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谷氨酸转运体4b-4c环在转运底物过程中的作用及构象变化的研究

谷氨酸转运体4b-4c环在转运底物过程中的作用及构象变化的研究

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作者：张文龙南方医科大学

学位级别：硕士

谷氨酸由突触前膜释放到突触间隙,作用于突触后膜,传递兴奋性的神经信号。谷氨酸主要由位于神经元和胶质细胞上的兴奋性氨基酸转运体(Excitatory amino acid transporters,EAATs)重新摄取回收,防止兴奋性毒性效应。EAATs功能失调与脑缺... 详细信息

谷氨酸由突触前膜释放到突触间隙,作用于突触后膜,传递兴奋性的神经信号。谷氨酸主要由位于神经元和胶质细胞上的兴奋性氨基酸转运体(Excitatory amino acid transporters,EAATs)重新摄取回收,防止兴奋性毒性效应。EAATs功能失调与脑缺血、中风和肌萎缩侧索硬化等疾病相关。高亲和力谷氨酸转运体分为 EAAT1(excitatory amino acid transporter-1)、GLT-1(glial glutamate transporter type one)、EAAC1(excitatory amino acid carrier-1,EAAT3)、EAAT4 和 EAAT5亚型。EAATs主要利用Na+-K+-ATP酶形成的Na+和K+的电化学浓度梯度来完成对谷氨酸的转运。EAATs每转运1个谷氨酸分子,伴随有3个Na+和1个H+同向转入细胞内,1个K+转运到细胞外。原核生物天冬氨酸转运体(Pyrococcus horikoshii,GltPh)的晶体结构研究表明,该转运体是由3个单体组成的三聚体,每个单体都是独立的转运功能单位,由8个跨膜区段(transmembrane domain,TM)TM1～TM8和2个方向相反的发夹结构(helical hairpin,HP)HP1～HP2组成。HP1位于跨膜区段TM6和TM7之间,HP2位于跨膜区段TM7和TM8之间。TM1～TM2和TM4～TM5组成的转运体的支架区域,起维持平衡的作用。TM3,TM6～TM8和HP1-HP2组成转运体的转运区域。迄今为止科学家解析了谷氨酸转运体同族体GltPh和人源EAAT1的晶体结构。虽然原核生物GltPh和和真核的EAATs结构相似,但氨基酸序列相似性低于40%。GltPh和EAATs的第四跨膜区段均包含三个分隔的α-螺旋TM4a、TM4b及TM4c。GltPhTM4b与TM4c之间只有4个氨基酸残基,而EAATs则有57个氨基酸残基,形成TM4b-4c环,在人源EAAT1的晶体结构中未解析成功。EAATs TM4b-4c环较GltPh的多了约50个氨基酸残基,必然导致二者在空间构型、转运底物过程中构象变化及功能存在较大差异。因此,本课题主要用定点突变、半胱氨酸突变对交联的方法,旨在揭示TM4b-4c环与底物转运通道的关系和在底物转运中的功能,阐述原核与真核谷氨酸转运体转运机制差异的分子结构基础。对完全阐明EAATs的转运机制提供一定的理论基础。第一章EAAT1 4b-4c环与底物转运通道关系的研究为了探讨EAATs TM4b-4c环在在转运底物中的作用,TM4b-4c环的57个氨基酸残基分别逐一突变成半胱氨酸。其中13个突变体的转运活性低于15%。活性太低不能进一步研究。分别用透膜巯基试剂MTSEA和非透膜巯基试剂mtset检测具备转运活性的半胱氨酸突变体的水相通透性。F190C、V238C和A243C 的转运活性被 mtset 抑制,Q189C、F190C、V238C、A243C 和 L244C对MTSEA敏感。当加入K+使转运体向胞内开放时相比例增加时,MTSEA对Q189C和L244C的转运活性的抑制作用增强。相反地,L-glu能保护MTSEA对L244C的转运活性抑制的作用。对于A243C而言,L-glu、K+和TBOA均能增强MTSEA的抑制作用。对于突变体F190C和V238C,不同的细胞外介质对巯基的抑制作用无明显变化。根据以上结果,我们推测氨基酸残基F190C,V238C,A243C可能暴露于细胞外液,TM4b-4c环可能形成多次跨膜结构。另一方面,氨基酸残基F190C、V238C和A243C可能参与转运通道的组成。此外,不同的细胞外介质中,突变体Q189C、A243C和L244C对巯基的抑制有变化,推测Q189C、A243C和L244C在转运底物中水相通透性发生改变,可能参与底物转运。第二章EAAT1底物转运过程中TM4b-4c环与TM7的相对运动为了进一步研究谷氨酸转运体TM4b-4c环在转运底物过程中与TM7空间距离的改变,探讨其在转运过程构像的改变。我们在TM4b-4c环氨基酸位点A243和TM7构建了 26对半胱氨酸对。其中A243C/T396C和A243C/S414C能被氧化剂Cu(Ⅱ)(1,10-phenanthroline)和Cd2+抑制,相应的单个半胱氨酸突变体和野生型不被抑制,提示半胱氨酸对间二硫键的形成。半胱酸对A243C/T396C和A243C/S414C的氧化抑制效应经还原剂DTT处理后转运活性恢复,该实验进一步确认半胱氨酸对间二硫键的形成。在突变体A243C/T396C中,L-glu、K+和TBOA均能增强CuPh的抑制作用。提示在对内开放时相和对外开放时相中,TM4b-4c环的氨基酸位点A243和TM7上的氨基酸位点T396位点相互靠近。在突变体A24

关键词： EAATs 转运活性 TM4b-4c TM7 mtset CuPh

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