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作者：罗敏广州中医药大学

学位级别：硕士

完整的肠粘膜上皮屏障能够有效阻止肠腔内细菌、抗原等有害物质侵入体内,是人体内重要的保护屏障。相关研究表明,在严重感染、创伤、休克和大手术等应激刺激下,肠粘膜受损,其自我修复能力必然降低,可导致肠粘膜上皮完整性被破坏。近年... 详细信息

完整的肠粘膜上皮屏障能够有效阻止肠腔内细菌、抗原等有害物质侵入体内,是人体内重要的保护屏障。相关研究表明,在严重感染、创伤、休克和大手术等应激刺激下,肠粘膜受损,其自我修复能力必然降低,可导致肠粘膜上皮完整性被破坏。近年来的研究强调分子信号传导对肠粘膜上皮损伤后的修复和屏障功能重建的关键作用。长期进化以来,肠粘膜已形成了一套损伤后的自我修复机制,包括快速修复和慢速修复。肠粘膜受损时,机体迅速启动快速修复机制来保护肠粘膜,以防细菌、内毒素趁虚而入,相对于细胞增殖,细胞迁移要快得多,首先紧邻缺损部位的活性肠上皮细胞失去其柱状极性并快速迁移,覆盖病灶部位,可在几分钟至几小时内完成修复,随后发生肠上皮的慢速修复机制,肠道干细胞不断增殖分化,并通过移行的方式不断向上迁移以填补减少的细胞数目。细胞迁移过程必然涉及一系列转录和转录后基因修饰水平的调控,mirNA在其中发挥了至关重要的作用,然而,mirNA对肠上皮细胞迁移的作用及机制尚不完全明确。研究显示,健脾益气中药甘草可通过促进肠上皮细胞的增殖、分化和移行等加快肠粘膜屏障损伤的修复。甘草有健脾益气功效,研究表明,甘草中的活性成分甘草酸能够降低肠粘膜通透性,减轻炎症反应,促进肠粘膜屏障损伤修复。本课题旨在研究mir-30c-2-3p在小肠上皮移行修复的作用及机制,同时,初步探讨甘草酸对肠上皮细胞迁移的作用及相关信号通路。目的:研究mir-30c-2-3p对肠上皮细胞增殖、迁移能力的影响;验证mir-30c-2-3p与STIM2之间的靶向调控关系,深入研究mir-30c-2-3p对肠上皮细胞迁移的作用机制及相关信号通路,并初步探讨甘草酸对pYK2/MYLK/MLc2信号通路中的作用,从而为进一步阐明mir-30c-2-3p在肠粘膜损伤修复的作用机制。方法:1.通过MTT实验、EdU实验、细胞划痕实验评价mir-30c-2-3p对肠上皮细胞增殖和迁移能力的影响。2.采用靶基因预测软件预测和分析mir-30c-2-3p可能调节的靶基因,并结合Biotinylated-mirNA pull down实验和双荧光素酶报告基因实验检测mir-30c-2-3p与STIM2之间是否存在靶向调控关系;采用Realtime-pcR技术及Western blot技术进一步检测mir-30c-2-3p对STIM2在mRNA水平和蛋白水平的表达情况,从而验证mir-30c-2-3p对STIM2的靶向调控作用。3.通过Western blot技术、Fura-2 AM钙离子检测的方法,检测mir-30c-2-3p对细胞内钙离子浓度和钙离子相关的MYLK/MLc2信号通路蛋白表达的影响。4.利用FITc标记鬼笔环肽标记F-肌动蛋白骨架,并通过激光共聚焦扫描显微镜观察mir-30c-2-3p对肠上皮细胞骨架的变化。5.通过siRNA技术沉默STIM2及质粒过表达STIM2分别验证mir-30c-2-3p通过靶向调控STIM2促进肠上皮细胞的迁移。6.应用细胞划痕实验、Fura-2 AM钙离子检测、Western blot技术,检测甘草酸对细胞内钙离子浓度和钙离子相关的pYK2/MYLK/MLc2信号通路蛋白表达的影响。结果:1.将mir-30c-2-3p mimic和inhibitor转染进入IEc-6中,细胞增殖实验结果表明各转染组相对于对照组IEc-6细胞增殖能力并没有明显变化;细胞划痕实验结果发现转染48h后各组呈现明显差别,在IEc-6细胞中转染mir-30c-2-3p mimic后细胞迁移速度明显快于mir-30c-2-3p mimic Nc组,愈合能力增强(pmir-30c-2-3p inhibitor能够抑制这种现象,细胞迁移能力明显减弱,与mir-30c-2-3p inhibitor Nc相比差异具有统计学意义(pmir-30c-2-3p预测的靶基因,pull down实验结果表明,mir-30c-2-3p mimic组与STIM2 mRNA结合率明显高于对照组(pmir-30c-2-3p mimic Nc 和 pEZ-STIM2 3' UTR 野生型重组质粒(WT)相比,转染 mir-30c-2-3pmimic和pEZ-STIM2 3' UTR野生型重组质粒的荧光素酶活性明显降低(pmir-30c-2-3p mimic和pEZ-STIM2 3' UTR突变型重组质粒(MUT)则无明显变化,这结果说明mir-30c-2-3p可以直接作用于STIM2 3' UTR靶序列,下调STIM2的表达;RT-pcR、WB验证表明mir-30c-2-3p过表达时抑

关键词： mir-30c-2-3p STIM2 细胞迁移甘草酸 ca2+/MYLK/MLc2信号通路

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mir-30c-2-3p对足细胞活力及Nephrin和podocin蛋白表达的影响

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中国医药导报 2017年第28期14卷 17-20,30页

作者：陈琪闵晶晶王霄一浙江省湖州市第一人民医院肾内科浙江湖州313000 浙江省湖州市第一人民医院神经内科浙江湖州313000

目的探讨mir-30c-2-3p对足细胞活力及Nephrin和podocin蛋白的表达影响。方法采用嘌呤霉素(pAN)诱导的足细胞体外模型,将足细胞分成4组,即空白组、pAN组、阴性质粒+pAN组、阳性质粒+pAN组。通过LipofectamineTM2000瞬时转染mir-30c-2-3p ... 详细信息

目的探讨mir-30c-2-3p对足细胞活力及Nephrin和podocin蛋白的表达影响。方法采用嘌呤霉素(pAN)诱导的足细胞体外模型,将足细胞分成4组,即空白组、pAN组、阴性质粒+pAN组、阳性质粒+pAN组。通过LipofectamineTM2000瞬时转染mir-30c-2-3p mimic。通过cell counting Kit-8(ccK-8)法检测细胞活力、实时荧光定量pcR(qRT-pcR)检测细胞中mir-30c-2-3p表达、Western blot检测Nephrin和podocin蛋白的表达。结果(1)ccK-8结果提示pAN组足细胞活力明显低于空白组,差异有高度统计学意义(ppAN组较pAN组差异无统计学意义(p>0.05),阳性质粒+pAN组足细胞活力与pAN组和阴性质粒+pAN组相比均有所提高,差异有统计学意义(pp2)qRT-pcR显示pAN组mir-30c-2-3p的表达较空白组明显下降,差异有高度统计学意义(ppAN组较pAN组表达差异无统计学意义(p>0.05),而阳性质粒+pAN组mir-30c-2-3p的表达较pAN组和阴性质粒+pAN组均提高,差异有统计学意义(pppAN组Nephrin和podocin蛋白的表达较空白组明显下降,差异有高度统计学意义(ppAN组相比,阴性质粒+pAN组两者蛋白的表达差异无统计学意义(p>0.05),而阳性质粒+pAN组Nephrin和podocin蛋白的表达较单纯pAN组和阴性质粒+pAN组均增加,差异有统计学意义(ppAN对足细胞的活力,mir-30c-2-3p含量及Nephrin和podocin蛋白的表达有抑制作用,而通过外源性增加mir-30c-2-3p表达后可提高足细胞的活力,同时可增加Nephrin和podocin蛋白的表达。

关键词： mir-30c-2-3p 足细胞嘌呤霉素细胞活性 Nephrin podocin

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mir-30c-2-3p靶向MpO介导高糖诱导的肾小球系膜细胞凋亡及炎性反应

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河北医药 2020年第16期42卷 2419-2423页

作者：张娟陈家斌陈龙彭沛余凤荣湖北省汉川市人民医院肾病内科 431600 湖北省汉川市人民医院内分泌科 431600 湖北省汉川市人民医院检验科 431600 湖北省汉川市人民医院心血管内科 431600

目的探讨mir-30c-2-3p对高糖诱导的肾小球系膜细胞凋亡及炎性反应的影响及其机制。方法用终浓度为30 mmol/L的高糖溶液刺激细胞作为高糖组(HG),同时以终浓度为5 mmol/L的糖溶液处理细胞作为对照组(NG);设置mir-Nc组、mir-30c-2-3p组、an... 详细信息

目的探讨mir-30c-2-3p对高糖诱导的肾小球系膜细胞凋亡及炎性反应的影响及其机制。方法用终浓度为30 mmol/L的高糖溶液刺激细胞作为高糖组(HG),同时以终浓度为5 mmol/L的糖溶液处理细胞作为对照组(NG);设置mir-Nc组、mir-30c-2-3p组、anti-mir-Nc组、anti-mir-30c-2-3p组、HG+mir-Nc组、HG+mir-30c-2-3p组、HG+mir-30c-2-3p+pcDNA3.1组、HG+mir-30c-2-3p+pcDNA3.1-MpO组,转染均采用脂质体法。qRT-pcR检测mir-30c-2-3p的表达水平;Western Blot检测蛋白表达;流式细胞术检测细胞凋亡;ELISA法检测TNF-α和IL-6的表达;双荧光素酶报告基因检测实验检测荧光活性。结果高糖可以抑制mir-30c-2-3p的表达(pmir-30c-2-3p表达可抑制高糖作用的细胞HMc凋亡,抑制IL-6、TNF-α的表达(pmir-30c-2-3p靶向调控MpO的表达,过表达MpO能逆转mir-30c-2-3p过表达对高糖作用的HMc细胞凋亡及IL-6、TNF-α表达的抑制作用(pmir-30c-2-3p能抑制高糖作用的HMc细胞凋亡,其机制主要是下调MpO及炎性因子IL-6、TNF-α的表达。可为糖尿病肾病的治疗提供新思路和新靶点。

关键词： mir-30c-2-3p MpO 高糖糖尿病肾病凋亡

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mir-30c-2-3p对足细胞Nephrin、podocin保护作用及雷公藤甲素干预作用研究

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中国中西医结合肾病杂志 2016年第11期17卷 952-955页

作者：朱彩凤陈琪朱斌李先法殷佳珍林宜朱晓玲浙江省杭州市中医院肾内科杭州310007 浙江省湖州市第一人民医院肾内科湖州313000

目的:探讨mir-30c-2-3p对小鼠足细胞Nephrin、podocin保护作用及雷公藤甲素(Tp)干预作用。方法:采用嘌呤霉素(pAN)致小鼠足细胞损伤的体外模型,将足细胞分成5组:空白组、转染阴性质粒组(阴性质粒组)、转染阴性质粒+pAN组(阴性质粒+pAN组... 详细信息

目的:探讨mir-30c-2-3p对小鼠足细胞Nephrin、podocin保护作用及雷公藤甲素(Tp)干预作用。方法:采用嘌呤霉素(pAN)致小鼠足细胞损伤的体外模型,将足细胞分成5组:空白组、转染阴性质粒组(阴性质粒组)、转染阴性质粒+pAN组(阴性质粒+pAN组)、转染mir-30c-2-3p+pAN组(阳性质粒+pAN组)、转染mir-30c-2-3p+pAN+Tp组(阳性质粒+pAN+Tp组)。瞬时转染mir-30c-2-3p mimics,质粒终浓度均为50 nmol/L,转染6 h后进行药物干预,pAN干预浓度均为45 mg/L,Tp干预浓度均为1 ng/ml,药物干预时间均为48 h。ccK-8法检测足细胞活力;实时荧光定量pcR检测细胞中mir-30c-2-3p表达;Western Blot检测足细胞Nephrin、podocin蛋白表达。结果:(1)阴性质粒+pAN组足细胞活力明显低于空白组及阴性质粒组(ppAN组较阴性质粒+pAN组足细胞活力提高(pp干预后其活力进一步提高(p2)与空白组、阴性质粒组比较,阴性质粒+pAN组mir-30c-2-3p表达减少,差异有统计学意义(ppAN组相比,阳性质粒+pAN组、阳性质粒+pAN+Tp组mir-30c-2-3p表达均增加(ppAN组相比,雷公藤甲素干预组未见统计学意义(p>0.05)。(3)与空白组及阴性质粒组比较,阴性质粒+pAN组Nephrin、podocin两者表达均减少,差异有统计学意义(ppAN组相比,阳性质粒+pAN组Nephrin、podocin蛋白表达增加(pp干预后两者表达进一步增加(ppAN能降低足细胞活力,降低mir-30c-2-3p表达,而增加其表达可以上调足细胞活力以及Nephrin、podocin的表达。Tp可以减轻pAN诱导的足细胞损伤以及Nephrin、podocin的表达下降,但其作用机制似乎与mir-30c-2-3p无关。

关键词：足细胞 mir-30c-2-3p 嘌呤霉素雷公藤甲素 Nephrin podocin

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血清mir-30c-2-3p与卵巢癌组织内质网应激相关蛋白表达及患者预后的相关性

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东南大学学报（医学版） 2022年第5期41卷 681-687页

作者：张纪妍曾赛田奚杰沧州市中心医院妇科河北沧州061000

目的:分析血清mir-30c-2-3p与卵巢癌(Oc)组织内质网应激(ERS)相关蛋白表达、患者临床特征及预后的关系。方法:招募2018年1月至2020年12月期间70例于我院接受治疗的Oc患者(Oc组),并纳入同期100例健康志愿者作为对照组。采用蛋白质印迹法... 详细信息

目的:分析血清mir-30c-2-3p与卵巢癌(Oc)组织内质网应激(ERS)相关蛋白表达、患者临床特征及预后的关系。方法:招募2018年1月至2020年12月期间70例于我院接受治疗的Oc患者(Oc组),并纳入同期100例健康志愿者作为对照组。采用蛋白质印迹法分析Oc组织c/EBp同源蛋白(cHOp)、葡萄糖调节蛋白78(BIp)的表达情况。使用定量实时聚合酶链反应检测血清mir-30c-2-3p表达。随访记录患者的无病生存期(DFS)。结果:Oc组患者基线血清mir-30c-2-3p表达显著低于对照组受试者(0.77±0.25 vs.1.15±0.39,t=7.869,pmir-30c-2-3p表达诊断Oc的曲线下面积为0.785(95%cI 0.718~0.852)。基线血清mir-30c-2-3p表达≤0.703的患者FIGO分期Ⅲ~Ⅳ期概率更大,肿瘤直径也更大(pmir-30c-2-3p表达水平与Oc组织cHOp表达呈正相关(r=0.483,pp表达呈显著负相关(r=-0.240,p=0.045)。经多元线性回归分析,Oc组织中cHOp(t=4.080,pp(t=-2.048,p=0.045)都是影响基线血清mir-30c-2-3p表达水平的独立因子。绘制Kaplan-Meier生存曲线,基线血清mir-30c-2-3p低表达Oc患者中位DFS显著短于高表达者(χ^(2)=7.515,p=0.006)。经多因素cOX回归分析显示,基线血清mir-30c-2-3p低表达为Oc患者术后复发的独立临床因素(OR=0.399,95%cI 0.201~0.791,p=0.009)。结论:血清mir-30c-2-3p在Oc患者中多呈低表达,并可能通过调节ERS影响患者预后。因此,血清mir-30c-2-3p表达对Oc患者术后复发具有预测价值。

关键词：卵巢癌 mir-30c-2-3p 内质网应激复发预后

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