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马立克病病毒meq单克隆抗体的制备

中国兽医科学 2016年第9期46卷 1073-1078页

作者：高俊娜张幸星连雪孙海伟郇文彬张训海 JUNG Yong-Sam 陈鸿军钱莺娟南京农业大学动物医学院江苏南京210095 安徽科技学院家禽疫病防控监测安徽省重点实验室安徽凤阳233100 中国农业科学院上海兽医研究所上海200241

为研制马立克病病毒RB1B超强毒株致瘤蛋白meq单克隆抗体,本研究通过聚合酶链式反应（PCR）扩增马立克病病毒（Md5）meq基因5′端第1~507位核苷酸,将其克隆入原核表达载体p Cold-TF,转化到BL21（DE3）感受态中,经异丙基硫代半乳糖苷（IPT... 详细信息

为研制马立克病病毒RB1B超强毒株致瘤蛋白meq单克隆抗体,本研究通过聚合酶链式反应（PCR）扩增马立克病病毒（Md5）meq基因5′端第1~507位核苷酸,将其克隆入原核表达载体p Cold-TF,转化到BL21（DE3）感受态中,经异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,对表达产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行检测。用融合蛋白His-meq169腹腔免疫BALB/c小鼠,利用间接免疫荧光（IFA）和Western-blot检测多抗血清;血清检测阳性后,取小鼠脾脏与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,利用IFA和有限稀释法筛选阳性单克隆杂交瘤细胞株,最后筛选出了4株阳性杂交瘤细胞株,即1C11、3E4、3G10和5H11。将获得的单抗经IFA方法检测强毒株Md5或弱毒株CVI988感染的CEF细胞,结果显示,meq单抗可特异性识别MDV感染形成的细胞空斑。这为进一步研究meq的生物学功能奠定了基础。

关键词：马立克病病毒 meq 原核表达单克隆抗体

miR-M7-5p靶向调控马立克病病毒原癌基因meq的表达

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畜牧兽医学报 2014年第9期45卷 1518-1525页

作者：赵朴滕蔓罗俊迟佳琦宿靖伟党露邓瑞广张改平西北农林科技大学动物医学院杨凌712100 河南省农业科学院农业部动物免疫学重点实验室河南省动物免疫学重点实验室郑州450002 河南科技学院动物科学学院新乡453003 河南农业大学牧医工程学院郑州450002

马立克病病毒(MDV)基因组编码数十个miRNA,并且可能在MDV的感染及致病过程中发挥重要作用。此前研究发现,MDV-1编码的miR-M7-5p在病毒感染宿主发病的过程中具有高水平表达特征,为探讨miR-M7-5p对MDV可能具有的自我调控作用,利用生物信... 详细信息

马立克病病毒(MDV)基因组编码数十个miRNA,并且可能在MDV的感染及致病过程中发挥重要作用。此前研究发现,MDV-1编码的miR-M7-5p在病毒感染宿主发病的过程中具有高水平表达特征,为探讨miR-M7-5p对MDV可能具有的自我调控作用,利用生物信息学方法对MDV编码的蛋白基因进行了扫描分析,预测发现了10个潜在的miR-M7-5p结合靶点,其中包括MDV的原癌基因meq。双荧光报告试验表明miR-M7-5p与meq基因的3′-UTR在体外能够相互作用,qRT-PCR进一步证实miR-M7-5p在体内能够下调meq基因mRNA的转录。结果表明,miR-M7-5p能够自我调控病毒原癌基因meq的表达,在MDV致瘤过程中可能发挥重要作用。

关键词：马立克病病毒 microRNA 自我调控原癌基因 meq

潜伏期马立克氏病病鸡血清型病毒L-meq、meq基因的比较及遗传分析

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中国兽医学报 2007年第1期27卷 43-45,50页

作者：潘风光郑梅竹邹亚学孙莹艾永兴崔文璟罗翔丹张玉静吉林大学军需科技学院吉林长春130062 吉林大学人兽共患病研究所吉林长春130062 吉林大学畜牧兽医学院吉林长春130062

从潜伏期感染马立克氏病病毒(MDV)鸡淋巴组织中提取基因组DNA,采用梯度PCR的方法获得MDV的L-meq、meq基因,将其插入pMD18-T克隆载体,经测序并进行了序列分析。结果表明,L-meq、meq基因同源性很高,L-meq中只有180bp与meq不同。但是采用... 详细信息

从潜伏期感染马立克氏病病毒(MDV)鸡淋巴组织中提取基因组DNA,采用梯度PCR的方法获得MDV的L-meq、meq基因,将其插入pMD18-T克隆载体,经测序并进行了序列分析。结果表明,L-meq、meq基因同源性很高,L-meq中只有180bp与meq不同。但是采用同样的方法在发病期病鸡淋巴组织中却只能获得MDV的meq基因。为了进一步研究发病期L-meq基因消失的原因,试验对L-meq、meq基因的氨基酸序列的结构域进行了分析。结果表明,L-meq基因中含有9个PRR(proline-rich-reapts)区域,meq中含有6个PRR区域,从而推断PRR区域可能与基因的转录激活及调控病毒DNA复制的功能有关,该180bp插入序列也许能解释初期感染MDV不致瘤的原因,同时也意味着L-meq基因对于潜伏期的维持是必要的。

关键词：马立克氏病病毒 L—mep meq PCR 鸡

meq基因增强RNA沉默的分子机制及其介导病毒抗性的研究

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Meq基因增强RNA沉默的分子机制及其介导病毒抗性的研究

作者：徐杰山东农业大学

学位级别：硕士

meq基因是马立克氏病病毒的主要致瘤基因,meq蛋白N端为碱性亮氨酸拉链结构域,C端为富含脯氨酸结构域,在马立克氏病病毒的增殖和致病中起重要作用。农杆菌瞬时侵染分析表明,meq能明显增强植物瞬时侵染介导的RNA沉默,而RNA沉默是植物抵抗... 详细信息

meq基因是马立克氏病病毒的主要致瘤基因,meq蛋白N端为碱性亮氨酸拉链结构域,C端为富含脯氨酸结构域,在马立克氏病病毒的增殖和致病中起重要作用。农杆菌瞬时侵染分析表明,meq能明显增强植物瞬时侵染介导的RNA沉默,而RNA沉默是植物抵抗病毒侵染的主要防御策略,对于meq沉默增强机制的研究,可以使我们了解RNA沉默途径及机制的更多细节,同时为利用沉默增强基因获得植物广谱病毒抗性提供依据。为了揭示meq增强RNA沉默的分子机制,针对亮氨酸拉链和转录激活结构域分别构建了缺失突变体和点突变体,分析沉默增强作用的关键位点和功能域;荧光定量PCR检测meq基因对沉默途径相关基因表达的影响,探讨其介入RNA沉默途径的可能方式;利用叶盘法和花序侵染法将meq基因分别转化烟草和拟南芥,接种病毒进行抗性分析。主要的研究结果如下：(1)meq基因能够显著增强瞬时侵染介导的局部和系统性RNA沉默。构建meq基因植物表达载体,转化农杆菌GV3101,以GFP转基因本生烟16c为材料,农杆菌瞬时侵染鉴定其对RNA沉默的影响,长波紫外灯下持续观察绿色荧光蛋白的表达。结果表明,侵染后第3d (3dpi), meq与GFP共侵染处理已无绿色荧光,而GFP单独侵染仍有较强绿色荧光,Northern blot检测表明,GFP mRNA的积累水平与观察结果一致,而meq与GFP共侵染区GFP siRNA的积累水平显著高于GFP基因的单独侵染。侵染15dpi, meq与GFP共侵染与GFP单独侵染相比,植株上部有更多新生叶片变红,GFP mRNA的积累水平更低,发生了更强的系统性RNA沉默。(2)meq蛋白包含399个氨基酸,1-117位为DNA结合结构域,118-399位为转录激活结构域,其中1-28位为富含Pro/Gln区,有与转录辅阻遏物CtBp互作的位点,28-78位包含2个富含碱性氨基酸残基的DNA结合区及核定位信号,79-117位为亮氨酸拉链区。突变分析表明,△1-28突变体不影响沉默增强功能,而△1-78突变体却丧失了沉默增强功能,说明28-78之间的DNA结合区对meq的沉默增强功能是必须的。△118-399的突变使meq沉默增强能力丧失,而△175-399突变和△302-399突变都未对沉默增强功能产生影响,说明meq的转录激活结构域中118-174是发挥RNA沉默增强功能的核心区。将meq亮氨酸拉链中的亮氨酸突变掉2个或3个(L92AL99A和L92AL99AL106A)时其沉默增强功能明显减弱,而仅有1个亮氨酸突变(L92A)不影响其沉默增强功能,这说明亮氨酸拉链结构对meq蛋白发挥作用非常关键。亚细胞定位分析表明,与GFP融合表达的meq主要分布于细胞核中,而沉默增强功能需要meq的DNA结合结构域和转录激活结构域共同起作用,因此推测,meq可能以转录因子的方式通过调控其它基因的表达发挥RNA沉默增强功能。(3)为了进一步了解meq影响沉默途径的方式,选取本生烟中20个已知的沉默途径相关基因,通过荧光定量PCR检测meq基因瞬时侵染对这些基因表达的影响。结果显示,在所检测的基因中,有7个表达量明显上调,AGO10和HEN1基因的表达上调最为明显,其次为MET1、NRPD2a、SGS3、AGOla和DRM3基因。其中HEN1、MET1、NRPD2a、SGS3和DRM3基因与DNA甲基化有关,其余2个基因属于AGO蛋白家族,是RNA沉默途径的重要蛋白,由此推测,meq基因可能通过影响AGO基因的表达介入RNA沉默途径,同时对DNA的甲基化有影响,但二者之间是否存在联系还需要进一步研究验证。(4)meq基因农杆菌介导法转化烟草和拟南芥,经卡那霉素抗性筛选PCR检测获得转基因株系若干。选取4个转基因烟草株系扩繁,分别接种黄瓜花叶病毒(CMV)、马铃薯X病毒(PVX)和马铃薯Y病毒(PVY)进行抗病性分析,ELISA检测和Northen blot结果表明,4个转基因烟草株系对CMV表现不同抗性,而对***无明显抗性,CMV的抗病程度与meq基因表达水平之间未见明显相关性。转基因拟南芥的抗病性分析还在进行中。

关键词： RNA沉默马立克氏病病毒 meq 农杆菌瞬时侵染基因突变分析病毒抗性分析

马立克氏病病毒致瘤蛋白meq及鸡ATM和Chk2单克隆抗体制备

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马立克氏病病毒致瘤蛋白Meq及鸡ATM和Chk2单克隆抗体制备

作者：高俊娜南京农业大学

学位级别：硕士

马立克氏病(Marek's Disease,MD)是由马立克氏病病毒(Marek's Disease Virus,MDV)引起的鸡的一种恶性淋巴组织增生性肿瘤疾病。自20世纪70年代在我国首次报道以来,给我国养禽业造成了巨大的经济损失。目前,疫苗的使用虽然基本控制了MD... 详细信息

马立克氏病(Marek's Disease,MD)是由马立克氏病病毒(Marek's Disease Virus,MDV)引起的鸡的一种恶性淋巴组织增生性肿瘤疾病。自20世纪70年代在我国首次报道以来,给我国养禽业造成了巨大的经济损失。目前,疫苗的使用虽然基本控制了MD的疫情,但由于MDV突变株毒力逐渐增强,可以突破疫苗的保护作用,导致鸡群中免疫失败的现象时有发生。因此,了解MDV的致瘤机理,研制更有效的疫苗或药物制剂是当前急需解决的问题。近年来,研究发现:DNA损伤应答(DNA damage response,DDR)信号通路几乎是所有人类致瘤病毒的共同作用靶点;MDV的关键致瘤蛋白meq能够与p53结合并抑制p53对下游靶基因的转录作用;由此可见,MDV感染伴有宿主细胞DDR通路的激活。因此,研究MDV调节宿主细胞DDR信号通路的分子机理,对于理解MDV的致病机理具有重要意义。但是,关于鸡源DDR信号通路的研究较少,目前尚不存在商品化的抗体用于检测MDV的关键致瘤蛋白meq及鸡DDR信号通路上的关键蛋白ATM和Chk2。因此,本研究主要致力于制备能特异性识别meq、鸡ATM和Chk2单克隆抗体,为进一步研究MDV调节宿主细胞DDR信号通路的分子机理提供重要的生物材料。主要包括以下三部分内容:***致瘤蛋白meq单克隆抗体制备选取马立克氏病毒(MDV)RB1B株的meq蛋白N端1-169位和C端272-340位氨基酸,构建原核表达质粒pCold-TF-meq169和pGEX-4T-1-MeeqC,在BL21(DE3)细菌中经IPTG诱导表达,表达产物经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行分析,并免疫Balb/c小鼠,利用IFA及WB检测多抗血清;血清检测阳性后,取小鼠脾脏与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,利用IFA和有限稀释法筛选阳性单克隆杂交瘤细胞株,结果:meq169单抗筛选出了 4株阳性杂交瘤细胞株,即1C11、3E4、3G10和5H11。通过IFA将获得的单抗用于检测强毒株Md5或弱毒株CVI988感染的CEF细胞,结果显示,meq169单抗与MDV感染形成的细胞病变呈阳性反应;meqC单抗筛选出了 10株具有IFA反应性的阳性杂交瘤细胞株,即1B5、1E10、2C11、2C12、2E10、2G9、3B7、3E8、3F11 和4B8;其中,2C12 还具有 WB 反应性。2.鸡ATM单克隆抗体制备通过对鸡ATM氨基酸序列的抗原性分析,选取C端2993-3050位氨基酸,常规PCR扩增相应的核苷酸序列,克隆入原核表达载体pGEX-4T-1,构建原核表达质粒pGEX-4T-1-ATMC,转化入Rosetta感受态经IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE对表达产物进行分离鉴定,证实了重组ATMC蛋白可得到有效表达;表达产物免疫Balb/c小鼠,将转染重组真核表达质粒pcDNA3-ATMC的293T作为检测源,利用IFA检测多抗血清,结果显示多抗血清具有良好的荧光效价;取阳性小鼠脾脏与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,利用IFA筛选阳性杂交瘤细胞株,最后筛选出了 12株具有IFA反应性的阳性杂交瘤细胞株,即 1F3、2B10、2H8、3G3、3G12、4A10、4B4、4B11、4C7、4D3、4D5及4E9;其中,2B10还具有WB反应性。3.鸡Chk2单克隆抗体制备通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增鸡chk2基因,将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-3中,构建原核表达质粒pGEX-4T-3-Chk2,将重组原核表达质粒转化入BL21(DE3)感受态细胞经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,利用SDS-PAGE对表达产物进行检测,证实重组Chk2蛋白得到了高效表达,且主要以包涵体的形式存在;表达产物免疫Balb/c小鼠,利用间接免疫荧光(IFA)和免疫印迹(WB)检测多抗血清,结果显示多抗血清具有良好的IFA效价和WB效价;利用杂交瘤技术筛选获得了 9株能分泌特异性识别鸡Chk2抗体的阳性杂交瘤细胞株,并将2G1C9接种小鼠腹腔获得效价更高的腹水单抗。

关键词：马立克氏病病毒 meq DNA损伤应答鸡ATM 鸡Chk2 单克隆抗体

马立克病毒单克隆抗体的制备及meq蛋白的表达纯化鉴定

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马立克病毒单克隆抗体的制备及MEQ蛋白的表达纯化鉴定

作者：宋利娜河南农业大学

学位级别：硕士

马立克病(Marek's Disease,MD)是由马立克病病毒(Marek's DiseaseVirus,MDV)感染鸡引起的一种高度接触性、传染性、淋巴组织增生性疾病,MD可引起免疫抑制并增加其他疾病易感性,给世界家禽业造成了巨大的经济损失。MDV主要以直径约85～10... 详细信息

马立克病(Marek's Disease,MD)是由马立克病病毒(Marek's DiseaseVirus,MDV)感染鸡引起的一种高度接触性、传染性、淋巴组织增生性疾病,MD可引起免疫抑制并增加其他疾病易感性,给世界家禽业造成了巨大的经济损失。MDV主要以直径约85～100 nm的六角形无囊膜裸病毒粒子存在于细胞中,是具有严格地细胞结合性的α疱疹病毒,完整的病毒粒子具有囊膜,径约为273～400nm,不具有细胞结合性,可脱离细胞独立生存,这是该病持续传播并爆发的主要原因。本研究通过纯化鸡胚成纤维细胞(CEF)培养的MDV超强毒株GX0101作为免疫原,制备特异识别MDV的单克隆抗体。GX0101感染CEF,96h后收集细胞,10mLPBS重悬,反复冻融3次,选用100kD的切向流超滤离心管浓缩得到峰尖病毒浓缩液至5mL,病毒浓缩液经0.22μL滤膜过滤后,通过Sepharose 4 Fast Flow(4FF)凝胶作为层析介质分离纯化病毒粒子,聚合酶链式反应(PCR)和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析不同收集峰MDV病毒含量,并经过透射电子显微镜(TEM)观察到直径约100nm的MDV裸病毒粒子。进一步选用100kD的切向流超滤离心管浓缩得到峰尖病毒浓缩液,以此免疫Balb/c雌性小鼠制备单克隆抗体。通过免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)和Western blot筛选,最终获得107株阳性克隆,其中1株强阳性单抗杂交瘤细胞株10B2制备的单抗腹水IPMA效价为1:2.56×10～6。本研究结果为后续MDV单抗的筛选、鉴定、制备及诊断试剂研发奠定了重要基础。meq蛋白作为MDV最有研究价值的致癌蛋白,在MDV致癌机制研究中至关重要,本研究通过pET-30a载体表达meq蛋白,Rosetta菌体中表达meq蛋白,最终蛋白多在上清中为可溶性表达,采用镍柱亲和层析纯化后,最终得到meq蛋白,为meq单抗的制备奠定了基础。

关键词：马立克病 MDV meq 单克隆抗体 IPMA

鸡马立克病发病与meq、pp38、PRNP、SPRN、akt基因表达量之间的相关性研究

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鸡马立克病发病与meq、pp38、PRNP、SPRN、akt基因表达量之间的相...

作者：刘桂林甘肃农业大学

学位级别：硕士

【目的】为探明meq、pp38、PRNP、SPRN、akt在MD鸡体内的表达规律以及与鸡马立克病发病之间的关系,本研究拟用MDV-MD5毒株复制鸡MD肿瘤病例,通过Real-time PCR对meq、pp38、PRNP、SPRN和akt基因m RNA水平的相对转录量进行检测,分析攻毒... 详细信息

【目的】为探明meq、pp38、PRNP、SPRN、akt在MD鸡体内的表达规律以及与鸡马立克病发病之间的关系,本研究拟用MDV-MD5毒株复制鸡MD肿瘤病例,通过Real-time PCR对meq、pp38、PRNP、SPRN和akt基因m RNA水平的相对转录量进行检测,分析攻毒鸡各组织中的表达变化规律,探讨上述基因表达量与MDV感染以及与MD肿瘤形成、发生、发展之间的相关性,为进一步研究它们在肿瘤发病学中的作用提供理论依据。【方法】(1)通过琼脂扩散、分子生物学以及蚀斑试验对MDV-MD5毒株进行鉴定,以人工攻毒建立鸡MD肿瘤病例,从攻毒60d开始,每隔30d剖检感染阳性鸡和对照鸡,150d全部扑杀,记录感染率、死亡率和致瘤率。(2)通过病理组织学观察,将150d的感染鸡分成肿瘤病变鸡、无肿瘤病变鸡和阴性对照鸡。(3)每个实验组随机选取3只,无菌采集14个组织样品,提取各样品总RNA并反转录,以c DNA为模板进行meq、pp38、PRNP、SPRN、akt和β-actin的Real-time PCR,分析3个实验组鸡14个不同组织样品间各基因在m RNA水平的相对转录差异。【结果】(1)经琼脂扩散、RT-PCR扩增meq和pp38以及蚀斑试验鉴定MD5毒株为阳性,TCID50=10-5.6363/0.1m L,以MD5株复制内脏型MD肿瘤病例。30d后经RT-PCR检测,感染率为85.42%,攻毒60d后出现死亡,90d剖检肉眼最早发现肿瘤,肿瘤发生率为17.07%,死亡率为24.39%,肿瘤多见于肝脏、脾脏和肾脏。(2)MD有肿瘤病变鸡的多个内脏有肿瘤病变,表面和切面有大小不等、质地坚硬的灰白色结节,镜下正常组织结构被破坏,有大量的淋巴细胞浸润。MD无肿瘤病变鸡和阴性对照鸡未见明显的病理组织学变化。(3)3个实验组中14个组织样品meq、pp38、PRNP、SPRN和akt的m RNA转录水平,meq仅在MDV攻毒鸡中表达,阴性对照鸡中不表达。除心脏和卵巢外,其余12个肿瘤病变组织meq的表达量均高于无病变组织;肿瘤病变鸡眼睑、卵巢和胰腺pp38表达量与无病变鸡相比差异不显著(P>0.05),其余11个肿瘤病变组织pp38的表达量均高于无肿瘤病变鸡;除肌胃和肠外,其余12个肿瘤病变组织PRNP的表达量均高于无病变鸡和对照鸡,脾脏和肾脏的表达差异最高。无肿瘤病变鸡14个组织相对于对照鸡表达差异不显著(P>0.05);SPRN在肌胃中不表达,腺胃、肠和眼睑中微量表达。除皮肤和坐骨神经,肿瘤病变鸡其余8个组织SPRN的表达量均高于对照鸡。无肿瘤病变鸡14个组织SPRN的表达量与对照鸡相比差异不显著(P>0.05);肿瘤病变鸡肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑和皮肤相比于对照鸡akt表达量差异显著(P0.05)。无肿瘤病变鸡14个组织akt的表达量与对照鸡相比差异不显著(P>0.05)。MD肿瘤组织肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和皮肤中,meq、pp38、PRNP、akt同时过表达,而除肺脏外,SPRN的表达量无明显变化。【结论】(1)本试验成功复制出鸡MD肿瘤病例。(2)Real-time PCR检测发现,MDV标志性基因meq和pp38在MD肿瘤病变鸡中显著表达,meq表达量与肿瘤的形成相关,pp38表达量与肿瘤的形成不相关。(3)PRNP表达量与MDV感染相关联,PRNP在MDV攻毒鸡组织中过表达。PRNP的差异表达与肿瘤组织病变程度呈正相关,肿瘤组织病变越严重,PRNP表达量的上调幅度越大;(4)SPRN在鸡组织中的表达量与MDV感染以及MD肿瘤的形成均不相关,且与PRNP的表达量也不相关;(5)MDV感染不引起akt表达量上调,akt在MD肿瘤组织中过表达。(6)meq、pp38、PRNP、akt在MD肿瘤组织中同时过表达,而SPRN的表达量无明显变化。

关键词：鸡马立克病 meq pp38 PRNP SPRN akt

鸡马立克病病毒meq蛋白抑制p53的转录激活作用

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微生物与感染 2008年第1期3卷 21-24页

作者：李向东沈阳邱亚峰马志永中国农业科学院上海兽医研究所兽医公共卫生研究室上海200232

目的构建鸡马立克病病毒野生型meq基因(meq-wt)和p53结合区域缺失的突变型meq基因(meq-mut)表达质粒,研究meq蛋白对p53转录激活功能的影响,为进一步了解其生物学功能奠定基础。方法采用聚合酶链反应(PCR)方法克隆鸡马立克病病毒meq-wt基... 详细信息

目的构建鸡马立克病病毒野生型meq基因(meq-wt)和p53结合区域缺失的突变型meq基因(meq-mut)表达质粒,研究meq蛋白对p53转录激活功能的影响,为进一步了解其生物学功能奠定基础。方法采用聚合酶链反应(PCR)方法克隆鸡马立克病病毒meq-wt基因,并采用突变PCR方法缺失meq与p53结合区域,分别构建了meq-wt和meq-mut基因表达质粒。转染鸡胚成纤维细胞(CEF)后,用Western印迹法检测meq蛋白的表达,利用荧光素酶报告基因系统证实meq蛋白对p53转录激活的抑制作用。同时借助免疫荧光技术,采用荧光显微镜观察meq蛋白与p53蛋白在细胞中的定位。结果DNA序列测序表明克隆的meq-wt、meq-mut基因插入位点和核苷酸序列完全正确。荧光素酶报告基因系统证实meq蛋白对p53转录激活具有明显的抑制作用。间接免疫荧光试验证实野生型meq蛋白主要在胞质中表达,而缺失与p53结合区域的突变型meq在胞质/胞核中均有表达。野生型meq蛋白与内源性p53蛋白在胞核内能够很好地重合。结论meq蛋白对p53的转录激活具有抑制作用,可能是通过直接与p53相互结合,来抑制对p53的转录活性。

关键词：马立克病病毒 meq p53 转录激活

马立克氏病病毒meq蛋白单克隆抗体的制备及应用研究

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广西大学学报（自然科学版） 2002年第1期27卷 5-9页

作者：韦平崔治中龙进学金文杰刘岳龙广西大学动物科技学院广西南宁530005 山东农业大学泰安271018 扬州大学扬州225009

基因表达与病毒感染细胞及致瘤能力之间关系的阐明 ,将有助于我们对马立克氏病病毒 (MDV) meq基因功能的了解 .该研究利用通过杆状病毒载体在昆虫细胞系 SF9上高度表达的 meq蛋白免疫 BALB/ c小鼠 ,然后收获其免疫脾细胞与肿瘤细胞系 SP... 详细信息

基因表达与病毒感染细胞及致瘤能力之间关系的阐明 ,将有助于我们对马立克氏病病毒 (MDV) meq基因功能的了解 .该研究利用通过杆状病毒载体在昆虫细胞系 SF9上高度表达的 meq蛋白免疫 BALB/ c小鼠 ,然后收获其免疫脾细胞与肿瘤细胞系 SP2 / 0通过 PEG于体外融合 .获得的杂交瘤细胞被克隆并通过与MDV感染的鸡胚成纤维细胞 (CEF)做免疫荧光试验 (FA) ,进行其分泌抗 meq单克隆抗体 (Mc Ab)能力的筛选 .获得 4株稳定产生抗 meq蛋白 Mc Ab的杂交瘤细胞 ,其中 3 G1 2 E6通过 FA和免疫酶组化技术能够检测到 MDV致瘤株感染的 CEF及自然 MD肿瘤细胞中表达的 meq基因产物 .研究的结果首次发现 ,MDV致瘤株 GA、RB1 B感染的 CEF及自然 MD肿瘤细胞中均有 meq基因的表达 ,但在弱毒疫苗株 CVI988感染的 CEF和免疫鸡组织细胞中则未检测到 meq.作者认为这是由于 meq基因在致瘤株中表达水平高 ,而在非致瘤株中表达水平低所致 ,这可能是决定 MDV毒力 (virulence)或致瘤性(oncogenicity)的关键因素之一 .

关键词：马立克氏病病毒 meq 蛋白单克隆抗体制备应用研究功能分析免疫酶组化技术鸡疾病基因表达