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Rescue of the albino phenotype by introducing a functional tyrosinase minigene into Kunming albino mice

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World Journal of Gastroenterology 2007年第2期13卷 244-249页

作者： Dong Xiao Ying Yue Xin-Yan Deng Bing Huang Zhong-Min Guo Yun Ma Yi-Li Lin Xun Hong Huan Tang Kang Xu Xi-Gu Chen Center of Experimental Animals Sun Yat-sen University Guangzhou 510080 Guangdong Province China Institute of Comparative Medicine and Center of Experimental Animals Southern Medical University Guangzhou 510515 Guangdong Province China Department of Animal Science College of Basic Medicine the Third Military Medical University Chongqing 400038 China

AIM： To use the tyrosinase minigene as a visual marker to perform microinjection training and improve the techniques related with transgene to greatly elevate the effidency of gene transfer. METHODS： A mouse tyrosinase minigene, i.e., TyBS, in which the 2.25-kb authentic genomic 5＇ non-coding flanking sequence of mouse tyrosinase was fused to a mouse tyrosinase cDNA, was introduced into the fertilized eggs of outbred Kunming albino mice. RESULTS： Of the 11 animals that developed from the injected eggs, two mice （P1 and #8） exhibited pigmented hair （P1） and eyes （P1 and #8）, as confirmed by PCR analysis for the tyrosinase minigene integrated into the genome. When founder P1 was bred to Kunming male mouse, six progeny out of 11 offspring inherited the transgene and the pigmented-eye phenotype. CONCLUSION： Taken together, these results suggest that this minigene encodes the active tyrosinase protein and that its 5＇ flanking region contains the sequences regulating the expression of mouse tyrosinase gene as expected. We have rescued the albino phenotype by introduction and expression of a functional tyrosinase minigene in the Kunming albino mouse and the transgene can be passed to subsequent generation. These findings also indicate that TyBS can be a useful visual marker gene in the co-transgenic experiments.

关键词： minigene Transgenic mice Melanization Phenotypic rescue

minigene Analysis of the c.743 + 40A >G Intronic Variant in the <i>CFTR</i>Gene

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Health 2014年第12期6卷 1352-1360页

作者： Ayman El-Seedy Raed Farhat Marie-Claude Pasquet Alain Kitzis Véronique Ladeveze Génétique Moléculaire de Maladies Rares P&ocirc le Biologie Santé Université de Poitiers Poitiers France

Background: Since the identification of the cystic fibrosis transmembrane regulator (CFTR) gene in 1989, many polymorphisms have been identified in cystic fibrosis (CF) or CFTR-related disorders (CFTR-RDs) patients and still remain to be characterized at the molecular level. These polymorphisms are difficult to classify as pathogenic or non-disease causing because the polymorphisms are either located in the coding region, but are synonymous, or are found in the intronic regions. Here we investigated the potential impact of the c.743 + 40A > G polymorphism within CFTR intron 6 on the alternative splicing. Indeed, this variant has been observed frequently in our examined patients. Moreover, a family carrying this variant exhibited CFTR-RD phenotype. Methods: By denaturing high pressure liquid phase chromatography (DHPLC) and sequencing, thirty of 293 subjects French origin carried the c.743 + 40A > G variant. Of these, 16 patients were affected by CF or CFTR-RD. Wild-type sequences and mutant CFTR intron 6 and its boundaries were inserted into the pTBNdeI hybride minigene and expressed in three different cell lines. After RT-PCR analysis of mRNA using specific primers, sequences of the minigene transcripts were obtained. Results: No aberrant splicing was detected with minigene carrying c.743 + 40A > G variant in all transfected cell lines. However, an alternative splicing in the positive control was detected with a minigene carrying the c.1392G > T + 1G > T mutation: 5 nucleotides were deleted from mRNA sequences, indicating that used cell lines are appropriate for studying the splicing. Conclusion: Transient transfections of a minigene containing the c.743 + 40A > G polymorphism showed no splicing errors, and thus this intronic alteration was finally classified as non-pathogenic. As it is always associated with c.2562T > G and c.4389G > A, or TG12-7T poly-morphisms, further experiments are needed to determine the role of these complex alleles in disease pathogenesis.

关键词： Cystic Fibrosis Polymorphism Complex Allele Hybrid minigene Splicing

采用minigene法研究多指(趾)患者GLI3基因突变的致病性

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采用Minigene法研究多指(趾)患者GLI3基因突变的致病性

Novel mutation c.1210-3C>G in cis with a poly-T tract of 5T affects CFTR mRNA splicing in a Chinese patient with cystic fibrosis

第八次全国医学遗传学学术会议(中华医学会2009年医学遗传学年会)

作者：温雅然赵秀丽刘彦山杨威张学中国医学科学院基础医学研究所医学遗传学系

目的对一个多指(趾)小家系的患者进行候选致病基因筛查,并用minigene方法对可能致病突变进行体外实验验证。方法该家系包含2名患者,患者1为男性,双手轴后多指,左足轴前多趾,右足正常;患者2为患者1女儿,其双手轴后多指,双足轴前多趾且2-... 详细信息

目的对一个多指(趾)小家系的患者进行候选致病基因筛查,并用minigene方法对可能致病突变进行体外实验验证。方法该家系包含2名患者,患者1为男性,双手轴后多指,左足轴前多趾,右足正常;患者2为患者1女儿,其双手轴后多指,双足轴前多趾且2-3趾并趾。获得知情同意后,采集患者1外周血6ml,采用蛋白酶K-SDS-酚/氯仿法提取基因组DNA;针对GLI3基因和HOXD13基因的外显子及外显子/内含子的交界区设计引物,进行PCR扩增和测序;针对在患者1GLI3基因中发现的碱基改变,通过PCR和限制性酶切技术对患者及145名正常对照个体进行突变验证。随后采用minigene方法,将包含可能致病突变的GLI3基因第10内含子5’及3’端各1.4kb序列连同两端第10、11外显子全长序列克隆至pcDNA3.1载体,同时构建野生型质粒作为正常对照,将二种构建体转染HeLa细胞24小时后提取细胞RNA,使用分别位于第10和第11外显子的引物进行RT-PCR扩增,通过中性聚丙烯酰胺凝胶电泳比较不同转染产物扩增片段的大小并对片段进行测序。结果基因组DNA测序结果表明,患者1存在GLI3基因c.1540+2insT突变,该突变国际上未见报道。限制性酶切结果表明此突变仅存在于患者中,而未见于145名正常对照个体。中性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示突变型所得的RT-PCR产物为两种长度不同的片段,分别较野生型所得的RT-PCR产物片段延长约10bp和60bp。测序结果显示突变型GLI3 minigene无法识别第10内含子原有5’剪接供体位点,新产生的2种剪接供体位点较野生型分别后移了12bp和58bp。结论多指(趾)患者1的GLI3基因c.1540+2insT突变可能导致剪接位点的改变,进而使其编码肽链延长和(或)移码,因此初步推测此突变是该多指(趾)小家系的致病突变。

关键词： GLI3 minigene 多指(趾)

来源： cnki会议评论

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Frontiers of Medicine 2022年第1期16卷 150-155页

作者： Xinyue Zhao Keqiang Liu Wenshuai Xu Meng Xiao Qianli Zhang Jiaxing Song Keqi Chen Yaping Liu Xinlun Tian Kai-Feng Xu Xue Zhang McKusick-Zhang Center for Genetic Medicine State Key Laboratory of Medical Molecular BiologyInstitute of Basic Medical SciencesChinese Academy of Medical Sciences&Peking Union Medical CollegeBeijing 100005China Department of Pulmonary and Critical Care Medicine Peking Union Medical College HospitalChinese Academy of Medical Sciences&Peking Union Medical CollegeBeijing 100730China

Cystic fibrosis(CF)is a rare autosomal recessive disease with only one pathogenic gene cystic fibrosis transmembrane conductance regulator(CFTR).To identify the potential pathogenic mutations in a Chinese patient with CF,we conducted Sanger sequencing on the genomic DNA of the patient and his parents and detected all 27 coding exons of CFTR and their flanking intronic *** patient is a compound heterozygote of c.2909G>A,***970Asp in exon 18 and c.1210-3C>G in cis with a poly-T of 5T(T5)sequence,3 bp upstream in intron *** splicing effect of c.1210-3C>G was verified via minigene assay in vitro,indicating that wild-type plasmid containing c.1210-3C together with T7 sequence produced a normal transcript and partial exon 10-skipping-transcript,whereas mutant plasmid containing c.1210-3G in cis with T5 sequence caused almost all mRNA to skip exon ***,c.1210-3C>G,the newly identified pathogenic mutation in our patient,in combination with T5 sequence in cis,affects the CFTR gene splicing and produces nearly no normal transcript in ***,this patient carries a ***970Asp mutation,thus confirming the high-frequency of this mutation in Chinese patients with CF.

关键词： cystic fibrosis CFTR splicing mutation minigene

Effects of splice sites on the intron retention in histamine H_3 receptors from rats and mice

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Journal of Genetics and Genomics 2009年第8期36卷 475-482页

作者： Wenyong Ding Lin Lin Feng Ren Hanfa Zou Ziyuan Duan Jianwu Dai Department of Biochemistry and Molecular Biology Dalian Medical University Dalian 116044 China Key Laboratory of Molecular Developmental Biology Institute of Genetics and Developmental Biology Chinese Academy of Sciences Beijing 100080 China National Chromatographic Research and Analysis Center Dalian Institute of Chemical Physics Chinese Academy of Sciences Dalian 116023 China

In the alternative splicing, intron retention, of histamine H3 receptors in rats and mice, the short transcript isoforms that are excised alternatively spliced introns are easily detected in a very low level in rats and are undetectable in mice using the regular PCR protocol. The retained introns have common 5＇ splice site and different 3＇ splice sites. The detailed mechanism for the special alternative splicing remains largely unclear. In this study, we developed a minigene splicing system to recapitulate natural alternative splicing of the receptors and investigated the effects of 5＇ and 3＇ splice sites on intron retention in HeLa cells. Mutating weak 5＇ and 3＇ splice sites of the alternatively spliced introns toward the canonical consensus sequences promoted the splicing of the corresponding introns in rat and mouse minigenes. The effect of splice site strength was context-dependent and much more sigiaificant for the 3＇ splice site of the longer alternative intron than for the 3＇ splice site of the shorter alternative intron and the common 5＇ splice sites; it was also more significant in the rat minigene than in the mouse minigene. Mutating the 3＇ splice site of the longer alternative intron resulted in almost complete splicing of the intron and made the corresponding isoform to become the nearly exclusive transcript in the rat minigene.

关键词： histamine H3 receptor (H3R) altemative splicing intron retention splice site minigene

NIPBL基因剪接变异致德朗热综合征1型胎儿的产前诊断及遗传学分析

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中华医学遗传学杂志 2022年第10期39卷 1107-1110页

作者：梁磊王海欣蔡泽宇赵建荣内蒙古医科大学附属医院产前诊断中心呼和浩特010050 内蒙古医科大学附属医院肾脏内科呼和浩特010050

目的分析一例德朗热综合征1型胎儿的遗传学病因。方法收集胎儿及其父母的临床资料,采集羊水及父母的外周血样,提取基因组DNA,通过全基因组低深度重测序、全外显子组测序(whole exome sequencing,WES)及Sanger测序筛查NIPBL基因的变异位... 详细信息

目的分析一例德朗热综合征1型胎儿的遗传学病因。方法收集胎儿及其父母的临床资料,采集羊水及父母的外周血样,提取基因组DNA,通过全基因组低深度重测序、全外显子组测序(whole exome sequencing,WES)及Sanger测序筛查NIPBL基因的变异位点,参考美国医学遗传学与基因组学学会指南判断变异的致病性,利用minigene技术分析变异对mRNA的影响。结果测序结果提示胎儿NIPBL基因的内含子上存在c.5808+5G>A杂合变异,预测可能影响mRNA剪接,胎儿父母未检测到相同的变异。上述变异在ExAC、1000G、dbSNP等数据库中均未见收录,综合分析判断其为有害变异。minigene实验结果证实该变异会影响mRNA剪接,导致第31外显子的跳跃。结论确诊了一例德朗热综合征1型胎儿。minigene实验可以在体外验证WES检测所发现的剪接变异,可为判断这类变异的致病性提供更多的证据。

关键词：德朗热综合征1型 NIPBL基因全外显子组测序 minigene

中国急性间歇性卟啉病HMBS基因的剪接变异分析及2个非经典变异位点的致病性验证

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中国急性间歇性卟啉病HMBS基因的剪接变异分析及2个非经典变异位...

作者：王佳佳山西医科大学

学位级别：硕士

目的:急性间歇性卟啉症(AIP,OMIM 176000)是一种常染色体显性遗传的罕见病,是由卟胆原脱氨酶(hydroxymethylbilane synthase,HMBS)的缺陷所引起的。HMBS基因诊断是确诊该病的金标准,对急性发作患者的确诊、隐匿型患者的指导以及遗传咨... 详细信息

目的:急性间歇性卟啉症(AIP,OMIM 176000)是一种常染色体显性遗传的罕见病,是由卟胆原脱氨酶(hydroxymethylbilane synthase,HMBS)的缺陷所引起的。HMBS基因诊断是确诊该病的金标准,对急性发作患者的确诊、隐匿型患者的指导以及遗传咨询都至关重要。以往对基因变异的检测与解读,多关注由外显子变异引起的氨基酸改变,而对于外显子及内含子引起的剪接异常关注较少。近年来越来越多的证据表明剪接变异在疾病发病中起重要作用。对变异位点的致病性解读能够正确引导临床的决策。因此,本研究通过分析中国HMBS基因的剪接变异,并对非经典区域剪接变异位点的致病性进行体外功能实验,为AIP的基因诊断、遗传咨询提供可靠的科学证据,为以后AIP的发病机制、治疗提供分子层面的基础及新的思路。方法:通过pubmed数据库、Embase数据库、中国知网、万方医学等数据库检索中国报道的涉及HMBS基因中剪接变异的文献(时间截止2021年9月)。对于剪接变异中的2个非经典变异位点(c.33+5G>A及c.88-4＿-16del AAGTCTCTACCCG)进行致病性验证:首先通过剪接相关的生物信息软件预测非经典剪接变异位点的致病性(Human Splicing Finder软件、Splice Site Prediction by Neural Network软件、Net Gene2 Server软件);然后行minigene实验,克隆出带有变异位点的目的基因片段,再构建野生型与突变型重组载体,转染到HEK293T和MCF-7两种细胞后提取RNA并行c DNA反转录,最后利用电泳及测序技术,验证非经典变区域异位点对剪接的影响。结果:1.共检索出中国报道的涉及剪接变异位点的文献7篇,共26个剪接变异位点,其中4个位点为重复变异位点(c.33+5G>A、c.88-1G>C、c.88-2A>G及c.913-2A>G)。HMBS基因中除外4、6、8、9、12号内含子,其余内含子中均出现剪接变异。2号内含子出现6个变异位点,11号内含子中出现5个变异位点。15个是位于经典区域的剪接变异,其中受体位置的位点12个。2.变异c.33+5G>A的2个软件预测结果均提示原有的的供体位点被破坏,提示可能影响剪切。其minigene实验结果显示intron 1的5’端91bp被滞留,其剪接方式为Exon1(33bp)-▽intron1(91bp)-Exon2(54bp)。蛋白质一级结构分析显示会导致蛋白质翻译的提前终止(p.(E12Vfs*71))。3.变异c.88-4＿-16del AAGTCTCTACCCG的2个软件提示突变导致原有的受体位点被破坏,提示影响剪切。其minigene实验结果显示Exon 3的5’端15bp的缺失,其剪接方式为Exon2(54bp)-△Exon3(58bp)。蛋白质一级结构分析显示会导致氨基酸的缺失(p.(L88＿Q102del))。结论:1.在中国报道的HMBS基因变异中,共26个剪接变异位点,2号内含子及11号内含子为高频变异内含子。大部分剪接变异位点是位于经典区域的变异位点,其中受体位置的位点更多见。2.c.33+5G>A变异会产生内含子滞留的异常转录本。c.88-4＿-16 del AAGTCT CTACCCG变异会显示产生外显子缺失的异常转录本。以上2个HMBS基因变异中的非经典区域位点均造成剪接的异常,提示c.33+5G>A及c.88-4＿-16del AAGTCTC TACCCG变异具有致病性,是导致携带该变异的患者发病的原因。

关键词：急性间歇性卟啉病 HMBS基因剪接变异 minigene

应用二代测序对一个遗传性痉挛性截瘫SPG26型家系致病基因的研究

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应用二代测序对一个遗传性痉挛性截瘫SPG26型家系致病基因的研究

作者：王晨华中科技大学

学位级别：硕士

目的:遗传性痉挛性截瘫(Hereditary spastic paraplegias,HSPs)是一组以下肢进行性痉挛和无力为特征的遗传性神经退行性疾病,具有高度的临床和遗传异质性。本研究通过靶向基因测序技术(Targeted Next-generation Sequencing,NGS),对一... 详细信息

目的:遗传性痉挛性截瘫(Hereditary spastic paraplegias,HSPs)是一组以下肢进行性痉挛和无力为特征的遗传性神经退行性疾病,具有高度的临床和遗传异质性。本研究通过靶向基因测序技术(Targeted Next-generation Sequencing,NGS),对一个来自河南的HSP家系进行基因诊断,并进行体外实验证实剪接突变对m RNA剪接的影响,分析总结患者的临床特点,为HSP的基因诊断和致病机制研究提供依据。方法:收集一个HSP家系的临床资料,绘制家系图。经得患者及其家属知情同意后,提取外周血DNA样本后进行靶向二代测序。在基因数据库NCBI db SNP和genome1000等数据库中筛选并排除多态性位点,然后运用SIFT、Poly Phen2以及Human Splicer Finder等生物信息学软件预测突变位点对蛋白功能的影响,最后应用PCR扩增结合Sanger测序的方法对筛选的变异位点进行家系验证进而确定其致病性。此外我们对其中发现的一个位于内含子区的剪接突变位点通过构建野生及突变型minigene载体,分别转染至HEK293T细胞体外模拟剪接方式,抽提细胞RNA进行逆转录分析(RT-PCR)及测序分析突变是否影响m RNA剪接。结果:在一个常染色体隐性遗传的HSP家系中,我们发现两名患者除了进行性的下肢无力、步态异常、锥体束征等单纯性HSP常见的临床变现外,还有学习成绩差、严重智力损害、情绪改变等临床表现。通过全外显子测序和Sanger测序验证,发现该家系两名患者均携带有B4GALNT1基因的两个新的复合杂合突变(c.1424C>T,***475Phe和c.1002+2T>G),对患者的父母亲和两个未患病的姐妹进行检测后发现该突变符合家系共分离。这两个突变为新发突变且经过生物信息学预测这两个突变均为致病性突变。对内含子区剪接突变(c.1002+2T>G),构建野生型和突变型minigene载体研究对m RNA剪接的影响发现:与野生型相比位于内含子8的突变造成部分内含子8滞留,突变型剪接产物比野生型长142bp。突变改变了正常的剪接产物序列,从而可能影响转录产物的结构和功能。结论:我们首次发现国内的SPG26家系。与国外报道的SPG26家系的临床特点类似,我国的SPG26患者以青少年起病和下肢痉挛无力外,还有严重智力损害等少见的临床表现。新发现的两个突变(c.1424C>T和c.1002+2T>G),扩展了B4GALNT1的基因突变谱,为HSP的基因诊断和致病机制研究提供依据。

关键词：遗传性痉挛性截瘫 SPG26 B4GALNT1 剪接突变 minigene

全外显子组测序在超声结构异常胎儿与罕见病家系中的遗传病因学研究

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全外显子组测序在超声结构异常胎儿与罕见病家系中的遗传病因学研...

作者：杨能西南大学

学位级别：硕士

背景:我国是人口大国,同时也是出生缺陷高发国家。根据《中国出生缺陷防治报告（2012）》统计,目前我国出生缺陷发生率在5.6%左右,每年新增出生缺陷数约90万例,其中出生时临床明显可见的出生缺陷约为25万例。“出生缺陷”是指婴儿出生... 详细信息

背景:我国是人口大国,同时也是出生缺陷高发国家。根据《中国出生缺陷防治报告（2012）》统计,目前我国出生缺陷发生率在5.6%左右,每年新增出生缺陷数约90万例,其中出生时临床明显可见的出生缺陷约为25万例。“出生缺陷”是指婴儿出生前发生的身体结构、功能或代谢异常。出生缺陷可由染色体畸变、基因突变等遗传因素或环境因素引起,也可由这两种因素交互作用或其他不明原因所致,其中遗传因素异常是造成出生缺陷的重要原因。出生缺陷通常包括先天畸形、染色体异常、遗传代谢性疾病、功能异常,也是导致早期流产、死胎、围产儿死亡、婴幼儿死亡和先天残疾的主要原因。这不但严重危害儿童生存和生活质量,影响家庭幸福和谐,也会造成巨大的潜在寿命损失和社会经济负担。出生缺陷已成为影响人口素质和群体健康水平的公共卫生问题,迫切需要采取适当的干预措施加以预防。自2005年以来,第二代DNA测序平台已经广泛投入使用,相对于第一代Sanger测序,二代测序不仅提高了测序通量且测序成本也得到大幅度降低。测序技术的高速发展使得研究人员可以测定人类的全基因组序列。而联合DNA靶向捕获和高通量测序方法,能够高效的完成人类基因组的编码区测序,该过程被称为“全外显子组测序”。目前该技术已成为一种强大的新方法,可以在常规方法难以检测的情况下识别出与患者表型相关的致病变异。近年来,随着超声技术的发展与普及,临床医生能够以此技术监测胎儿发育情况并发现是否存在异常。我国的出生缺陷监测数据表明,经超声发现的胎儿异常中65.9%为结构异常。利用传统的核型分析、FISH和CMA技术并不能完全明确胎儿结构异常的发生原因,因此亟需新的技术帮助临床医生完成超声结构异常胎儿的产前诊断。已知胎儿结构异常往往与相关基因的变异有关,因此合理运用全外显子测序技术在基因水平上发现胎儿结构异常的致病变异,以此完成更为精准的产前诊断,将在一定程度上避免结构畸形患儿出生,减少出生缺陷。对于罕见病家系中的先证者亦可采用全外显子组测序明确疾病分型与遗传病因,其结果将可能改善先证者的治疗现状并为家系的再生育需求提供指导,从而预防出生缺陷再次发生。方法:（1）利用侵入性手段（羊水或脐血穿刺）获取胎儿完整细胞,培养后进行核型分析和CMA。（2）提取超声结构异常胎儿羊水细胞DNA,完成胎儿WES;若采取trio-WES,则还需提取胎儿父母DNA。（3）报告与胎儿超声结构异常有关的变异,综合胎儿表型与家系情况、一代验证结果、现有报道与研究,依据ACMG变异评级指南进行变异解读。（4）疑似罕见病先证者全外显子组测序分析,minigene验证变异致病性。结果:（1）纳入研究的119例超声结构异常胎儿未能通过核型与CMA明确病因。（2）全外显子组测序对119例胎儿样本平均测序深度为129.91±28.93×,平均覆盖度99.84%,其中大于20×的平均覆盖度98.91%。（3）119例核型与CMA检测未果的超声结构异常胎儿进一步通过WES检测发现具有诊断意义的分子病因17例（17/119,14%）,26例结论暂不明确（26/119,22%）,仍为阴性76例（76/119,64%）。（4）疑似罕见病先证者测序发现COL7A1基因复合杂合变异,minigene实验结果表明变异c.5532+4＿5532+5del AG能够引起COL7A1基因的64号外显子跳跃,形成异常剪接的转录本,致病性明确,与该基因另一变异c.3867del T共同引起先证者的RDEB疾病表型。结论:本研究为WES在临床实践中的应用提供了参考。对核型与CMA检测无果的超声结构异常胎儿采用WES分析可取得一定的分子诊断。WES联合现有技术在产前环境中能够预防部分出生缺陷,指导再生育;对罕见病患者的分子诊断可以改善患者临床诊疗。WES可以拓宽对疾病表型-基因型认识,发现新的致病基因或致病位点,具有一定的实用价值与科学价值。

关键词：出生缺陷超声结构异常胎儿全外显子组测序罕见病 COL7A1 minigene