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Identification and functional characterization of the mdhb-1 gene promoter sequence from Malus×domestica

Journal of Integrative Agriculture 2017年第8期16卷 1730-1741页

作者： WANG Hao-jie JIANG Yong-hua QI Ying-wei DAI Jie-yu LIU Yan-li ZHU Xian-bo LIU Cui-hua Lü Yan-rong REN Xiao-lin College of Horticulture North west A&F UniversityYangling 712100P.R.China Institute of Economic Crop Research Shiyan Academy of Agricultural SciencesShiyan 442714P.R.China

Homeobox 1 in Malusxdomestica （mdhb-1） is a transcription factor that belongs to homeodomain-leucine zipper I （HD-Zip I） protein subfamily. According to previous reports, mdhb-1 could regulate ethylene synthesis by binding with the MdAC01 promoter, but other functions of mdhb-1 are still unknown. To reveal more clues concerning the characters of the mdhb-1 gene promoter and the functions of mdhb-1, the promoter region of mdhb-1 was cloned from the Royal Gala apple genome and recombined with the 13-glucuronidase （GUS） gene in this study. This research was conducted in Nicotiana tabacum and supported by Agrobacterium-mediated transient transformation and bioinformatics analysis. Deletion analysis of the mdhb-1 promoter showed that the GUS gene could be activated by serially deleted promoters, and the activity promoted by 680 nucleotides （nt） was the lowest. The region, which is 266 nt upstream of the initiation code （ATG）, was effective for GUS expression. Meanwhile, the activity of the mdhb-1 promoter （-1 057 nt）, which was stronger than mdhb-1 promoter （-1 057 to -266 nt） and lack the 5＂-untranslated region （5＂-UTR）, showed that 5＂-UTR may have a positive effect on gene transcription. After the sequence analysis, the cis-acting elements that respond to hormones and environmental stresses were identified in the promoter region. The mdhb-1 promoter （1 057 nt） activity in Nicotiana tabacum was positively induced by ethrel and darkness, and it was suppressed by gibberellic acid （GA）, whereas abscisic acid （ABA）, salicylic acid （SA）, wounding, and Pseudomonas syringae pv. tomato （DC3000） treatments revealed a slight auxo-action. These results reveal that the mdhb-1 promoter receive internal or external signals, and mdhb-1 may refer to many biological activities in apple, such as its stress response, development, and ripening.

关键词： transcription factor HD-Zip mdhb-1 promoter hormone stress

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苹果mdhb-1基因启动子中的乙烯响应元件对外源乙烯的响应分析

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植物生理学报 2016年第3期52卷 365-371页

作者：王豪杰姜永华刘艳利戚英伟刘翠华任小林西北农林科技大学园艺学院陕西杨凌712100 宁夏大学农学院银川750021

通过PlantCARE和PLACE软件在线分析预测表明,在苹果Md HB-1启动子中存在一个乙烯响应元件(距ATG上游576 bp)。为了探究该启动子中的乙烯响应元件对不同浓度乙烯的响应,以苹果品种‘皇家嘎拉’(Malus domestica *** Gala)基因组DNA为模板... 详细信息

通过PlantCARE和PLACE软件在线分析预测表明,在苹果Md HB-1启动子中存在一个乙烯响应元件(距ATG上游576 bp)。为了探究该启动子中的乙烯响应元件对不同浓度乙烯的响应,以苹果品种‘皇家嘎拉’(Malus domestica *** Gala)基因组DNA为模板,用PCR方法扩增得到长度分别为680 bp(含有乙烯响应元件)和485 bp(不含有乙烯响应元件)的启动子序列,构建GUS报告基因瞬时表达载体,依靠农杆菌介导转化烟草叶片,检测经过不同浓度乙烯利(0、500、1 000和1 500mg·L^(-1))处理的转基因烟草叶片的GUS蛋白活性。结果表明,该乙烯响应元件受到外源乙烯正调控作用,随着处理的外源乙烯浓度的增大,正调控效应先升高达到最大值后逐渐减弱,500 mg·L^(-1)乙烯利能最大程度地提升乙烯响应元件活性。

关键词：苹果 mdhb-1 瞬时表达乙烯响应元件

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VIGS诱导mdhb-1沉默对苹果果实成熟及果肉色素的影响

VIGS诱导MdHB-1沉默对苹果果实成熟及果肉色素的影响

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作者：温小红西北农林科技大学

学位级别：硕士

苹果果实的品质形成及成熟衰老会受到多种因子的调控,转录因子便是其中之一。本试验以‘澳洲青萍’(Granny Smith)果实为材料,利用病毒诱导基因沉默(Virus-induced gene silencing,VIGS)技术来探究乙烯转录因子mdhb-1是否可以在体内调控... 详细信息

苹果果实的品质形成及成熟衰老会受到多种因子的调控,转录因子便是其中之一。本试验以‘澳洲青萍’(Granny Smith)果实为材料,利用病毒诱导基因沉默(Virus-induced gene silencing,VIGS)技术来探究乙烯转录因子mdhb-1是否可以在体内调控MdACO1的表达及其是否对果实的成熟衰老有影响;并尝试对沉默基因后果肉呈现的表型变化进行解释,以期探究mdhb-1转录因子的其他生物学功能。试验结果表明:1、利用生物信息学对mdhb-1所属的HD-ZIP I家族成员的结构进行分析,建进化树显示该基因家族分为5个亚类,同一亚类中内含子/外显子结构相似,但有差异;理化性质分析显示其成员为亲水性蛋白,含高比例的碱性蛋白;上游启动子序列分析,该家族基因-600bp区域内广泛分布了参与激素互作的多种顺式作用元件,为HD-ZIP I响应各种环境及激素条件做准备。2、利用VIGS成功沉默mdhb-1,结果显示苹果果肉中MdACO1表达量下调,果实的呼吸强度和乙烯释放速率受到显著抑制,硬度、可溶性固形含量物含量和可滴定酸含量的下降延缓,说明mdhb-1可以正向调控MdACO1的表达,并参与了果实的成熟进程。3、沉默mdhb-1基因后,处理部果肉呈现红色表型,高效液相色谱检测显示,该红色果肉物质组分富含矢车菊素3-O-半乳糖苷;qRT-PCR检测结果表明,红色果肉中花青苷合成路径中的结构基因MdCHS、MdCHI、MdF3H、MdDFR、MdLDOX、MdUFGT和调控基因MdMYB110aP、MdbHLH3及MdTTL1的表达量都上调,说明mdhb-1可能参与了苹果果肉花青苷的合成,并且是一个负调控子。

关键词：澳洲青萍 VIGS mdhb-1 果实成熟花青苷

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苹果MdACO1及mdhb-1表达特点与mdhb-1特异表达载体构建及对番茄的转化

苹果MdACO1及MdHB-1表达特点与MdHB-1特异表达载体构建及对番茄的...

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作者：朱敏西北农林科技大学

学位级别：硕士

本研究以“皇家嘎拉”苹果为试验材料，通过研究MdACO1及转录因子mdhb-1在不同器官和不同发育阶段的表达量，揭示其表达模式，同时研究这两个基因对于外源乙烯的响应特点，以期探讨两基因之间的可能关系，为进一步揭示苹果乙烯生物合成... 详细信息

本研究以“皇家嘎拉”苹果为试验材料，通过研究MdACO1及转录因子mdhb-1在不同器官和不同发育阶段的表达量，揭示其表达模式，同时研究这两个基因对于外源乙烯的响应特点，以期探讨两基因之间的可能关系，为进一步揭示苹果乙烯生物合成的调控机制以及苹果果实成熟的分子机制提供有用信息;并将苹果mdhb-1基因通过转基因技术转到Micro-Tom番茄中，对其可能调控MdACO1表达的功能和其它生物学功能进行研究，明确其作为转录因子的生物学功能。本试验研究结果如下： 1.利用实时荧光定量PCR技术分析得知,在不同组织器官中，mdhb-1在花瓣中表达量较高，而MdACO1在成熟果中表达量较高。转录因子mdhb-1可能参与了苹果幼嫩果实和花器官中其它相关基因表达的调控，这一过程似与MdACO1无关。 2.在果实不同发育阶段中mdhb-1在未成熟果中（盛花期40d后）表达量最高，MdACO1在成熟果中尤其是花后100d表达量最高。MdACO1参与了果实的成熟过程，但并无受mdhb-1调控的迹象。 3.用外源乙烯利（500mg/L）处理盛花期110d后的果实，放置0-1d时抑制mdhb-1的表达，但在7d后其表达量增高;MdACO1表达量在外源乙烯利处理后迅速升高，并随着放置时间的延长而大幅度增高。外源乙烯会诱导成熟果实ACO1基因的过量表达，这一反馈调节过程似与mdhb-1无关。 4.构建了mdhb-1双元超量表达载体pBI121-2A11-mdhb-1，经菌落PCR、双酶切验证构建表达载体正确。 5.将重组表达载体通过农杆菌介导法转入Micro-tom番茄中，对获得的抗性植株进行PCR检测，最终得到4株转基因植株。

关键词：苹果 ACO 转录因子 mdhb-1 表达特点 Micto-tom 转基因

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苹果mdhb1基因启动子的克隆及特征分析

苹果MdHB1基因启动子的克隆及特征分析

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作者：王豪杰西北农林科技大学

学位级别：硕士

mdhb1是一个转录因子,属于苹果HD-Zip I亚家族的成员,根据先前的报道,mdhb1能够与MdACO1启动子结合,进而调控乙烯生物合成。本试验以‘皇家嘎啦’叶片为试材,克隆mdhb1基因启动子,然后以烟草为材料,利用农杆菌介导的瞬时转化技术来探究... 详细信息

mdhb1是一个转录因子,属于苹果HD-Zip I亚家族的成员,根据先前的报道,mdhb1能够与MdACO1启动子结合,进而调控乙烯生物合成。本试验以‘皇家嘎啦’叶片为试材,克隆mdhb1基因启动子,然后以烟草为材料,利用农杆菌介导的瞬时转化技术来探究苹果mdhb1基因启动子的特性。本试验结果如下:1、克隆了长度为1057 bp的mdhb1基因启动子,利用生物信息学软件对mdhb1基因启动子进行转录起始位点和顺式作用元件的分析,结果显示转录起始位点(TSS)、CAAT BOX、TATA BOX分别位于翻译起始位点(ATG)上游266 bp、319 bp、308 bp的位置。在这一段基因启动子区域内存在响应激素和环境因素的顺式作用元件,如ERE、ABRE、ARE、G-Box等。2、启动子5’端序列缺失试验表明,当启动子长度为680 bp时,活性最低,当启动子长度为266 bp时,仍具有较高的启动子活性。5’UTR(非编码区域)在基因表达过程中可能起到一个积极的作用。3、通过农杆菌介导的瞬时转化技术,获得含有长度为1057 bp启动子的转基因烟草,在生物和非生物因素的处理下,启动子受到乙烯、黑暗的正调控作用,而脱落酸(ABA)、水杨酸(SA)、假单胞丁香杆菌(DC3000)和机械伤对启动子的正调控作用较微弱,赤霉素(GA)则抑制启动子的活性。4、乙烯响应元件(距ATG上游576 bp)能够响应外源乙烯正调控作用,当外源乙烯处理浓度逐渐增大时,正调控效应逐渐升高达到最大值,然后逐渐降低,500 mg L-1乙烯利能最大程度的提升乙烯响应元件活性。

关键词：苹果 mdhb-1 启动子瞬时表达乙烯响应元件

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