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men1/menin经PPARγ通路调控脂肪肝脂肪代谢的分子机制解析

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MEN1/menin经PPARγ通路调控脂肪肝脂肪代谢的分子机制解析

作者：李冉冉山东农业大学

学位级别：硕士

近年来,我国奶业发展迅速,但同时也有许多问题等待解决,奶牛围产期非酒精性脂肪肝病就是影响奶业发展的一个关键问题。患病奶牛容易出现乳房炎,酮病等,而且越高产奶牛患病的几率越大,这对于奶牛的机体健康和奶源质量的把控是个至关重要... 详细信息

近年来,我国奶业发展迅速,但同时也有许多问题等待解决,奶牛围产期非酒精性脂肪肝病就是影响奶业发展的一个关键问题。患病奶牛容易出现乳房炎,酮病等,而且越高产奶牛患病的几率越大,这对于奶牛的机体健康和奶源质量的把控是个至关重要的因素。国内外研究表明,men1对与奶牛肝脏TG的积累有着至关重要的作用,men1基因是多发性内分泌肿瘤1型综合征（multiple endocrine neoplasia type 1,men1）的关键致病基因,其表达产物menin是细胞内重要的转录因子和结构性衔接蛋白,它能够参与细胞内多种生物学过程,调控细胞的代谢。1、为了探究men1和其编码的蛋白menin与非酒精性脂肪肝的关系,我们用Q-PCR技术检测了奶牛肝组织中men1的m RNA的表达量变化,在奶牛肝脏组织中我们发现患脂肪肝病的奶牛men1的m RNA表达量显著（P＜0.05）升高。2、在已知PPARγ通路对脂肪肝发生有作用的前提下,我们检测了奶牛肝组织中,menin与PPARγ蛋白的互作情况和PPARγ下游脂肪肝相关基因的表达水平,结果显示,在奶牛肝组织中menin与PPARγ蛋白存在互作,且PPARγ通路中PPARγ（P＜0.05）、FABP5（P＜0.05）、CPT-1（P＜0.05）显著上调,其他脂代谢基因也有上调趋势。3、为了验证men1/menin对PPARγ通路下游基因的影响,我们在小鼠的肝细胞中构建men1过表达、低表达模型,检测发现men1过表达系统中Fabp3（P＜0.01）、Fabp4（P＜0.05）、Fabp5（P＜0.05）、Cd36（P＜0.05）的表达量显著下调。4、men1低表达系统中Fabp3（P＜0.05）、Fabp4（P＜0.05）显著高表达,由此得出,men1对PPARγ通路中Fabp3、Fabp4、Fabp5的表达有抑制作用。5、为探索menin经PPARγ调控FABP3、FABP4、FABP5基因表达的分子机制,我们在奶牛肝组织中Ch IP检测menin与FABP3、FABP4、FABP5的启动子是否结合,结果显示menin可以跟FABP3、FABP4、FABP5基因的启动子相结合,且根据结合量的差异,我们得到在患脂肪肝的奶牛肝组织中menin与之结合量降低。6、在正常小鼠的肝细胞中我们也检测到menin与Fabp3、Fabp4、Fabp5的启动子结合,在men1过表达、低表达系统中发现,men1过表达系统相比men1低表达系统,menin与Fabp3、Fabp4、Fabp5的启动子结合量有上调趋势,这个结果说明menin可以通过与Fabp3、Fabp4、Fabp5基因启动子的结合量的变化来调控基因的转录水平。7、SIRT1作为机体重要的能量调控蛋白,同时也是重要的蛋白去乙酰化修饰酶,我们在奶牛肝组织和小鼠的肝细胞中Co IP检测到menin可以与SIRT1蛋白互作。为了探索menin通过与基因启动子结合来影响其转录的分子机制,我们在小鼠肝细胞中检测SIRT1与PPARγ下游基因Fabp4基因启动子的结合情况,发现SIRT1可以结合到menin与Fabp4启动子结合的同一片段。故我们猜测menin可能同时募集SIRT1和PPARγ进而协同靶向调控靶基因Fabp3、Fabp4、Fabp5的转录水平,以此来调控肝细胞中脂质的沉积。综上,我们发现men1基因编码的蛋白menin能够作为媒介蛋白通过与SIRT1蛋白协同作用,经PPARγ蛋白结合到FABP3、FABP4、FABP5基因的启动子上,进一步调控其基因的转录,从而影响肝细胞中脂质的代谢和奶牛肝脏脂肪肝的发生。该研究对于我们揭示围产期奶牛发生脂肪肝的分子病理机制具有开创性意义。同时,该研究为寻找治疗脂肪肝的药物靶标提供重要的理论指导。

关键词： men1/menin 奶牛脂肪肝非酒精性脂肪肝(NAFLD) PPARγ通路脂肪沉积 SIRT1 乙酰化修饰

men1基因调控小鼠肝细胞的脂质代谢和炎症反应

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Men1基因调控小鼠肝细胞的脂质代谢和炎症反应

作者：杜红霞山东农业大学

学位级别：硕士

在奶牛业,脂肪肝的自然发病率普遍较高,给奶牛生产带来很大的经济损失,预防及治疗脂肪肝便成为了育种工作者的目标。有研究表明,menin是调节肝脏脂质代谢的关键因子,可以直接或者与其它因子互作间接的参与肝脏的脂质代谢。men1(multiple... 详细信息

在奶牛业,脂肪肝的自然发病率普遍较高,给奶牛生产带来很大的经济损失,预防及治疗脂肪肝便成为了育种工作者的目标。有研究表明,menin是调节肝脏脂质代谢的关键因子,可以直接或者与其它因子互作间接的参与肝脏的脂质代谢。men1(multiple endocrine neoplasia type 1)基因,是多发性内分泌肿瘤1型综合征的关键致病基因,其表达的蛋白便是menin,不仅可以与大量关键转录因子相互作用,也可与大量的细胞内信号通路因子相互作用,广泛参与机体的代谢调节。有研究表明,menin半合子缺失的小鼠表现出体重增加,激素水平增加,如胰岛素和胰高血糖素血清激素水平的增加,肝脏中的甘油三酯增加,脂肪发生变性,同时也表现出代谢相关基因的增加,如解偶联蛋白2(Ucp2),过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1(Pgc-1α)和葡萄糖激酶(GK)。本研究拟以men1基因作为肝脏代谢重要候选基因,研究其在小鼠肝脏代谢过程中发挥的作用,尤其是在脂代谢、糖代谢、胰岛素应答、炎症反应过程中的调控作用。PI3K/Akt、AMPK和NF-κB信号通路是调节糖代谢、脂代谢、炎症反应的重要信号途径,研究men1基因对其信号通路内因子的调控作用对于研究该基因对奶牛肝脏代谢的调控作用具有重要意义。因此,本研究以小鼠的正常肝脏细胞系NCTC-1469为模型,成功构建了pcDNA3.1-Myc-His-mmen1重组质粒,并瞬时转染使men1基因过表达;应用RNAi的方法,转染细胞使men1基因低表达,随后采用qRT-PCR技术,在mRNA水平上检测men1基因的表达变化,并将RNA样品进行转录组测序,随后用胰岛素、葡萄糖处理小鼠肝细胞,验证并研究men1对于脂质代谢、炎症反应的调节功能。研究结果表明:(1)构建的pcDNA3.1-Myc-His-mmen1重组质粒在NCTC-1469细胞内成功表达,并发现在转染24h后men1基因在mRNA水平上的表达量极显著提高(Pmen-2,发现在转染48h后men1基因mRNA水平上的表达量极显著降低(Pmen1过表达导致32个差异表达基因上调,men1低表达导致157个差异表达的基因变化,其中上调基因为51个(包含5个新基因),下调基因为106个(包含两个新基因),同时通过GO分析和KEGG分析,筛选到胰岛素相关信号通路、糖代谢、脂肪酸代谢通路、炎症通路等,同时还筛选到了一些互作蛋白。(3)在6μg/mL胰岛素、35mmol/L的葡萄糖分别处理8h、48h下,检测发现两者均可下调men1基因的表达(Pmen1基因参与葡萄糖及胰岛素介导的脂质合成和炎症反应。随后检测转录组测序的数据中筛选的与脂代谢、糖代谢、胰岛素反应、炎症等相关的因子的mRNA水平的表达量,结果显示:添加葡萄糖及胰岛素可上调包括Pgc-1α、Srebp-1c、Fas、Acc1、及Akt在内的与脂质合成相关的基因在mRNA水平的表达。同时降低Ampk、Nf-κb、Il-1b、Tnf-α炎症通路基因的mRNA水平的表达。综上所述,men1基因可经PI3K/Akt信号通路、AMPK信号通路和NF-κB信号通路调控小鼠肝细胞的脂肪代谢和炎症反应,证明menin是调节肝脏脂质代谢的关键因子,这为进一步研究men1/menin在其他物种脂肪代谢中的调节功能奠定基础。

关键词：小鼠 men1/menin 调控脂质代谢炎症反应

miR-24-3p与men1基因协同调控奶牛乳腺上皮细胞的增殖及乳蛋白合成

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miR-24-3p与MEN1基因协同调控奶牛乳腺上皮细胞的增殖及乳蛋白合成

作者：曹巧巧山东农业大学

学位级别：硕士

研究奶牛乳腺发育,提高奶牛的产奶量及乳品质是奶牛遗传育种工作的重中之重。本实验室前期的研究表明men1/menin的表达水平对于奶牛乳腺上皮细胞的增殖、乳蛋白的合成具有重要的调控功能,但调节men1/menin表达的上游调节因素目前尚未知... 详细信息

研究奶牛乳腺发育,提高奶牛的产奶量及乳品质是奶牛遗传育种工作的重中之重。本实验室前期的研究表明men1/menin的表达水平对于奶牛乳腺上皮细胞的增殖、乳蛋白的合成具有重要的调控功能,但调节men1/menin表达的上游调节因素目前尚未知。软件预测bta-miR-24-3p可以与men1的3’UTR互作进而调节其表达水平。本研究旨在研究bta-miR-24-3p是否对于men1的表达存在调节作用,并解析其在乳腺上皮细胞中的功能。本研究利用脂质体转染技术在细胞水平检测miRNA表达变化对奶牛乳腺上皮细胞的增殖及乳蛋白合成的影响;调控乳蛋白合成的两条重要信号途径是PI3K/AKT/mTOR和JAK2/STAT5信号通路,研究miRNA对两条信号通路的调控对研究奶牛乳腺内乳蛋白的合成有重要意义。主要研究结果如下:(1)Target Scan 6.2和RNAhybrid 2.2两种软件筛选出调控men1基因表达的bta-miR-24-3p,MAC-T中重组质粒pMIR-REPORT-bmen1-3’UTR与bta-miR-24-3p mimics/inhibitor进行共转染,发现bta-miR-24-3p能够特异靶向men1基因mRNA的3’UTR。(2)瞬时转染bta-miR-24-3p mimics/inhibitor发现二者均在转染后24h表达效果最好,并且能够负向调控men1基因的表达;瞬时转染重组质粒pEGFP-C2-bmen1及siRNA发现men1基因能够正向调控bta-miR-24-3p的表达。(3)细胞计数及CCK-8检测细胞增殖,发现bta-miR-24-3p mimics能够促进MAC-T细胞增殖,但bta-miR-24-3p inhibitor无显著影响;流式细胞术检测细胞周期,发现bta-miR-24-3p mimics能够促进MAC-T细胞周期由C/G期向S期进行,qRT-PCR检测细胞周期因子发现CyclinD1、CDK6显著升高(P1),CDK4(P1)、p27(P18无明显变化。bta-mi R-24-3p inhibitor对细胞周期无显著影响,qRT-PCR检测细胞周期因子发现CyclinD1(P1)显著降低,CDK4、p18、p27无明显变化(P>0.05)。(4)qRT-PCR检测发现,bta-miR-24-3p mimics可在mRNA水平显著降低包括AKT(P1)、mTOR(P1)、4E-BP1(P1)在内的与乳蛋白合成相关基因的表达,并能降低CSNK(Pmen1基因;bta-miR-24-3p能够负向调控men1基因的表达,而men1基因对bta-miR-24-3p进行正向调控;bta-miR-24-3p能够促进MAC-T细胞增殖,并能促进细胞周期由G/G期向S期进行;此外bta-miR-24-3p可负向调控包括PI3K/AKT/mTOR信号通路及JAK2/STAT5信号通路在内的与乳蛋白合成相关因子的表达,进而负向调控奶牛乳腺上皮细胞内乳蛋白的合成。

关键词： bta-miR-24-3p men1/menin 奶牛细胞增殖乳蛋白合成

men1基因参与调控奶牛乳腺上皮细胞内乳蛋白的合成

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MEN1基因参与调控奶牛乳腺上皮细胞内乳蛋白的合成

作者：李洪辉山东农业大学

学位级别：硕士

改善奶牛的泌乳性能,提高奶牛的泌乳产量,一直以来都是奶牛遗传育种工作者的目标。有研究表明,men1基因可以通过影响垂体的功能、抑制催乳素启动子活性、催化ERα激活等方面,而对乳腺发育和性能的改善发挥重要的调节功能。men1(multiple... 详细信息

改善奶牛的泌乳性能,提高奶牛的泌乳产量,一直以来都是奶牛遗传育种工作者的目标。有研究表明,men1基因可以通过影响垂体的功能、抑制催乳素启动子活性、催化ERα激活等方面,而对乳腺发育和性能的改善发挥重要的调节功能。men1(multiple endocrine neoplasia type 1)基因,是多发性内分泌肿瘤1型综合征的关键致病基因,其表达的蛋白menin不仅可以与大量关键转录因子相互作用,通过表观遗传方式调控其靶基因的转录和细胞表型,也可与大量的细胞内信号通路因子相互作用,广泛参与机体正常发育和代谢的平衡稳态调节。本研究拟以men1基因作为奶牛泌乳重要候选基因,研究其在奶牛乳腺泌乳过程,尤其是在乳蛋白合成过程中的调控作用。PI3K/Akt/mTOR和JAK2-STAT5信号通路作为乳腺中调节乳蛋白合成的重要信号途径,研究men1基因对其信号通路内因子的调控作用对于研究该基因对乳蛋白合成的调控具有重要意义。因此,本研究以奶牛乳腺上皮细胞系MAC-T为模型,构建及瞬时转染重组质粒pEGFP-C2-bmen1,进行men1基因过表达实验;应用RNAi的方法瞬时转染细胞后,进行men1基因表达抑制实验。后采用qRT-PCR、Western blot技术,在mRNA水平及蛋白水平检测与乳蛋白合成相关信号通路基因的表达变化,在mRNA水平检测主要酪蛋白之一κ-酪蛋白基因CSNK的表达变化;同时,选取干奶期及泌乳峰期的奶牛乳腺组织,qRT-PCR技术检测不同泌乳时期乳腺组织内men1基因及乳蛋白合成相关信号通路基因在mRNA水平的表达关系。通过体外试验和体内验证的联合,寻求men1基因的表达对奶牛乳腺内乳蛋白合成的调控关系,从而为奶牛乳腺泌乳调节机制的研究提供一定的理论基础,为遗传改良奶牛乳品质和乳产量奠定理论基础。研究结果表明:(1)构建的重组质粒pEGFP-C2-bmen1在MAC-T细胞内成功表达,并在转染24h后检测发现men1基因在mRNA及蛋白水平的表达量均极显著提高(P1);(2)qRT-PCR检测发现,men1基因的过表达可在mRNA水平显著降低包括Akt、mTOR、S6K1、4E-BP1及STAT5在内的与乳蛋白合成相关基因的表达(P1);Western Blot检测发现men1基因过表达也同时有下调包括Akt、mTOR、S6K1在内的蛋白表达(P>0.05)的趋势;而men1基因低表达则表现出相反的调节作用。(3)在men1基因过表达条件下检测发现,作为主要酪蛋白亚型之一的κ-酪蛋白基因CSNK在mRNA水平表达显著降低(Pmen1基因的低表达则能显著上调CSNK基因在mRNA水平的表达(P1)。(4)在体内奶牛乳腺组织的研究结果显示,泌乳高峰期乳腺组织内men1基因的表达量低于干奶期乳腺组织内的表达;而与干奶期相比,泌乳高峰期的乳腺组织在mRNA水平不仅存在较高水平的酪蛋白基因表达,包括CSNB(P>0.05)、CSNAS1、CSNAS2、CSNK(P1、4E-BP1及STAT5(P>0.05)的表达,这与我们在奶牛乳腺上皮细胞中所研究的结果相一致。综上所述,men1基因可通过负向调控包括PI3K/Akt/mTOR信号通路及JAK2-STAT5信号通路在内的与乳蛋白合成相关因子的表达,进而参与负向调控奶牛乳腺上皮细胞内乳蛋白的合成。

关键词： MAC-T细胞系 men1/menin 乳蛋白合成