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mtb hsp16.3重组蛋白构建及通过CX3CR1调控巨噬细胞M2型极化的作用机制研究

MTB Hsp16.3重组蛋白构建及通过CX3CR1调控巨噬细胞M2型极化的作...

引用

作者：刘利萍遵义医科大学

学位级别：硕士

目的:构建mtb hsp16.3重组蛋白,验证其通过CX3CR1调控巨噬细胞M2型极化的作用,生信分析筛选CX3CR1可能作用的靶基因并探讨相关分子机制。方法:1.mtb hsp16.3重组蛋白的构建:根据NCBI收录的hspX基因序列,在生物信息学分析的基础上设计引... 详细信息

目的:构建mtb hsp16.3重组蛋白,验证其通过CX3CR1调控巨噬细胞M2型极化的作用,生信分析筛选CX3CR1可能作用的靶基因并探讨相关分子机制。方法:1.mtb hsp16.3重组蛋白的构建:根据NCBI收录的hspX基因序列,在生物信息学分析的基础上设计引物,通过同源重组技术构建hspX基因重组质粒pGEX-4T-GST-hsp16.3-His,PCR扩增目的序列,进行琼脂糖凝胶电泳鉴定并切胶回收目的片段。将重组质粒转化到BL21感受态细胞中,加入IPTG诱导后收集细菌,裂解菌体并超声破碎,经离心后分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE凝胶分析;将切胶回收目的片段与pMAL-c5x质粒用Sac I/BamHI双酶切后进行重组酶连接并转化至DH5α感受态细胞,挑取单菌落进行测序验证。将表达质粒pMAL-c5x-MBP-hsp16.3-His转化到BL21感受态细胞中诱导蛋白表达并进行SDS-PAGE凝胶分析;对获得的细菌蛋白样本经Ni柱亲和层析进行蛋白纯化,通过TEV酶切去除MBP标签,通过Ni柱和MBP柱将目的蛋白与MBP标签分开,电泳检测目的蛋白纯化情况。2.mtb hsp16.3重组蛋白调控巨噬细胞M2型极化的作用验证:设置三组浓度梯度的mtb hsp16.3重组蛋白分别诱导小鼠骨髓来源巨噬细胞,以IFN-γ诱导的巨噬细胞组作为M1型极化的标准对照,IL-4诱导的巨噬细胞组作为M2型极化的标准对照。通过Real-time PCR检测M1型极化相关分子TNF-α、iNOS和M2型极化相关分子IL-10、TGF-β以及CX3CR1的mRNA表达水平;Westernblot检测CD206、MHCⅡ以及CX3CR1的蛋白表达水平;ELISA检测M1型极化标志物IL-6及M2型极化标志物TGF-β、IL-10的分泌水平。3.mtb hsp16.3重组蛋白通过CX3CR1调控巨噬细胞M2型极化的作用机制:利用带有GFP绿色荧光标签的慢病毒感染小鼠骨髓来源巨噬细胞表面的CX3CR1,通过荧光显微镜观察巨噬细胞绿色荧光信号强度以判断最佳感染时间与MOI值。以PBS处理巨噬细胞作为空白对照组（cont）,慢病毒对照载体LV-shRNA-NC感染巨噬细胞作为阴性对照组（shNC）,三种慢病毒干扰载体LV-shRNA-CX3CR1感染巨噬细胞作为实验组（shRNA1-3）;通过Real-time PCR和Western blot分别从mRNA和蛋白水平检测三种慢病毒对巨噬细胞CX3CR1表达的影响,从而筛选出干扰效率最高的慢病毒干扰载体,并以筛选出的慢病毒干扰载体感染的BMDMs作为实验组（shRNA3）。向cont组、shNC组和shCX3CR1组分别加入mtb hsp16.3重组蛋白刺激24h并命名为Mock组、Scramble组和shRNA3组,提取细胞总RNA进行转录组测序。对比shCX3CR1与cont组及shNC组两组数据,筛选出CX3CR1影响巨噬细胞极化的差异表达基因,并对这些差异表达基因进行GO和KEGG功能富集分析,探寻CX3CR1调控巨噬细胞M2型极化的关键信号通路,并对可能的信号通路进行验证。结果:1.重组质粒pGEX-4T-GST-hsp16.3-His经PCR扩增后获得的目的片段大小约432bp,与预期长度相符。以此质粒为载体转化BL21感受态细胞后诱导表达的重组蛋白在预期蛋白大小位置（43k Da）少量表达,主要以包涵体形式存在。pMAL-c5x-MBP-hsp16.3质粒测序鉴定,目的基因序列正确,转化至BL21感受态细胞,经IPTG诱导后重组蛋白在37℃和18℃均能在上清中大量表达。获得的蛋白通过亲和层析柱以及TEV酶切处理后获得mtb hsp16.3重组蛋白。2.mtb hsp16.3重组蛋白刺激小鼠骨髓来源巨噬细胞后表型与IL-4刺激组较为一致。Real-time PCR结果显示M1型极化相关分子TNF-α、iNOS表达水平降低,而M2型极化相关分子TGF-β、IL-10及CX3CR1的mRNA表达水平升高,差异均具有统计学意义（P＜0.05）;Western blot结果显示,重组蛋白抑制MHCⅡ的蛋白表达,促进CD206及CX3CR1的蛋白表达（P＜0.05）;ELISA结果显示重组蛋白促进TGF-β、IL-10的分泌（P＜0.05）。3.慢病毒沉默巨噬细胞表面CX3CR1的最适条件为MOI=100,感染时间为5d。在此条件下加入三组慢病毒感染巨噬细胞,shRNA3感染组的CX3CR1在mRNA水平和蛋白水平均降低最显著（P＜0.05）。通过Real-time PCR对转录组测序结果进行质量评估,结果显示所选20个基因其Real-time PCR结果与测序结果相符。以|log2FC|≥0和p-adjust＜0.05作为筛选条件共得到1535个差异表达基因,其中1420个差异表达基因获得功

关键词： mtb hsp16.3 重组蛋白 CX3CR1 巨噬细胞极化

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mtb hsp16.3通过CCRL2调控巨噬细胞M2型极化的研究

MTB Hsp16.3通过CCRL2调控巨噬细胞M2型极化的研究

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第十二届全国免疫学学术大会

作者：刘芊伊李姗姗罗军敏遵义医学院

目的:探讨mtb hsp16.3诱导巨噬细胞M2型极化过程中CCRL2的促进作用。方法:本实验室前期工作表明mtb hsp16.3诱导巨噬细胞向M2型极化,通过基因芯片技术筛选出mtb hsp16.3诱导巨噬细胞向M2型极化的相关受体CCL2。RNAi技术沉默小鼠骨髓来... 详细信息

目的:探讨mtb hsp16.3诱导巨噬细胞M2型极化过程中CCRL2的促进作用。方法:本实验室前期工作表明mtb hsp16.3诱导巨噬细胞向M2型极化,通过基因芯片技术筛选出mtb hsp16.3诱导巨噬细胞向M2型极化的相关受体CCL2。RNAi技术沉默小鼠骨髓来源巨噬细胞受体CCRL2,mtb hsp16.3刺激巨噬细胞0-72 h,Real-time PCR检测Arg-1、IL-10、TGF-β、iNOS、IL-6和TNF-α等细胞因子mRNA表达变化,ELISA检测不同时间点细胞培养液上清TNF-α、IL-10、TGF-β1细胞因子分泌水平变化;构建pcDNA3.1-CCRL2载体,过表达小鼠骨髓来源巨噬细胞表面CCRL2受体。mtb hsp16.3刺激巨噬细胞0-72h,Real-time PCR检测Arg-1、IL-10、TGF-β、iNOS、IL-6和TNF-α等细胞因子mRNA的表达变化,ELISA检测不同时间点细胞培养液上清TNF-α、IL-10、TGF-β1细胞因子分泌水平变化。结果:RNAi技术沉默小鼠骨髓来源巨噬细胞受体CCRL2,并检测其沉默效率。mtb hsp16.3诱导M0型巨噬细胞后,Real-time PCR结果显示:从12 h开始,Arg-1、IL-10、TGF-β和Ym-1 mRNA的相对表达水平较对照组呈现下调趋势;ELISA结果显示:IL-10和TGF-β的分泌水平较对照组呈现下调表达,TNF-α呈现上调表达。构建pcDNA3.1-CCRL2载体,成功的过表达小鼠骨髓来源巨噬细胞受体CCRL2。mtb hsp16.3诱导M0型巨噬细胞后,Real-time PCR结果显示:从12 h开始,Arg-1、IL-10、TGF-βmRNA的相对表达水平较对照组均呈现明显的上调;ELISA结果显示:IL-10和TGF-β的分泌水平较对照组呈现上调表达,TNF-α呈现下调表达。结论:mtb hsp16.3诱导小鼠骨髓来源M0型巨噬细胞M2型极化可能通过CCRL2。

关键词：结核分枝杆菌巨噬细胞极化 mtb hsp16.3 CCRL2

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