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pCDNA3.1-mt2a真核表达载体的构建及亚细胞定位

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中国免疫学杂志 2014年第11期30卷 1504-1507页

作者：谭家余陈敬林黄湘李冬秀袁春雷万志丹南方医科大学附属中山市博爱医院中心ICU 中山528403 南方医科大学附属中山市博爱医院产前诊断中心中山528403 南方医科大学附属中山市博爱医院检验科中山528403

目的:构建pCDNA3.1-mt2a真核表达载体并观察其在293T和SMMC7721细胞株中的定位和表达情况。方法:使用基因合成法合成mt2a基因,在其N端添加Kozak序列及His标签序列,将扩增后的目的基因双酶切连接至pcDNA3.1(+)载体的BamHⅠ和NotⅠ之间。... 详细信息

目的:构建pCDNA3.1-mt2a真核表达载体并观察其在293T和SMMC7721细胞株中的定位和表达情况。方法:使用基因合成法合成mt2a基因,在其N端添加Kozak序列及His标签序列,将扩增后的目的基因双酶切连接至pcDNA3.1(+)载体的BamHⅠ和NotⅠ之间。转化DH5α大肠杆菌后,挑取阳性克隆子进行质粒抽提电泳及测序鉴定。将鉴定正确的pCDNA3.1-mt2a质粒采用脂质体法转染293T和SMMC7721细胞株,激光共聚焦显微镜观察其在真核细胞中的表达和定位情况。结果:pCDNA3.1-mt2a重组质粒经酶切电泳及DNA测序证实,目的基因mt2a的序列完全正确,真核表达载体构建成功,激光共聚焦观察发现该重组质粒表达于293T和SMMC7721细胞的胞质中。结论:成功构建pCDNA3.1-mt2a融合基因并进行真核表达,发现mt2a主要定位于293T和SMMC7721细胞的细胞质中。本研究为探讨mt2a在肝癌细胞内的功能奠定了基础。

关键词： mt2a 载体构建细胞定位

mt2a改善缺氧再复氧诱导的H9c2心肌细胞损伤

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MT2A改善缺氧再复氧诱导的H9c2心肌细胞损伤

作者：冯庆敏海南医学院

学位级别：硕士

目的:冠状动脉疾病的患者数量逐渐增加,是全球范围最常见的健康问题之一。在发生急性心肌梗死后,使用药溶和经皮介入治疗进行早期心肌再灌注,是及时挽救受损心肌最有效的方法之一,但是,这种治疗方式可能会加重心肌的功能不全以及心肌细... 详细信息

目的:冠状动脉疾病的患者数量逐渐增加,是全球范围最常见的健康问题之一。在发生急性心肌梗死后,使用药溶和经皮介入治疗进行早期心肌再灌注,是及时挽救受损心肌最有效的方法之一,但是,这种治疗方式可能会加重心肌的功能不全以及心肌细胞的死亡,这可能会降低心肌再灌注的有益方面。心肌缺血再灌注的损伤主要与游离氧自由基的大量产生,细胞自噬的激活以及细胞的凋亡有关。而金属硫蛋白2A（mt2a）能够抑制游离氧自由基的大量产生,抑制自噬以及细胞的凋亡,因此,mt2a可能保护心肌细胞免受缺血再灌注的损伤。在本研究中,我们主要分析在缺氧/复氧（H/R）的条件下mt2a对H9c2心肌细胞的氧自由基、自噬以及凋亡的调节。方法:使用H9c2心肌细胞（Control）、空载病毒的H9c2心肌细胞（Vector）和mt2a基因过表达慢病毒载体转染H9c2心肌细胞（mt2a）,实验分为Control组、Vector组和mt2a组,将其分别在常氧（N）、缺氧（H）和缺氧/复氧（H/R）条件下进行处理,然后采用mtT法测定细胞活力,用倒置荧光显微镜和WB检测mt2a的表达水平,用WB检测相关的凋亡因子以及LC3-II和p62自噬因子的表达水平,以及用DCFH-DA测量ROS的表达水平。结果:成功构建了mt2a基因过表达慢病毒载体,然后,将其转染H9c2心肌细胞并筛选出稳定的转染细胞株,使mt2a能够过量表达。并成功应用H/R模型培养H9c2心肌细胞来模仿心肌缺血再灌注,来表现出相应的缺血再灌注损伤症状。通过倒置荧光显微镜和WB实验结果显示,mt2a基因过表达慢病毒载体转染H9c2心肌细胞成功。WB实验结果显示,在H/R条件下,与Control组和Vector组相比,mt2a组的相关凋亡因子较降低（p＜0.01）;mt2a组的p62的表达水平明显上调（p＜0.001）,mt2a组的LC3-II的表达水平下调（p＜0.05）。DCFH-DA实验结果显示,在H/R条件下,相对于Control组和Vector组,mt2a组的ROS的表达水平明显减少（p＜0.001）。mtT实验结果显示,在H/R条件下,与Control组和Vector组相比,mt2a组的细胞活力明显上调（p＜0.001）。结论:本研究结果说明,在H/R条件下,mt2a过表达可以有效保护H9c2心肌细胞,通过ROS的清除,避免ROS的积累而引起的氧化应激,进而抑制H9c2心肌细胞的自噬以及凋亡,并且通过相关凋亡蛋白的降低来表明H9c2心肌细胞程序性死亡的减轻,以及下调了LC3-II以及上调了p62的表达水平来表明H9c2心肌细胞自噬的抑制。在这种情况下,表明mt2a在预防或治疗缺血性心脏疾病时是一个潜在的工具,但是尚不清楚mt2a预处理后对心肌细胞保护中这些机制之间的联系。为了阐明这些联系,还需要进一步更深入的研究。

关键词： H9c2心肌细胞缺氧/复氧 mt2a

人髌下脂肪垫干细胞源性外泌体抑制膝关节术后纤维化的研究

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人髌下脂肪垫干细胞源性外泌体抑制膝关节术后纤维化的研究

作者：贾大洲扬州大学

学位级别：硕士

目的:探索人髌下脂肪垫干细胞源性外泌体（Exosomes derived from infrapatellar fat pad mesenchymal stem cells,IPFSCs-Exo）对膝关节术后纤维化的抑制作用及其可能的机制研究。方法:（1）提取人髌下脂肪垫来源干细胞（IPFSCs）及其... 详细信息

目的:探索人髌下脂肪垫干细胞源性外泌体（Exosomes derived from infrapatellar fat pad mesenchymal stem cells,IPFSCs-Exo）对膝关节术后纤维化的抑制作用及其可能的机制研究。方法:（1）提取人髌下脂肪垫来源干细胞（IPFSCs）及其来源外泌体（IPFSCs-Exo）。（2）建立大鼠膝关节纤维化模型,将大鼠麻醉后打开大鼠膝关节囊,暴露股骨内侧髁,采用动物专用钻孔器取出约3×3mm的皮质区域,冲洗后缝合切口。术后第一周开始,将PBS和1010 particles/ml IPFSCs-Exo注射至大鼠手术造模区,每周2次,持续4周。4周后制备组织学切片,采用HE染色评估膝关节手术区域纤维化程度,Masson染色和免疫组化评估膝关节纤维化组织中胶原含量。（3）通过IL-1β模拟细胞炎性环境及CCK-8实验检测IPFSCs-Exo对炎性环境下成纤维细胞增殖活力的影响。（4）IPFSCs-Exo干预炎性环境下的成纤维细胞后,通过转录组学测序寻找抑制膝关节纤维化可能的分子靶标。（5）IPFSCs-Exo干预炎性环境下的成纤维细胞后,通过流式细胞分析检测IPFSCs-Exo对成纤维细胞细胞周期变化情况,EdU细胞增殖实验检测IPFSCs-Exo对成纤维细胞内DNA合成情况;RT-PCR和Western blot检测IPFSCs-Exo对细胞增殖相关基因（Cyclin D1、PCNA）的mRNA和蛋白表达水平的影响。（6）为了验证mt2a是否为IPFSCs-Exo作用的分子靶标,通过慢病毒载体的构建与导入沉默mt2a,以IPFSCs-Exo处理mt2a沉默的人成纤维细胞,检测IPFSCs-Exo对炎性环境下成纤维细胞增殖的影响。结果:（1）分离培养的人髌下脂肪垫来源细胞在光学显微镜下呈贴壁生长的长梭状;流式细胞仪检测所提取的细胞CD44,CD73,CD90,CD105呈强阳性表达;且提取的细胞具有成脂、成骨及成软骨三系分化能力。收集IPFSCs的培养上清,通过超速离心法提取上清中的外泌体样囊泡状物质,其在透射电镜下呈圆盘状的双层膜结构;Nanosight粒径分析显示:提取的外泌体样囊泡状物质的粒径范围为50-200nm,其浓度为1010 particles/ml;Western blot检测外泌体表面蛋白CD63、CD81呈高表达。（2）组织学切片结果显示:HE染色证实IPFSCs-Exo组膝关节手术区域纤维化程度较PBS组明显减轻;Masson染色显示IPFSCs-Exo组膝关节手术区域中胶原含量较PBS组表达明显降低;免疫组化结果显示IPFSCs-Exo组膝关节手术区域中Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原含量较PBS组表达明显降低。（3）RT-PCR结果证实低浓度（10ng/ml）IL-1β能够促进炎性细胞因子的表达以及促进成纤维细胞增殖。CCK8实验显示IPFSCs-Exo能够以浓度依赖性的方式抑制炎性环境下成纤维细胞的增殖活力,而对非炎性环境下的成纤维细胞增殖活力无明显影响。（4）通过转录组学测序筛选出IPFSCs-Exo干预炎性环境下成纤维细胞后显著上调的mt2a基因,其可能与膝关节纤维化相关。（5）流式细胞周期分析显示IPFSCs-Exo能够将炎性环境下的成纤维细胞阻滞在G1期;EdU细胞增殖实验显示IPFSCs-Exo能够抑制炎性环境下成纤维细胞的DNA合成;RT-PCR和Western blot显示IPFSCs-Exo能够下调炎性环境下的成纤维细胞增殖相关基因（Cyclin D1、PCNA）的mRNA和蛋白表达水平。上述结果表明IPFSCs-Exo能够抑制炎性环境下的成纤维细胞增殖。（6）经慢病毒转染沉默mt2a后,EdU细胞增殖实验显示EdU 阳性细胞占比被部分逆转;同时RT-PCR和Western blot显示增殖相关基因（Cyclin D1、PCNA）的mRNA和蛋白表达水平也出现部分逆转。结论:IPFSCs-Exo能有效抑制膝关节手术区域纤维化程度。其机制可能是IPFSCs-Exo抑制炎症环境中成纤维细胞的增殖,而mt2a可能是其潜在的干预靶点。

关键词：髌下脂肪垫干细胞外泌体成纤维细胞细胞增殖 mt2a 膝关节纤维化

金属硫蛋白mt基因的质粒构建和在细胞中的过表达分析

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金属硫蛋白MT基因的质粒构建和在细胞中的过表达分析

作者：李新颖安徽医科大学

学位级别：硕士

目的为研究mt基因的生物学功能，构建带FLAG标签的真核表达载体，将mt2a质粒瞬时转染至COS7细胞，观察表达的蛋白在细胞内的定位;将mt2a与CLIC1质粒共同瞬时转染至COS7细胞，观察两种蛋白在细胞内的共定位情况;将质粒分别转染至HEK293T... 详细信息

目的为研究mt基因的生物学功能，构建带FLAG标签的真核表达载体，将mt2a质粒瞬时转染至COS7细胞，观察表达的蛋白在细胞内的定位;将mt2a与CLIC1质粒共同瞬时转染至COS7细胞，观察两种蛋白在细胞内的共定位情况;将质粒分别转染至HEK293T细胞，用免疫共沉淀实验检测mt2a蛋白与CLIC1蛋白在哺乳动物细胞内的相互作用情况。构建pGEX-3X-mt2a原核表达载体，将质粒转化至BL21菌株中，IPTG诱导GST-mt2a的表达，进行GST pull-down实验检测mt2a蛋白与CLIC1蛋白在体外的相互作用。方法用PCR方法，以含人mt全长cDNA序列的质粒为模板，扩增mt全长序列，酶切回收目的片段，插入到载体pGADT7、pCDNA3.1上，构建酵母表达载体pGADT7-mt，真核表达载体pCDNA3.1-mt-His6、pCDNA3.1-mt-FLAG。以同样方法构建原核表达载体pGEX-3X-mt。重组质粒经酶切鉴定正确的送测序公司测序。分别将pCDNA3.1-mt2a-FLAG质粒瞬时转染至COS7细胞，在荧光显微镜下观察mt2a蛋白的细胞定位;pCDNA3.1-mt2a-FLAG与pCDGFP-CLIC1共同转染至COS7细胞，荧光显微镜下观察两种蛋白在细胞内的共定位;将两组质粒共同瞬时转染至HEK293T细胞，通过免疫共沉淀实验检测mt2a蛋白与CLIC1蛋白在哺乳动物细胞内的相互作用。构建表达载体pGEX-3X-mt2a，转化大肠杆菌BL21，表达融合蛋白GST-mt2a，进行GST pull-down实验，检测mt2a蛋白与CLIC1蛋白在体外的相互作用。结果酶切和测序图谱证明各载体均构建正确。在荧光显微镜下观察到，在COS7细胞中，mt2a蛋白主要分布在细胞质中。共定位实验观察到mt2a蛋白与CLIC1蛋白无明显共定位。免疫共沉淀实验表明，在HEK293T细胞中，mt2a蛋白与CLIC1蛋白在细胞内不存在相互作用。GST pull-down实验表明mt2a蛋白和CLIC1蛋白在体外无相互结合。结论在COS7细胞中，mt2a蛋白与CLIC1蛋白无明显共定位;免疫共沉淀实验证明在HEK293T细胞中，mt2a与CLIC1蛋白不存在相互作用;GST pull-down实验表明mt2a蛋白和CLIC1蛋白在体外无相互结合。目的为研究DG蛋白与Sedlin的相互作用，构建带FLAG标签的DAG1真核表达载体，将质粒瞬时转染至COS7细胞，观察表达的蛋白在细胞内的定位;将DAG1与Sedlin质粒共同转染至COS7细胞，观察两种蛋白在细胞内的共定位情况。方法用PCR方法，以含人DAG1全长cDNA序列的质粒为模板，扩增DAG1全长序列，酶切回收目的片段，插入到载体pCDNA3.1上，构建真核表达载体pCDNA3.1-DAG1-FLAG。将pCDNA3.1-DAG1-FLAG质粒瞬时转染至COS7细胞，在荧光显微镜下观察DG蛋白的细胞定位。pCDNA3.1-DAG1-FLAG与pCDGFP-Sedlin共同转染至COS7细胞，荧光显微镜下观察两种蛋白在细胞内的共定位。结果酶切和测序图谱证明载体构建正确。在荧光显微镜下观察到，在COS7细胞中，DG蛋白在细胞质和细胞核内均有分布，尤其在细胞膜上分布更集中。与Sedlin真核表达载体共同转染入COS7细胞后，DG蛋白在细胞中的分布出现向细胞核附近集中的趋势。结论在COS7细胞中，DG蛋白在细胞质和细胞核内均有分布，尤其在细胞膜上分布更集中。与Sedlin真核表达载体共同转染入COS7细胞后，DG蛋白在细胞中的分布出现向细胞核附近集中的趋势。

关键词： mt2a 质粒构建 GST pull-down 免疫共沉淀蛋白质相互作用 DG DAG1 Sedlin 质粒构建免疫共定位

人髓样锌指结构1的表观调控及其与金属硫蛋白2A在抑制胃癌中的相互作用

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人髓样锌指结构1的表观调控及其与金属硫蛋白2A在抑制胃癌中的相...

作者：林舒晔北京交通大学

学位级别：硕士

背景与目的胃癌是我国最常见的高发肿瘤之—,鉴别能够用于早期诊断及化疗敏感与耐药的预后标志物具有重要的临床应用价值。金属硫蛋白2A (Metallothionein, mt2a)和NF-κBB均被认为是与肿瘤药物敏感性相关的分子,而且以NF-κB信号通路... 详细信息

背景与目的胃癌是我国最常见的高发肿瘤之—,鉴别能够用于早期诊断及化疗敏感与耐药的预后标志物具有重要的临床应用价值。金属硫蛋白2A (Metallothionein, mt2a)和NF-κBB均被认为是与肿瘤药物敏感性相关的分子,而且以NF-κB信号通路为靶标的治疗干预被认为是抑制肿瘤生长、改善肿瘤化疗耐药的有效举措。课题组前期研究表明,mt2a在胃癌细胞与组织中表达降低。大蒜衍生物己二烯三硫化物(Diallyl Trisulfide, DATS)及其联用化疗药多西他赛(Docetaxel, DOC)可通过表观遗传机制上调mt2a,增加IκB-α表达,抑制NF-κB活性,从而抑制胃癌细胞体内外增殖。这些结果提示,mt2a在胃癌中起到抑癌基因样作用,参与调控NF-κB信号通路,而且mt2a-NF-KB通路在肿瘤发生发展、检测癌症患者预后、增强肿瘤化疗耐药敏感性等方面具有重要作用。然而mt2a调控IKB-a具体机制尚不清楚。通过序列结构分析,发现IκB-α基因启动子区域有一锌指结构样基序(]motif),可能是锌指蛋白Kruppel家族成员,骨髓锌指1(Myeloid Zinc-Finger 1, MZF1)特异结合DNA并发挥转录调控的重要结构域。我们据此推测胃癌中MZF1可能作为一新的抑癌基因,与mt2a木目互作用,是mt2a调控IκB-α的一个重要分子靶点。本研究通过检测分析胃癌细胞和组织中的MZF1差异表达与表观调控,研究MZF1的生物学功能,探讨MZF1与mt2a的相互作用关系,以期阐明mt2a/MZF1-NF-kB通路在DATS和DOC抗胃癌效应中的分子作用基础,为胃癌患者的个体化精准诊疗提供有效的分子靶标。材料与方法采用RT-PCR、qPCR和Western Blot等检测分析胃癌组织细胞中MZF1的表达,以及过表达或干扰mt2a或MZF1后的MZF1与mt2a表达变化;通过甲基化特异性PCR、硫化测序及染色质免疫共沉淀-qPCR分析胃癌组织细胞中MZF1基因的DNA甲基化及组蛋白修饰状态;应用mtT检测、细胞迁移和侵袭等研究MZF1对胃癌细胞生长、迁移和侵袭的影响,探讨MZF1在胃癌中的生物学功能。借助免疫共沉淀、染色质免疫共沉淀及细胞免疫荧光等技术分析mt2a与MZF1的相互关系。结果1、在人胃癌细胞及组织中,MZF1普遍低表达或不表达,启动子区CpG岛呈现DNA高甲基化状态,并伴随着组蛋白乙酰化修饰降低;去甲基化药物5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-aza-2’-deoxycytidine,5-Aza)以及去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A(Trichostation A, TS A)处理可逆转上调MZF1在胃癌细胞中的表达。2、在人胃癌细胞系BGC823中过表达MZF1,可导致细胞的增殖能力、侵袭和迁移能力较空载对照极显著降低(Pmt2a或经DATS和DOC诱导处理,均可检测出MZF1与mt2a的相互结合;共聚焦荧光显微镜观察显示两者共定位于细胞核中;染色质免疫共沉淀分析提示MZF1与mt2a蛋白均与IκB-α基因的启动子区结合。4、在BGC823细胞中,过表达mt2a, MZF1的表达上调;在过表达mt2a的BGC823细胞中干扰mt2a后,MZF1的表达降低;但在过表达mt2a的细胞中干扰MZF1,mt2a的表达未见明显变化。5、在BGC823, DATS和DOC可诱导mt2a和MZF1的表达;干扰mt2a, DATS和DOC对MZF1表达的诱导作用受到明显抑制。结论1、在胃癌细胞中,MZF1及mt2a呈现表观沉默现象并受其启动子区DNA甲基化及组蛋白乙酰化调控。2、MZF1抑制胃癌细胞的生长、迁移和侵袭。3、在胃癌细胞中,MZF1可与mt2a相互作用,并通过调控IκB-α的转录表达发挥抑癌基因样作用。4、MZF1的表达可能受到mt2a的调控。5、DATS及DOC可表观上调MZF1的表达,进而发挥其抗肿瘤作用。

关键词：胃癌 MZF1 mt2a 表观沉默抑癌基因

金属硫蛋白2A下调通过与p53相互作用促进胰腺癌的发展

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金属硫蛋白2A下调通过与p53相互作用促进胰腺癌的发展

作者：贾超中国医科大学

学位级别：硕士

目的:胰腺癌(Pancreatic cancer,PC)是目前世界上恶性程度最高的肿瘤之一,因为它具有极强的侵袭迁移能力以及增殖能力,其5年生存率不足5%。胰腺癌的发生发展过程复杂,时至今日胰腺癌相关发病机制依旧没有被研究透彻。因此,探索新的分子... 详细信息

目的:胰腺癌(Pancreatic cancer,PC)是目前世界上恶性程度最高的肿瘤之一,因为它具有极强的侵袭迁移能力以及增殖能力,其5年生存率不足5%。胰腺癌的发生发展过程复杂,时至今日胰腺癌相关发病机制依旧没有被研究透彻。因此,探索新的分子生物学标志物用以揭示其对胰腺癌生物学行为的影响并抑制其恶性发生与进展具有重大意义。本研究旨在讨论金属硫蛋白2A(Metallothionein 2A,mt2a)通过调控肿瘤相关基因p53影响胰腺癌的生物学功能。研究方法:组织水平:免疫组织化学、免疫印迹及实时定量PCR检测mt2a在胰腺癌中表达及其临床病理学意义。细胞水平:选取野生型p53胰腺癌细胞SW1990与Capan-2以及突变型p53胰腺癌细胞Miapaca-2,用mt2a以及p53小干扰RNA进行转染,转染构建mt2a以及p53沉默细胞系,通过免疫印迹检测其对肿瘤相关基因蛋白的表达的影响。通过Transwell细胞体外侵袭实验、细胞mtT测试、化疗药物干预等检测mt2a对胰腺癌细胞生物学行为的影响及其相关机制。结果:组织水平:1、mt2a在胰腺癌组织中的表达水平低于配对的癌旁组织。免疫组织化学检测54例成对的胰腺癌及癌旁组织石蜡切片,mt2a在癌旁组织的表达水平明显高于癌组织中的表达(P=0.024);免疫印迹检测16例配对的胰腺癌组织与癌旁组织蛋白样,mt2a在癌旁的表达高于癌组织中的表达(Pmt2a与突变型p53表达无相关性。2、mt2a与肿瘤大小(P=0.019)和第8版T分期(P=0.006)呈负相关,mt2a高表达患者比低表达患者具有更好的整体生存率。细胞水平:1、mt2a沉默导致野生型p53蛋白表达下调,沉默野生型p53同样导致mt2a表达下降,mt2a与突变型p53蛋白表达没有相关性。2、mt2a沉默在体外使胰腺癌侵袭迁移能力提升,mt2a过表达后结果相反。3、mt2a沉默在体外使胰腺癌的细胞增殖能力提升、化疗敏感性降低,mt2a过表达后结果相反。结论:在本研究中,mt2a与胰腺癌患者临床病理学参数及预后密切相关,mt2a高表达的患者有着更好的总体生存率以及临床病理学参数。体外胰腺癌细胞中mt2a的沉默会导致胰腺癌肿瘤细胞侵袭迁移能力上升、细胞增殖能力上升以及化疗敏感性降低,mt2a过表达结果与之相反。mt2a与野生型p53在胰腺癌细胞中存在蛋白质层面的相互作用,mt2a可能通过直接或者间接与p53相互作用影响胰腺癌细胞的恶性肿瘤功能学。

关键词： mt2a 胰腺癌 p53 侵袭迁移增殖

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作者：赵天罡吉林大学

学位级别：硕士

药物性肝损伤(DILI)的发生率呈现逐年递增的趋势。已上市应用的化学药或生物药中有1100种以上具有潜在的肝毒性,是人类健康的重要威胁之一。丙戊酸(VPA)是临床上应用最广泛的一线抗癫痫药,在人体内主要经肝脏代谢,具有血药浓度和用药剂... 详细信息

药物性肝损伤(DILI)的发生率呈现逐年递增的趋势。已上市应用的化学药或生物药中有1100种以上具有潜在的肝毒性,是人类健康的重要威胁之一。丙戊酸(VPA)是临床上应用最广泛的一线抗癫痫药,在人体内主要经肝脏代谢,具有血药浓度和用药剂量的相关性较差,治疗窗较窄的特点。肝损伤是VPA最主要的毒副作用。大量研究表明,VPA引起的肝损伤与其经细胞色素P450(CYP450)的氧化产生的毒性代谢产物4-ene VPA和2,4-diene VPA有关,这些毒性代谢产物能抑制线粒体β-氧化,引起活性氧簇(Reactive Oxygen Species,ROS)水平上升和甘油三酯的堆积,从而导致肝脂质性病变、肝细胞死亡。引发炎症、肝脂质化,严重者甚至导致死亡。因此,VPA毒性代谢物和ROS的大量产生在VPA诱发的肝损伤中发挥了关键作用。由于VPA引发肝损伤的不可预知性,临床急需找到预判DILI发生的标志物。研究表明VPA引起的肝损伤与遗传因素密切相关。目前的研究热点多集中于VPA代谢相关酶的基因多态性与肝损伤的关系。基于氧化压力在VPA肝损伤中重要作用,清除ROS的抗氧化酶的基因多态性可能通过改变抗氧化酶的活性影响肝损伤的易感性,但相关研究鲜有报道。本课题主要探讨清除ROS的谷胱甘肽转移酶(GSTP1)、NAD(P)H醌氧还原酶(NQO1)、金属硫蛋白酶(mt2a)、对氧磷酶(PON1)和谷胱甘肽过氧化物酶1(GPX1)基因多态性对VPA引发肝损伤的影响。首先经过多步优化,我们建立了同时分析GSTP1 rs1695,NQO1 rs1800566,mt2a rs10636,PON1 rs662和rs854560,GPX1 rs1050450和rs1800668的7个基因多态性位点的SNaPshot分析方法。然后分析了这些抗氧化酶基因多态性对96例癫痫患者服用VPA后肝损伤易感性的影响。结果表明,这7个SNPs位点在非肝损伤组和肝损伤组之间的分布频率不存在显著性差异。为了更深入地了解这些基因多态性在VPA代谢过程中的作用,我们进一步分析这7个SNPs位点与癫痫患者VPA用药剂量、血药浓度和剂量调整血药浓度的关系。结果表明在非肝损伤组中,GPX1 rs1800668突变可以明显提高患者调整血药浓度(P=0.035),PON1 rs854560突变可以明显降低患者的血药浓度(P=0.038)。在肝损伤组中,GSTP1 rs1695突变型携带者的VPA血药浓度明显低于野生型携带者(P=0.043)。说明这些基因型与VPA的代谢可能存在相关性,但由于样本数量较少,此结论还需更大的样本量进行验证。由于肝损伤组和非肝损伤组之间男女比例差别较大,本课题进一步分析了在男性和女性癫痫患者抗氧化酶基因多态性对肝损伤及对VPA代谢的影响。结果表明位于GPX1、GSTP1、NQO1和PON1的6个基因多态性位点频率分布对于肝损伤的易感性和VPA的代谢并无显著关联。但是女性癫痫患者mt2a rs10636纯合突变型在VPA用药剂量上明显高于野生型和杂合突变型(P=0.000&0.034),存在显著性差异。总之,我们成功地建立了同时分析GPX1、GSTP1、NQO1、mt2a和PON1的7个SNPs的SNaPshot方法。应用此方法发现这些抗氧化酶的基因多态性与VPA引起的肝损伤并无显著关系。由于受样本量的限制,它们对VPA用药剂量、血药浓度和剂量调整后血药浓度的影响仍需更大的样本量来进一步验证。

关键词：肝损伤基因多态性 SNaPshot 丙戊酸氧化压力 GPX1 PON1 GSTP1 mt2a

用酵母双杂交系统筛选与nicastrin相互作用蛋白的初步研究

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用酵母双杂交系统筛选与nicastrin相互作用蛋白的初步研究

作者：黄秀梅厦门大学

学位级别：硕士

NCT(nicastrin)蛋白是一种与阿尔茨海默氏症(Alzheimer’s Disease,AD)密切相关的蛋白。NCT是γ-分泌酶复合体的组成成分之一,它在γ-分泌酶的组装和成熟中扮演重要的角色,它可调节γ-分泌酶复合体其他组分的稳定、转运等过程。NCT的主... 详细信息

NCT(nicastrin)蛋白是一种与阿尔茨海默氏症(Alzheimer’s Disease,AD)密切相关的蛋白。NCT是γ-分泌酶复合体的组成成分之一,它在γ-分泌酶的组装和成熟中扮演重要的角色,它可调节γ-分泌酶复合体其他组分的稳定、转运等过程。NCT的主要功能是通过γ-分泌酶复合体参与阿尔茨海默氏病中Aβ生成和Notch信号系统转导。另外,也有报道NCT还参与了神经发生的过程。但是,这些研究结果还不足以充分阐明它在生理活动中的功能及其作用机制。我们采用酵母双杂交法筛选与它有相互作用的蛋白,以便更好地认识和理解NCT的正常生理功能的作用。以NCT为诱饵蛋白筛选人胎脑文库后,我们得到19个阳性克隆。阳性克隆测序并将测序结果用BLAST分析发现,7、8号阳性克隆的氨基酸序列分别和人金属硫蛋白mt2a (metallothionein -2A)、THAP7 (THAP domain-containing protein 7) 2种蛋白具有高度的同源性。β-半乳糖苷酶活性测定说明这2种蛋白在酵母AH109中可以与NCT发生相互作用。在进一步的实验中,我们用免疫共沉淀实验证明外源性NCT全长和mt2a蛋白在293T细胞表达后可以发生相互作用。通过以上实验,我们发现筛选出的mt2a蛋白在293T细胞中和NCT之间存在相互作用。研究表明mts蛋白家族在神经病理学方面起重要的作用。当神经发生炎症时mt-1和mt-2的表达会被明显地上调,并发现mt-1和mt-2在淀粉样斑周围的细胞中的表达量急剧上升。由此推测mt2a可能与阿尔茨海默氏症淀粉样斑的形成有关;因此,NCT与它存在相互作用这一发现有助于进一步了解NCT的生理功能。本文的创新之处: 应用酵母双杂交系统首次从真核细胞体内筛选到2种和NCT相互作用的蛋白,并证明mt2a可以在293T细胞中与NCT发生相互作用,为进一步研究NCT的功能及其在AD中的病理机制打下一个坚实的基础。

关键词：酵母双杂交阿尔茨海默氏症 NCT mt2a THAP7