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第三军医大学学报 2012年第15期34卷 1492-1495页

作者：罗静叶兴伟蒋文周洪静杨泽松刘林王利重庆医科大学附属第一医院血液科重庆400016 重庆医科大学附属第一医院第一分院超声科重庆400015

目的探讨阿糖胞苷诱导人MDS细胞株mutz-8细胞凋亡的可能机制。方法将细胞分为以下5组:阴性对照组、0.1μmol/L Ara-c组、1μmol/L Ara-c组、10μmol/L Ara-c组、10μmol/L Ara-c+62.5μmol/L ALA组。用MTT法测定阿糖胞苷对各组细胞抑制... 详细信息

目的探讨阿糖胞苷诱导人MDS细胞株mutz-8细胞凋亡的可能机制。方法将细胞分为以下5组:阴性对照组、0.1μmol/L Ara-c组、1μmol/L Ara-c组、10μmol/L Ara-c组、10μmol/L Ara-c+62.5μmol/L ALA组。用MTT法测定阿糖胞苷对各组细胞抑制率的影响,用Annexin V-FITC/PI双染法及Hoechst33258荧光染色观察阿糖胞苷对各组细胞凋亡的影响,并用流式细胞仪检测各组细胞线粒体膜电位的变化。运用二氢二氯荧光素(DCFH-DA)为细胞内活性氧探针,通过荧光显微镜及流式细胞仪检测各组细胞内活性氧水平的变化。结果 MTT结果提示,阿糖胞苷处理组细胞增殖抑制率高于阴性对照组,二者相比差异具有统计学意义(Pmutz-8细胞后,凋亡率明显升高,线粒体膜电位明显下降,与阴性对照组相比,差异具有统计学意义(Pmutz-8的生长并诱导其凋亡,可能与阿糖胞苷影响了细胞内ROS水平有关。

关键词：细胞凋亡阿糖胞苷 mutz-8 骨髓增生异常综合征活性氧

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RPS14基因过表达对人MDS细胞株mutz-8增殖的影响

RPS14基因过表达对人MDS细胞株MUTZ-8增殖的影响

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作者：罗静重庆医科大学

学位级别：硕士

目的：骨髓增生异常综合征（Myelodysplastic syndrome, MDS）是累及造血干细胞的异质性克隆性疾病，以无效造血及高风险向急性白血病转化为特征。目前本病预后差，缺乏有效的治疗手段。因此，探索MDS的分子发病机制，对改善MDS的预后... 详细信息

目的：骨髓增生异常综合征（Myelodysplastic syndrome, MDS）是累及造血干细胞的异质性克隆性疾病，以无效造血及高风险向急性白血病转化为特征。目前本病预后差，缺乏有效的治疗手段。因此，探索MDS的分子发病机制，对改善MDS的预后具有重要意义。5号染色体长臂缺失是MDS普遍存在的染色体异常之一，研究发现缺失的区域均包括5q31-5q32，该区域称为共缺失区域(common deleted region，CDR)。RPS14(ribosomal protein S14, RPS14)基因位于该区域，表达量明显下降。我们的前期研究已经表明，伴de（l5q-）MDS患者体内RPS14基因表达水平下降，RPS14在MDS的发病发展中起着很重要的作用。本实验通过构建携带人RPS14基因的重组慢病毒载体pGC-FURPS14-GFP，并将构建成功的重组慢病毒载体感染人MDS细胞株mutz-8细胞，增高目的基因在靶细胞内的表达水平，再通过细胞毒力实验、凋亡率的变化来观察RPS14表达水平增高后对mutz-8细胞增殖、凋亡的影响。方法： 1、携带人RPS14基因的重组慢病毒载体pGC-FU RPS14-GFP的构建及鉴定：选用慢病毒pGC-FU-EGFP为载体，首先设计合成RPS14PCR产物与线性化慢病毒载体相连接，产物经测序鉴定确认，与包装质粒共转染293T细胞，产生重组慢病毒载体pGC-FU RPS14-GFP，逐孔稀释法测定病毒滴度;采用流式细胞仪检测感染效率，RT-PCR及Westernblot检测感染前后目的细胞内RPS14mRNA及RPS14蛋白的表达变化。 2、重组慢病毒载体pGC-FU RPS14-GFP感染mutz-8细胞后对其增殖影响的研究：将实验细胞分组为：未感染组(mutz-8)、空病毒感染组、感染组，应用噻唑蓝（MTT）法测定各组细胞的OD值，绘制生长曲线。 3、重组慢病毒载体pGC-FU RPS14-GFP感染mutz-8细胞后对其凋亡影响的研究：将实验细胞分组为：未感染组(mutz-8)、空病毒感染组、感染组，应用流式细胞仪测定各组细胞的凋亡率。结果： 1、本实验成功构建了重组慢病毒载体pGC-FU RPS14-GFP，滴度达2.0×109Tu/ml，构建的慢病毒载体能够高效率的感染mutz-8细胞，100MOI的重组慢病毒载体对mutz-8细胞的感染效率约为（51.303±3.908）%，RT-PCR、Western blot检测均显示感染后目的细胞RPS14mRNA及蛋白的表达水平高于感染前。 2、重组慢病毒载体pGC-FU RPS14-GFP感染mutz-8细胞后抑制其增殖：感染后2d、3d、4d、5d，收集各组细胞，MTT法检测各组细胞的吸光度值，感染重组慢病毒载体后对mutz-8细胞的生长有抑制作用，与空病毒感染组相比差异具有统计学意义（P＜0.05）。 3、重组慢病毒载体pGC-FU RPS14-GFP感染mutz-8细胞后促进其凋亡：流式细胞术检测感染前后细胞的凋亡率变化，感染重组慢病毒载体后mutz-8细胞凋亡率为（26.233±3.095）%，显著高于空病毒感染组细胞的凋亡率(P＜0.05)。结论： 1、慢病毒载体可以高效率感染血液肿瘤细胞，对血液肿瘤的分子治疗研究具有重要的临床应用价值;2、RPS14基因表达水平增高抑制人MDS细胞株mutz-8细胞的增殖;3、RPS14基因表达水平增高促进人MDS细胞株mutz-8细胞的凋亡;4、RPS14基因在MDS的发生发展中起着很重要的作用，本研究为进一步将RPS14作用MDS的分子靶标研究提供了实验数据。

关键词：骨髓增生异常综合征 RPS14 mutz-8 增殖慢病毒载体

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