来BoDV-1被证实能引起人畜共患病,并可能引起人类致命性脑炎。micro RNA（mirNA）是一类约含有22个核苷酸... 详细信息

背景:博尔纳病病毒1（BoDV-1）是一种高度嗜神经性的单股负链RNA病毒,可以感染包括马、羊、猕猴等在内的几乎所有温血动物。近年来BoDV-1被证实能引起人畜共患病,并可能引起人类致命性脑炎。micro RNA（mirNA）是一类约含有22个核苷酸的非编码RNA分子,广泛参与生命体的各种生物过程。许多研究报导了mirNA可以通过调控宿主先天性免疫应答,正向或负向调节病毒复制,影响病毒感染过程。我们前期的mirNA芯片结果也显示,BoDV-1感染可引起大鼠脑组织中mir-505的表达显著下调,然而mir-505在BoDV-1感染中发挥的作用仍未可知。目的:探讨mir-505在BoDV-1感染过程中可能发挥的作用和机制,明确mir-505能够靶向调控HMGB1介导的自噬从而影响BoDV-1复制,为BoDV-1感染的防治提供新的药物靶点与理论基础。方法:BoDV-1感染原代神经元后,通过RT-q PCR、Western blotting和免疫荧光检测细胞的感染情况,RT-q PCR检测细胞mir-505的表达变化。进一步通过调控mir-505的表达,检测其对病毒感染过程的影响。利用“Targetscan Human”和“mirDB”数据库寻找mir-505下游靶基因,在RNAhybrid2.2软件中定位mir-505与靶基因3′UTR的结合位点,构建对应位点突变的质粒,通过双荧光素酶报告基因确认mir-505与靶基因3′UTR的结合位点并验证。在感染BoDV-1和过表达mir-505后的神经元中,通过RT-q PCR和Western blotting验证自噬相关基因和蛋白的表达,通过自噬流实验观察LC3荧光蛋白的形态,通过透射电镜观察自噬小体的形成情况。结果:RT-q PCR和WB实验显示稳定感染BoDV-1的大鼠原代神经元中mir-505表达显著下调,过表达mir-505能抑制BoDV-1在细胞内的复制。通过生物信息学分析和双荧光素酶报告基因检测证实,在BoDV-1感染期间,介导自噬的高迁移率族蛋白B1（HMGB1）是mir-505的直接靶基因,RT-q PCR和WB实验显示,感染BoDV-1后HMGB1的表达上调,而过表达mir-505能抑制HMGB1的表达。研究发现,许多病毒可通过自噬的激活促进自身存活和复制。在本研究中,自噬相关检测发现,感染BoDV-1后,神经元细胞中自噬相关的ATG蛋白表达显著上调,自噬相关标志物LC3-I蛋白减少,LC3-II蛋白增多,说明自噬被激活。自噬流实验显示细胞质中出现LC3融合蛋白所致的荧光斑块,透射电镜观察到细胞质中存在自噬小体,证明BoDV-1感染激活了HMGB1介导的自噬。进一步调控mir-505的表达发现,与对照相比,过表达mir-505显著下调神经元细胞中ATG蛋白的表达及LC3蛋白的转化,自噬流实验中LC3融合蛋白所致的荧光斑块减少,透射电镜观察也发现细胞质中自噬小体形成被抑制,说明过表达mir-505显著抑制HMGB1介导的自噬。结论:BoDV-1感染可下调mir-505的表达,从而激活HMGB1介导的自噬,促进病毒复制。此机制可能为未来防治BoDV-1感染提供新的思路和方向,或许可以通过调控mir-505和HMGB1的表达介导BoDV-1的感染。

关键词： BoDV-1 mir-505 病毒复制 HMGB1 自噬

TMZ和mir-505联合通过调节WNT7B/Wnt/β-catenin信号通路抑制胶质母细胞瘤的发展

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TMZ和miR-505联合通过调节WNT7B/Wnt/β-catenin信号通路抑制胶质...

作者：王鹏天津医科大学

学位级别：硕士

【目的】众所周知,高程度胶质瘤是成人中最常见和最恶性的原发性脑肿瘤。其中,IV级胶质瘤,也称为胶质母细胞瘤(GBM)表现为破坏性的临床进展,生存期短以及生活质量差。替莫唑胺(TMZ)是胶质母细胞瘤最成功的化疗药物,但是许多GBM患者对基... 详细信息

【目的】众所周知,高程度胶质瘤是成人中最常见和最恶性的原发性脑肿瘤。其中,IV级胶质瘤,也称为胶质母细胞瘤(GBM)表现为破坏性的临床进展,生存期短以及生活质量差。替莫唑胺(TMZ)是胶质母细胞瘤最成功的化疗药物,但是许多GBM患者对基于TMZ的化疗没有反应。mirNA通过调控靶基因,参与各种生物学的过程,包括细胞分化,增殖,细胞迁移,侵袭,自噬等。在包括胶质母细胞瘤在内的许多肿瘤中都观察到mirNA的失调。据报道,一些特异性的mirNA在GBM中失调,参与调节化疗或放疗抵抗。但是,mir-505在GBM肿瘤发生和化疗敏感性方面的作用尚未见报道。因此,本研究旨在探讨mir-505对GBM发生和进展的影响及其发挥作用的分子机制,找到一种新的mirNA可以促进GBM对TMZ的敏感性,从而开发对GBM有效的治疗策略。【方法】首先,我们通过RT-qPCR实验检测了不同程度GBM患者组织和正常脑组织中mir-505的表达水平,不同GBM细胞系中mir-505的表达水平,以及TMZ处理对mir-505表达水平的影响。通过Kaplan-Meier生存曲线分析了mir-505表达水平不同的GBM患者的生存率。其次,我们进行CKK-8、集落形成、Ed U实验,细胞周期、细胞凋亡、Western blot实验和Transwell迁移实验检测了mir-505对GBM细胞增殖和迁移的影响。然后,我们通过生物信息学软件预测mir-505的候选靶基因,通过EGFP荧光报告载体实验、RT-q PCR和Western blot实验验证mir-505对WNT7B的靶定作用。通过RT-q PCR实验检测了不同程度GBM患者组织和正常脑组织中WNT7B的表达水平,通过Pearson相关分析进一步验证组织水平mir-505和WNT7B的相关性。接下来,我们通过RT-q PCR实验、Western blot实验、CKK-8实验、集落形成实验、细胞周期实验、细胞凋亡实验和Transwell迁移实验检测了不同GBM细胞系中WNT7B的表达水平以及WNT7B对GBM细胞增殖和迁移的影响,并通过功能挽救实验验证mir-505的生物学功能是否通过其对WNT7B的调控实现。最后,我们通过细胞免疫荧光实验、Western blot实验和Top-Flash/Fop-Flash双荧光素酶报告基因实验检测mir-505对Wnt/β-catenin信号通路活性及其下游分子的影响。通过肿瘤异种移植模型、Western blot实验和免疫组织化学染色实验研究了mir-505及WNT7B对GBM肿瘤体内生长的影响。【结果】mir-505的表达水平与GBM的恶性程度呈负相关,且TMZ能促进GBM中mir-505的表达。mir-505通过抑制细胞从G0/G1期向S期转换,促进细胞凋亡抑制GBM细胞的活性和增殖。mir-505通过抑制细胞发生EMT转化抑制GBM细胞的迁移,TMZ与pri-mir-505联合处理后,mir-505的抑癌作用增强。mir-505直接靶定WNT7B,并在m RNA和蛋白水平下调WNT7B的表达。此外,在组织水平mir-505与WNT7B的表达负相关。WNT7B通过加速细胞周期进程,抑制细胞凋亡对GBM细胞的生长活性和增殖起促进作用。WNT7B通过促进EMT途径,进而促进GBM细胞的迁移。同时,功能挽救实验也证实了WNT7B是mir-505的功能性靶基因,mir-505对GBM细胞恶性表型的抑制作用是由WNT7B介导的。mir-505通过下调WNT7B的表达,抑制β-catenin入核,从而抑制Wnt信号通路下游效应分子的表达,灭活Wnt/β-catenin信号通路。mir-505在体内抑制GBM肿瘤细胞的生长和增殖,其机制为抑制WNT7B、β-catenin的表达从而抑制Wnt/β-catenin通路及其下游。【结论】mir-505在胶质母细胞瘤中作为肿瘤抑制剂抑制肿瘤发生。此外,TMZ可以提高mir-505的表达水平,并能够与mir-505结合促进GBM细胞中mir-505介导的抑制作用。而且,mir-505直接靶定并抑制WNT7B,从而使Wnt/β-catenin通路失活。总之,诱导mir-505结合TMZ治疗可能是抑制GBM的有用治疗策略。

关键词：替莫唑胺 mir-505 WNT7B Wnt/β-catenin 胶质母细胞瘤

LncRNA CASC9/mir-505/ERCC1通路影响胃癌生长、迁移及机制的研究

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LncRNA CASC9/miR-505/ERCC1通路影响胃癌生长、迁移及机制的研究

作者：肖青苏州大学

学位级别：硕士

背景:胃癌(gastric carcinoma)是起源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤,在我国各种恶性肿瘤中发病率居首位。但是胃癌发生、发展的机制并不清楚。近年来的研究表明,长非编码RNA(Longnon-codingRNA,lncRNA)广泛参与胃癌的发生与发展,可作为多种癌... 详细信息

背景:胃癌(gastric carcinoma)是起源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤,在我国各种恶性肿瘤中发病率居首位。但是胃癌发生、发展的机制并不清楚。近年来的研究表明,长非编码RNA(Longnon-codingRNA,lncRNA)广泛参与胃癌的发生与发展,可作为多种癌症生物标志物,并具有成为癌症治疗靶点的潜能。研究表明lncRNACASC9在多种肿瘤中发挥重要功能。尽管如此,lncRNACASC9在胃癌中的功能及其分子机制仍有待进一步研究。目的:研究胃癌患者癌组织样本以及癌旁健康组织中CASC9/mir-505/ERCC1通路的表达情况并分析其相关性及临床意义;检测胃癌细胞中CASC9、mir-505、ERCC1的表达情况以及相互关系;检测CASC9的表达;验证CASC9对胃癌细胞活力、增殖以及迁移能力的研究;揭示CASC9在胃癌中发挥功能的分子机制;阐明CASC9/mir-505/ERCC1通路对胃癌细胞活力、增殖以及迁移能力的影响。方法:1、收集胃癌患者癌组织样本以及癌旁健康组织样本,液氮研磨组织样本,Trizol法抽提RNA并逆转录成cDNA,最后通过实时定量PCR的方法检测CASC9/mir-505/ERCC1通路的表达情况;收集胃癌患者癌组织样本以及癌旁健康组织样本,液氮研磨组织样本,通过RIPA裂解法抽提蛋白,用蛋白免疫印迹技术检测胃癌患者癌组织样本以及癌旁健康组织中ERCC1的表达情况,分析二者的相关性及临床意义。2、培养胃癌细胞株 SGC-7901、MKN-45、HGC-27、MGC-803 及 GES-1正常人胃粘膜上皮细胞株,Trizol法抽提RNA并逆转录成cDNA,最后通过实时定量PCR的方法检测CASC9/mir-505/ERCCl通路的表达情况;3、合成CASC9的短发夹RNA,用Lipo-2000转染进胃癌细胞系MGC-803和MKN-45中,然后收集细胞,然后通过qPCR实验检测CASC9的表达情况;CCK8实验检测细胞活力情况;EdU实验检测细胞增殖情况;迁移小室实验检测细胞迁移情况;4、分别进行下列实验:1)合成CASC9的短发夹RNA,用Lipo-2000转染进胃癌细胞系MGC-803和MKN-45中,然后收集细胞,然后通过qPCR实验检测mir-505的表达情况;2)双荧光素酶报告基因检测CASC9与mir-505之间的结合;3)合成mir-505模拟物以及抑制剂用Lipo-2000转染进胃癌细胞系MGC-803和MKN-45中,然后收集细胞,然后通过qPCR实验检测mir-505以及ERCC1的表达情况并通过WB实验检测ERCC1的表达情况;4)双荧光素酶报告基因检测mir-505和ERCC1之间的结合;5)用Lipo-2000分别将对照短发夹RNA、CASC9的短发夹RNA、CASC9的短发夹RNA+mir-505抑制剂转染进胃癌细胞系MGC-803和MKN-45中,然后收集细胞,然后通过qPCR、WB实验检测ERCC1的表达情况;5、用Lipo-2000分别将对照短发夹RNA、CASC9的短发夹RNA、CASC9的短发夹RNA+mir-505抑制剂、CASC9的短发夹RNA+mir-505抑制剂+ERCC的短发夹RNA转染进胃癌细胞系MGC-803和MKN-45中,然后收集细胞,然后通过CCK8实验检测细胞活力情况;EdU实验检测细胞增殖情况;迁移小室实验检测细胞迁移情况。结果:1、CASC9在胃癌患者癌组织样本中的表达水平显著高于癌旁健康组织样本中的表达水平:20例样本中有17例病人的CASC9在癌组织中的RNA表达水平比相应的癌旁健康组织中高;mir-505在胃癌患者癌组织样本中的表达水平显著低于癌旁健康组织样本中的表达水平:20例病人中有18例病人的mir-505癌组织中的表达水平比相应的癌旁健康组织中低;ERCC1在胃癌患者癌组织样本中的表达水平显著高于癌旁健康组织样本中的表达水平:20例病人中有17例病人的癌组织中的ERCC1的蛋白表达水平比相应的癌旁健康组织中高;2、与正常人胃粘膜上皮细胞株GES-1相比,CASC9在胃癌细胞SGC-7901、MKN-45、HGC-27和MGC-803中表达上调;与正常人胃粘膜上皮细胞株GES-1相比,mir-505在胃癌细胞SGC-7901、MKN-45、HGC-27和MGC-803中表达下调;与正常人胃粘膜上皮细胞株GES-1相比,ERCC1在胃癌细胞 SGC-7901、MKN-45、HGC-27 和 MGC-803 中表达上调;3、CASC9 的短发夹RNA能够有效减低胃癌细胞系MKN-45和MGC-803中CASC9的表达;抑制CASC9的表达能显著降低胃癌细胞系MKN-45和MGC-803的细胞活力、增殖能力以及迁移能力;4、

关键词：胃癌 CASC9 mir-505 ERCC1 ceRNA机制

CRISPR/Cas系统介导在哺乳动物细胞中mir-505基因的敲除

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CRISPR/Cas系统介导在哺乳动物细胞中mir-505基因的敲除

作者：邓倩云东华大学

学位级别：硕士

目的：CRISPR/Cas系统是一种新型的基因组编辑技术，Cas9核酸酶能够通过20bp的引导序列而导向特异的基因组位点而使DNA发生双链断裂。同时microRNA是一类长度约22nt的非编码小RNA，在各种生物过程中起到调节功能，如细胞的生长，增殖以... 详细信息

目的：CRISPR/Cas系统是一种新型的基因组编辑技术，Cas9核酸酶能够通过20bp的引导序列而导向特异的基因组位点而使DNA发生双链断裂。同时microRNA是一类长度约22nt的非编码小RNA，在各种生物过程中起到调节功能，如细胞的生长，增殖以及凋亡等。本文通过针对mir-505基因位点，设计两条sgRNA，从而利用CRIPSR/Cas系统对mir-505基因位点进行编辑，探讨CRISPR/Cas系统对靶点的剪切效率的影响因素。为了更深入地研究mir-505的生物学功能，我们尝试将mir-505基因整体敲除。因此在CRISPR/Cas系统介导下，通过同源重组作用将mir-505基因整体替换，从而得到mir-505敲除细胞。随后，我们以mir-505敲除细胞为研究对象，进行各项生物学特性检测。方法：针对mir-505基因设计两条具有不同GC%的sgRNA，随后分别将它们构建入sgRNA表达载体和Cas9蛋白/sgRNA共表达载体。其中Cas9蛋白/sgRNA共表达载体能够同时表达sgRNA和Cas9蛋白，从而实现sgRNA和Cas9蛋白的共传递。分别将构建好的表达载体利用脂质体转染法转染入哺乳动物细胞中，通过T7E1assay和DNA测序的方法检测其剪切效率。结果证明实验所设计的CRISPR/Cas系统的确能够在mir-505靶点起作用，并且揭示不同的CRISPR/Cas系统对靶点剪切效率有所差异。为了整体敲除mir-505基因，我们将打靶载体和CRISPR/Cas系统载体一同转染细胞，通过同源重组修复将mir-505整个基因进行整体替换敲除，再利用G418抗性筛选的方法得到mir-505敲除细胞。利用Real-Time PCR对mir-505基因拷贝数检测以及MTT法测定细胞生长速度的方法比较mir-505敲除细胞和野生型细胞间的差异。结果：成功构建靶向mir-505基因位点的CRISPR/Cas系统载体，能够正确靶向mir-505位点，并在靶点处发生双链剪切。结果显示CRISPR/Cas系统对靶点的剪切效率与Cas9蛋白和sgRNA的剂量成正比;当sgRNA与Cas9蛋白共传递时，也能够明显提高靶点的剪切效率;此外，对靶向mir-505基因的两个不同位点的sgRNA而言，较高GC%的sgRNA有较高的剪切效率。将CRISPR/Cas系统载体和打靶载体共转染哺乳动物细胞，经G418抗性筛选后得到的mir-505敲除细胞。经Real-Time PCR对mir-505基因拷贝数检测发现CRISPR/Cas系统所介导的同源重组更可能够得到mir-505单等位基因敲除细胞，而不是双等位基因敲除。经细胞生长速度测定，发现和野生型细胞相比，敲除细胞的生长速度明显减慢，且两者差异日渐增大。为了获得mir-505完全敲除的细胞，我们尝试在mir-505单等位基因敲除细胞的基础上再一次利用同源重组进行敲除，得到mir-505双等位基因敲除细胞。结论：本研究利用CRISPR/Cas系统靶向哺乳动物细胞的mir-505基因，使得mir-505基因发生突变。CRISPR/Cas系统对靶点的剪切效率和sgRNA和Cas9蛋白的剂量、sgRNA是否和Cas9蛋白共传递以及sgRNA的GC%有关。而mir-505敲除细胞的生长速度明显减慢，说明mir-505在调控细胞的生长，增殖过程中起到一定的调控作用。

关键词： CRISPR/Cas系统 mir-505 哺乳动物细胞基因敲除同源重组

mir-505靶向调控HMGB1逆转肝癌细胞阿霉素耐药

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实用药物与临床 2022年第3期25卷 193-199页

作者：陆林张冬辉徐宇杨景旭锦州医科大学附属第一医院普外科辽宁锦州121001 锦州市中心医院口腔科辽宁锦州121001

目的观察mir-505对阿霉素(ADM)耐药肝癌细胞耐药性及HMGB1表达的影响并探讨其机制。方法采用药物浓度递增法建立肝癌细胞MHCC97阿霉素耐药细胞株MHCC97/ADM即为耐药组,培养48 h肝癌亲本细胞为MHCC97亲本细胞组;以MTT法检测MHCC97亲本细... 详细信息

目的观察mir-505对阿霉素(ADM)耐药肝癌细胞耐药性及HMGB1表达的影响并探讨其机制。方法采用药物浓度递增法建立肝癌细胞MHCC97阿霉素耐药细胞株MHCC97/ADM即为耐药组,培养48 h肝癌亲本细胞为MHCC97亲本细胞组;以MTT法检测MHCC97亲本细胞组及耐药细胞组(MHCC97/ADM细胞)的存活率及半数抑制浓度(IC_(50)),检测MHCC97亲本细胞及耐药细胞mir-505、HMGB1表达差异。对耐药细胞(MHCC97/ADM细胞)给予mir-505拟似剂及mir-505抑制剂转染,以上调或下调mir-505表达,qRT-PCR检测转染效率;与阴性对照组(不进行转染的细胞)比较,MTT法及流式细胞术观察mir-505表达水平对ADM耐药MHCC97细胞生存、IC_(50)及凋亡的影响,以双荧光素酶实验检测mir-505与HMGB1靶向调控关系。结果随着ADM浓度的升高,亲本细胞株细胞存活率降低,抑制率升高,MHCC97细胞株的IC_(50)值为(1.25±0.13)mM,耐药细胞株的IC_(50)值为(41.78±5.41)mM,耐药指数(RI)为33.25。与MHCC97亲本细胞比较,MHCC97耐药细胞mir-505表达下调,HMGB1 mRNA及蛋白表达上调(Pmir-505表达,MHCC97/ADM存活率降低,与阴性对照组比较,IC_(50)降至(23.05±3.88)mM,RI降至17.24。下调mir-505表达,MHCC97/ADM存活率升高,IC_(50)升至(80.28±11.34)mM,RI升至64.22(Pmir-505表达,HMGB1mRNA及蛋白表达下降,下调mir-505表达,HMGB1mRNA及蛋白表达上调(Pmir-505表达逆转MHCC97/ADM的耐药性,增加耐药细胞株凋亡率。在HMGB1的3′端存在mir-505的结合位点。结论上调mir-505表达通过负向调控HMGB1表达部分逆转肝癌细胞ADM耐药。

关键词： mir-505 耐药指数阿霉素肝细胞癌凋亡

mir-505水平与胶质母细胞瘤恶性程度相关性研究

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中国城乡企业卫生 2018年第5期33卷 9-11页

作者：王鹏佟小光天津医科大学天津300380 天津市西青医院神经外科天津市环湖医院

目的本研究旨在通过RT-q PCR检测不同程度GBM患者组织以及不同细胞系中mi R-505的表达水平,找出二者时间的相关性。方法通过RT-q PCR实验检测不同程度GBM患者组织和正常脑组织中mi R-505的表达水平,以及替莫唑胺(TMZ)处理对mi R-505表... 详细信息

目的本研究旨在通过RT-q PCR检测不同程度GBM患者组织以及不同细胞系中mi R-505的表达水平,找出二者时间的相关性。方法通过RT-q PCR实验检测不同程度GBM患者组织和正常脑组织中mi R-505的表达水平,以及替莫唑胺(TMZ)处理对mi R-505表达水平的影响。通过Kaplan-Meier生存曲线分析mi R-505表达水平不同的GBM患者的生存率。结果与非癌性脑组织相比,在GBM组织中mi R-505表达水平较低;且高程度GBM组织中的mi R-505水平低于低程度GBM组织;与mi R-505高水平的GBM组织相比,mi R-505低表达与生存率降低相关;GBM细胞中mi R-505的水平低于正常人星形胶质细胞;在细胞中用100μmol/L的TMZ处理24 h后,mi R-505的水平明显上调,特别是在U251和A172细胞中。结论 mi R-505在胶质母细胞瘤中作为肿瘤抑制剂抑制肿瘤发生,TMZ可以提高mi R-505的表达水平。

关键词：替莫唑胺 mir-505 胶质母细胞瘤

mir-505、mir-505~*在非小细胞肺癌患者组织及血清中的表达及意义

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现代肿瘤医学 2017年第24期25卷 3978-3981页

作者：宋秀军江其生高俊段影于慧杰王思念李振源吕进火箭军总医院核与辐射损伤实验室北京100088

目的:初步探讨非小细胞肺癌(NSCLC)患者肺癌组织及血清中mir-505、mir-505~*表达的变化及其意义。方法:收集NSCLC患者肺癌组织及血清样本,以实时定量PCR(RT-qPCR)方法检测mir-505、mir-505~*表达水平;统计分析采用SPSS 19.0软件。结果:1... 详细信息

目的:初步探讨非小细胞肺癌(NSCLC)患者肺癌组织及血清中mir-505、mir-505~*表达的变化及其意义。方法:收集NSCLC患者肺癌组织及血清样本,以实时定量PCR(RT-qPCR)方法检测mir-505、mir-505~*表达水平;统计分析采用SPSS 19.0软件。结果:11例NSCLC组织中,mir-505、mir-505~*阳性率分别为63.6%和36.4%,无显著性差异(P>0.05)。69例NSCLC(腺癌41例,鳞癌28例)血清中,mir-505的总阳性率为34.8%,其中41例腺癌患者中阳性率为36.6%,28例鳞癌患者中阳性率为32.1%,无显著性差异(P>0.05);mir-505~*的总阳性率为39.1%,其中41例腺癌患者中阳性率为32.3%,28例鳞癌患者中阳性率为60.7%,差异显著(P=0.002,Pmir-505和mir-505~*的阳性率在41例肺腺癌患者中无显著性差异(P>0.05),而在28例鳞癌患者中差异显著(P=0.032,Pmir-505及mir-505~*在放疗与否的NSCLC患者血清中的相对表达无显著性差异(P>0.05)。结论:NSCLC患者血清中mir-505、mir-505~*的表达水平可能与病理类型相关。

关键词： mir-505 mir-505* 非小细胞肺癌实时定量PCR