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Molecular Cloning and Expression Analysis of a Hexokinase Gene,mdhxk1 in Apple

Horticultural Plant Journal 2016年第2期2卷 67-74页

作者： ZHAO Jin SUN Meihong HU Dagang HAO Yujin State Key Laboratory of Crop Biology MOA Key Laboratory of Horticultural Crop Biology(Huanghuai Region) and Germplasm Innovation College of Horticulture Science and Engineering Shandong Agricultural University

A hexokinase gene named mdhxk1(MDP0000309677) was cloned from ‘Gala' apple(Malus × domestica Borkh.). Sequence analysis showed that the mdhxk1 gene was 1 497 bp long and encoded 499 amino acids. The predicted molecular mass of this protein was 54.05 kD, and the pI was 5.76. A phylogenetic tree indicated apple mdhxk1 exhibited the highest sequence similarity to Pyrus bretschneideri PbHXK1. Analysis of the functional domain showed that the mdhxk1 protein included two conserved kinase domains. The prediction of subcellular localization suggested that the mdhxk1 protein was mainly localized in the cytoplasm. There was an indication that mdhxk1 existed as one copy in the apple genome by Southern blotting. Silico analysis suggested that the promoter sequence contained several typical cis-acting elements, including defense, sugar signaling and phytohormone responsive elements. Quantitative real-time PCR analysis demonstrated that the mdhxk1 gene was mainly expressed in stem and flower tissues. During the development of apple fruits, the expression of the mdhxk1 gene initially increased and then decreased. The changes on Glc phosphorylation relative activity and glucose concentration showed the same trend. In addition, the expression of this gene was induced by salt stress, low temperature, and abscisic acid(ABA). Finally, we obtained and purified the fused mdhxk1 protein by recombinant prokaryotic expression. Studies have demonstrated that mdhxk1 may participate in sugar metabolism in apple fruits. Enzyme encoded by mdhxk1 is a key factor in the mediation of sugar accumulation. Recently,researchers on hexokinase at home and abroad mainly focused on model plants, such as Arabidopsis, tobacco and rice, but orchard fruit like apple were underresearched. Our research established the foundation for the further study of the functions of mdhxk1.

关键词： apple hexokinase mdhxk1 molecular clone expression analysis prokaryotic expression

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苹果己糖激酶基因mdhxk1的克隆、表达分析与功能鉴定

苹果己糖激酶基因MdHXK1的克隆、表达分析与功能鉴定

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作者：赵锦山东农业大学

学位级别：硕士

本研究以‘嘎拉’苹果(Malus×domestica Borkh.)为研究材料,通过克隆获得了苹果己糖激酶基因mdhxk1,并对其进行了生物信息学和Southern blotting分析,利用qRT-PCR技术对其在不同组织、生长期和逆境条件下的表达水平,以及果实发育不同... 详细信息

本研究以‘嘎拉’苹果(Malus×domestica Borkh.)为研究材料,通过克隆获得了苹果己糖激酶基因mdhxk1,并对其进行了生物信息学和Southern blotting分析,利用qRT-PCR技术对其在不同组织、生长期和逆境条件下的表达水平,以及果实发育不同时期内mdhxk1葡萄糖磷酸化相对酶活性和葡萄糖积累进行了检测,通过原核诱导获得了重组蛋白,并获得了过表达苹果己糖激酶基因mdhxk1的转基因拟南芥株系,旨在为进一步深入研究苹果己糖激酶的功能奠定基础。主要结果如下:(1)获得了苹果己糖激酶基因mdhxk1(基因序列号:MDP0000309677)的全长cDNA,测序发现其完整的开放阅读框为1497 bp,编码499个氨基酸;关键基序和氨基酸残基在AtHXK1、AtHXK2和mdhxk1序列间十分保守;结构域分析表明,mdhxk1蛋白含有Hexokinase和Hexokinase两个保守的结构域;分析mdhxk1基因启动子序列发现其含有与抗逆、糖信号及激素信号相关的顺式作用元件。(2)Southern blotting结果表明,苹果基因组中mdhxk1有一个拷贝;mdhxk1定位于苹果基因组的第15号染色体上,具有9个外显子;亚细胞定位预测结果表明,苹果mdhxk1蛋白在大部分亚细胞结构均有分布。(3)qRT-PCR结果显示,mdhxk1在苹果的茎和花中表达量较高;在苹果果实发育期间,mdhxk1基因的表达、mdhxk1葡萄糖磷酸化相对酶活性和葡萄糖积累水平都呈现先升高后降低的趋势;mdhxk1基因的表达明显受盐、低温和ABA的诱导。(4)6%葡萄糖处理条件下,过表达mdhxk1转基因拟南芥株系明显表现出强烈的糖超敏感表型,子叶、下胚轴和根严重发育不良,表明苹果己糖激酶基因mdhxk1参与到葡萄糖对种子萌发后幼苗生长的调节作用。

关键词：苹果葡萄糖己糖激酶表达分析异位表达 mdhxk1

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