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中国癌症杂志 2011年第8期21卷 589-594页

作者：徐延昭田子强张小河何明张月峰河北医科大学第四医院胸外科河北石家庄050011

背景与目的:金属硫蛋白(metallothionein,mt)-3具有细胞生长抑制活性,是目前已知唯一的具有独特生理功能的mt亚型。mt-1E是mt-1的1个亚型,有文献报道mt-1蛋白的表达量与食管癌的恶性程度呈正相关。本研究拟探讨mt-3和mt-1E基因转染对食... 详细信息

背景与目的:金属硫蛋白(metallothionein,mt)-3具有细胞生长抑制活性,是目前已知唯一的具有独特生理功能的mt亚型。mt-1E是mt-1的1个亚型,有文献报道mt-1蛋白的表达量与食管癌的恶性程度呈正相关。本研究拟探讨mt-3和mt-1E基因转染对食管癌细胞株增殖、细胞周期及凋亡的影响。方法:采用阳离子脂质体法,将已构建好的mt-3、mt-1E及其空载体4种质粒转染食管癌Eca-109和TE13细胞株;荧光显微镜判断转染效率,RT-PCR检测目的基因的表达,四甲基偶氮唑蓝(mtT)法检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞周期与细胞凋亡。结果:转染mt-3和mt-1E基因的食管癌细胞株均有外源目的基因相应mRNA的高表达。转染mt-3基因的Eca-109和TE13细胞株,其增殖能力受到明显抑制(Pmt-1E基因的Eca-109和TE13细胞株,其增殖能力、细胞周期及凋亡率变化均不明显(P>0.05)。结论:上调mt-3基因表达能抑制食管癌细胞增殖,促进其凋亡,这可能是通过阻滞肿瘤细胞的生长周期来实现的。而mt-1E基因可能在食管癌细胞的增殖过程中作用不明显。

关键词： mt-3 mt-IE 食管癌基因转染流式细胞术细胞增殖细胞周期

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全麻药丙泊酚通过上调mt-3减轻沙鼠全脑缺血再灌注损伤

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中国老年学杂志 2014年第5期34卷 1302-1304页

作者：韩彬赵俊莺向富森舒雅西安医学院第一附属医院麻醉科陕西西安710077

目的探讨全麻药丙泊酚(Propofol)通过上调mt-3减轻沙鼠全脑缺血再灌注损伤。方法选取健康雄性清洁级蒙古沙土鼠30只,用随机数列表分为假手术组、模型组和丙泊酚组。检测各组大鼠脑组织神经功能评分、mt-3 mRNA的表达量、海马组织mt-3的... 详细信息

目的探讨全麻药丙泊酚(Propofol)通过上调mt-3减轻沙鼠全脑缺血再灌注损伤。方法选取健康雄性清洁级蒙古沙土鼠30只,用随机数列表分为假手术组、模型组和丙泊酚组。检测各组大鼠脑组织神经功能评分、mt-3 mRNA的表达量、海马组织mt-3的蛋白表达量和大鼠脑组织超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)的量。结果 Propofol可以增加全脑缺血再灌注大鼠的Garcia JH评分、mt-3基因mRNA的表达水平和蛋白量的表达、脑组织中SOD水平;降低MDA和NO水平。结论 Propofol通过上调mt-3减轻沙鼠全脑缺血再灌注损伤。

关键词：丙泊酚 mt-3 全脑缺血再灌注

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mt-3和mt-1E基因转染食管鳞癌细胞株对其细胞周期的影响

MT-3和MT-1E基因转染食管鳞癌细胞株对其细胞周期的影响

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作者：徐延昭河北医科大学

学位级别：硕士

目的:食管癌是目前对人类健康和生命构成严重威胁的恶性肿瘤之一,其病死率在世界范围居恶性肿瘤的第七位。我国是食管癌的高发国家,在我国恶性肿瘤中其发病率居第四位,特别是河北南部、河南北部及山西的部分地区为高发地区。因此,深入... 详细信息

目的:食管癌是目前对人类健康和生命构成严重威胁的恶性肿瘤之一,其病死率在世界范围居恶性肿瘤的第七位。我国是食管癌的高发国家,在我国恶性肿瘤中其发病率居第四位,特别是河北南部、河南北部及山西的部分地区为高发地区。因此,深入研究食管癌的发病机制,以有效地对其进行预防和治疗有着非常重要的意义。研究表明,食管癌的发生发展并非单个分子事件,而是一个多因素、多阶段、长时间的多步骤过程,涉及多个癌基因和抑癌基因的改变以及细胞调控机制的异常。有关mt-1和mt-2基因的研究已有很多,有文献报道mt-1和mt-2基因在食管癌组织中呈高表达状态。而mt-3基因研究的较少,已知mt-3基因是细胞内一种金属硫蛋白的编码基因,不仅具有许多重要的生理功能,还可以抑制细胞增殖。我们的前期研究显示在食管癌组织中广泛存mt-3基因的超甲基化,而且这种超甲基化可导致mt-3表达水平的下调。基于以上研究,本实验采用基因转染技术,研究mt-3和mt-1E基因转染人食管鳞癌Eca-109和TE13细胞株后对其细胞周期的影响。方法:1选取食管鳞癌Eca-109和TE13细胞株,用RPMI1640培养基在六孔板中进行培养,在细胞汇合达70%后,准备进行细胞转染。2分别取含有EX-T3737-M03-mt-3、EX-T3737-M03、EX-T2598-M56- mt-1E及EX-T2598-M56四种质粒DNA的大肠杆菌菌株,经过夜培养后提取质粒DNA,并测定其浓度与纯度;然后配制质粒DNA/脂质体复合物,并设空白对照,进行细胞转染。3将以上质粒DNA/脂质体复合物与两种细胞株共同培养,分别在24h、48h、72h用荧光显微镜观察质粒DNA中荧光蛋白在细胞内的表达情况,并计算细胞转染效率,以确定质粒DNA在细胞内最佳转染时间。4在质粒DNA转染Eca-109和TE13细胞株48h后,分别收集六孔板中各转染组细胞及空白对照组细胞,应用流式细胞术检测细胞周期的变化情况。5所有计量资料用均值±标准差表示,两样本均数比较选择t检验或t’检验,以P3.0统计软件完成。结果:1四种质粒DNA转染食管鳞癌Eca-109及TE13细胞株后,在24h、48h、72h荧光显微镜观察到各转染组均见有荧光标记。EX-T3737-M03-mt-3和其空载体EX-T3737-M03转染组呈绿色荧光;EX-T2598-M56-mt-1E和其空载体EX-T2598-M56转染组呈红色荧光。转染48h后细胞荧光表达强度最强,约占细胞总数的80%,提示转染成功,且效率较高。2 EX-T3737-M03-mt-3和EX-T3737-M03在转染Eca-109和TE13细胞株48h后,其G0/G1期的细胞比例分别为70.97±1.58%、53.20±2.13% (P32±1.23%、31.50±1.59%(P30±1.38%(P>0.05)。3 EX-T2598-M56-mt-1E和EX-T2598-M56在转染Eca-109和TE13细胞株48h后,其G0/G1期的细胞比例分别为54.58±2.38%、53.02±2.16% (P>0.05),S期的细胞比例分别为30.15±1.77%、31.90±1.71%(P>0.05),G2/M期的细胞比例分别为15.27±1.06%、15.08±0.78%(P>0.05)。4 EX-T3737-M03-mt-3和EX-T2598-M56-mt-1E在转染Eca-109和TE13细胞株48h后,其G0/G1期的细胞比例分别为70.97±1.58%、54.58±2.38%(P32±1.23%、30.15±1.77% (P0.05)。结论:1 mt-3基因在转染食管鳞癌Eca-109和TE13细胞株后,使G0/G1期细胞比例明显增多,S期细胞比例明显减少,推测mt-3基因可能通过改变细胞周期来抑制食管癌细胞的增殖。2 mt-1E基因在转染食管鳞癌Eca-109和TE13细胞株后,对细胞周期影响不明显,推测mt-1E基因可能在食管癌细胞的增殖过程中作用不明显。

关键词：食管鳞癌转染 mt-3 mt-1E 细胞周期流式细胞术

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mt-3和mt-1E基因转染食管癌细胞株Eca-109对其生长的影响

MT-3和MT-1E基因转染食管癌细胞株Eca-109对其生长的影响

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作者：马国锋河北医科大学

学位级别：硕士

目的:食管癌是常见的消化道恶性肿瘤之一,对人类健康有着严重威胁,世界范围其病死率居恶性肿瘤的第七位[1]。我国是食管癌的高发国家,特别是太行山区为高发地区。探索食管癌的发病机制,进而提出有效的预防和治疗措施,具有深远的理论和... 详细信息

目的:食管癌是常见的消化道恶性肿瘤之一,对人类健康有着严重威胁,世界范围其病死率居恶性肿瘤的第七位[1]。我国是食管癌的高发国家,特别是太行山区为高发地区。探索食管癌的发病机制,进而提出有效的预防和治疗措施,具有深远的理论和临床意义。已有研究表明食管癌的发生发展是一个多因素、多阶段、多步骤的过程,涉及环境、个人习惯、多种癌基因的激活与抑癌基因的失活以及细胞调控机制异常等多种因素[2,3,4]。金属硫蛋白(metallothionein, mt)是一类低分子量富含半胱氨酸的金属结合蛋白质。具有清除体内自由基、重金属离子解毒、参与体内微量元素的代谢等作用。mt-3又称神经生长抑制因子(nerve growth inhibitory factor, GIF)具有神经生长抑制活性。有文献报道mt-1和mt-2在食管癌组织中呈高表达状态。而mt-3的研究相对较少。我们的前期研究显示在食管癌组织中存在mt-3基因广泛的超甲基化,而且超甲基化可导致mt-3表达水平的下调。为继续研究mt在食管癌中的作用,本实验采用基因转染、RT-PCR技术,研究mt-3和mt-1E基因在转染食管鳞癌细胞株Eca-109后,表达水平的改变,及对细胞生长的影响。方法:1分别取含有EX-T3737-M03-mt-3、EX-T2598-M56-mt-1E及EX-T2598-M56三种质粒的大肠杆菌菌株,前两种质粒分别含有mt-3基因、mt-1E基因,后一种质粒为空载体。大肠杆菌经过夜培养后使用质粒提试剂盒(TIANGEN公司)提取质粒,并测定其浓度与纯度。2选取食管鳞癌Eca-109细胞株,用RPMI1640培养基在六孔板中进行培养,在细胞汇合达70%后,进行细胞转染。3应用阳离子脂质体转染法将质粒转染Eca-109细胞,在质粒转染Eca-109细胞48h后,分别收集六孔板中各转染组细胞及空白对照组细胞,进行细胞计数。4然后提取上述细胞的mRNA,应用RT-PCR法对mt-1E、mt-3的mRNA表达情况进行研究。5应用SPSS13.0统计软件对所得数据进行分析,统计方法采用方差分析及LSD-t检验,检验标准取a=0.05,以Pmt-1E质粒与EX-T2598-M56质粒转染的细胞发出红色荧光,转染EX-T3737-M03-mt-3质粒的细胞发出绿色荧光。有荧光标记占细胞总数的80%以上,提示转染成功。2三组转染组细胞计数均少于空白对照组(Pmt-1E组细胞计数较空载体转染组无明显差异,P>0.05,无统计学意义。转染mt-3组细胞计数少于其它三组(P3转染mt-1E组mt-1E mRNA表达量大于空载体转染组及空白对照组(Pmt-3组之间mt-1E mRNA表达量无显著性差异(P>0.05),无统计学意义。4转染mt-3组mt-3 mRNA表达量大于其它三组(Pmt-1E组之间mt-3 mRNA表达量无显著性差异(P>0.05),无统计学意义。结论:1 mt-1E、mt-3基因成功的转染Eca-109细胞并进行了基因表达。2 mt-1E基因转染进入Eca-109细胞并成功表达后,对细胞生长的影响不明显,表明mt-1E基因在食管癌的发病过程中作用不明显。3 mt-3基因转染进入Eca-109细胞并成功表达后,表现出抑制细胞增殖的作用。提示mt-3基因可以抑制食管癌细胞生长。4 mt-1E或mt-3基因转染进入Eca-109细胞并成功表达后,并不引起另一种基因表达水平的明显变化,表明一种mt亚型基因的表达不会影响另一种亚型基因的表达,mt各亚型在食管癌组织中的表达可能有各自不同的机制。

关键词：食管鳞癌转染 mt-3 mt-1E 细胞计数 RT-PCR

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mt-3基因表达在食管胸中段鳞癌中转移与预后的关系

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河北医药 2017年第12期39卷 1765-1767页

作者：王海军许峰陆欣王建民姜玉芳国建飞张少峰刘聚良河北省邢台市人民医院胸外科 054001 河北省邢台市人民医院精神心理科 054001 河北省邢台市人民医院血液科 054001 河北省邢台市人民医院神经内科 054001

目的讨论mt-3基因在食管胸中段鳞癌中的表达、术后病理及患者预后指标中的关系。方法对2009至2011年手术切除的96例食管胸中段鳞癌患者进行回顾性研究。使用免疫组织化学染色方法检测mt-3基因在肿瘤组织中的表达。使用χ~2检验判断相关... 详细信息

目的讨论mt-3基因在食管胸中段鳞癌中的表达、术后病理及患者预后指标中的关系。方法对2009至2011年手术切除的96例食管胸中段鳞癌患者进行回顾性研究。使用免疫组织化学染色方法检测mt-3基因在肿瘤组织中的表达。使用χ~2检验判断相关性、Kaplan-meier法进行生存分析、Log-rank检验判断生存差异性,采用Cox比例风险模型行多因素分析判断独立预后因素。结果 96例标本中,伴有mt-3基因阳性表达41例,占总例数的41.28%。食管胸中段鳞状细胞癌组织中mt-3的阴性表达与肿瘤的分化程度(P=0.029)、T分期(P=0.001)和淋巴结转移个数(P=0.005)相关。97例病例中3年生存率为45.9%,其中mt-3基因表达阴性患者为20.1%,mt-3基因表达阳性患者为52.6%。两者比较差异有统计学意义(P=0.01)。Cox回归分析显示肿瘤分期以及mt-3基因阴性表达是食管胸中段癌术后的预后危险因素。结论在食管胸中段癌中mt-3基因的表达降低,与肿瘤的分化程度,T分期和淋巴结转移个数相关。mt-3基因表达阳性较阴性表达患者的3年生存率明显提高。mt-3基因可能作为评估食管鳞状细胞癌手术预后的分子生物指标。

关键词：食管鳞状细胞癌 mt-3 预后免疫组化

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胶质细胞及其相关蛋白在癫痫中的作用机制研究

胶质细胞及其相关蛋白在癫痫中的作用机制研究

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作者：刚伟河北医科大学

学位级别：硕士

癫痫(epilepsy)是一种慢性反复发作性短暂脑功能失调综合征,以脑神经元异常放电引起反复痫性发作为特征。癫痫在全球不同国家都是发病率很高的神经系统疾病。大约30%的癫痫患者正规应用抗癫痫药物治疗后仍不能中止发作,每月发作≥4次,... 详细信息

癫痫(epilepsy)是一种慢性反复发作性短暂脑功能失调综合征,以脑神经元异常放电引起反复痫性发作为特征。癫痫在全球不同国家都是发病率很高的神经系统疾病。大约30%的癫痫患者正规应用抗癫痫药物治疗后仍不能中止发作,每月发作≥4次,称为难治性癫痫(intractable epilepsy,IE)或耐药性癫痫。其中又以颞叶癫痫患者居多。近年来,以蛋白质组学为基础的方法研究为发现难治性癫痫新的药物靶点带来更大的可能。其中,数据非依赖性采集(DIA,Data independent acquisition)定量蛋白质组学是一种靶向蛋白组学技术,通过选定质荷比(m/z)范围内的所有离子进行碎裂和二级质谱分析,可以高效测定复杂样品中丰富度极低的蛋白分子,从而提高定量分析的可信度,具有更高的定量准确性和可重复性。目前越来越多的研究发现,神经胶质细胞功能异常可能引起中枢神经系统兴奋与抑制功能失调、神经元细胞微环境改变等,从而诱发癫痫。神经胶质细胞在癫痫的易感性和癫痫的发展中起重要作用,是治疗癫痫和其他中枢神经系统疾病的潜在药物靶点。本研究通过药物难治性颞叶癫痫患者手术取得的脑组织标本进行DI A蛋白组学分析,通过比较患者致痫灶核心区、边缘区及非癫痫患者颞叶切除组织蛋白质表达谱,发现众多表达显著差异的蛋白。考虑到胶质细胞在癫痫发病机制中的重要作用,本研究将获得的癫痫患者与非癫痫患者412个差异表达蛋白与Uniprot蛋白质数据库中人类星形胶质细胞、小胶质细胞和少突胶质细胞相关蛋白质数据进行比对,在三种胶质细胞数据中各匹配到一种差异表达蛋白,分别为mt-3、SORT1和FYN。本研究对三种胶质细胞及mt-3、SORT1和FYN三种相关蛋白在癫痫疾病中的作用进行了探讨。目的:探究胶质细胞及mt-3、SORT1和FYN三种相关蛋白分子在癫痫疾病中的作用。方法:1.将药物难治性颞叶癫痫患者致痫灶核心区、边缘区及非癫痫病人颞叶切除组织进行DIA蛋白组学分析,筛选各组间差异表达蛋白及癫痫患者与非癫痫患者差异表达蛋白并对其进行生物信息学分析。2.癫痫患者与非癫痫患者差异表达蛋白与Uniprot数据库中人类三种胶质细胞蛋白质数据进行比对,筛选出与胶质细胞有关的差异表达蛋白。3.利用免疫组化与免疫荧光技术对2中筛选出的差异表达蛋白在人脑组织切片进行定性和定量研究。4.利用sh RNA AAV9病毒沉默SORT1基因,在小鼠癫痫模型中探究SORT1在对癫痫易感性的影响。结果:1.经DIA蛋白组学分析在致痫灶核心区、边缘区及非癫痫病人颞叶组织样本中均鉴定出五千多种蛋白质,蛋白质聚类分析显示这些蛋白在三组间分类清晰,在组内表达较一致。2.根据差异表达倍数(1.2倍或2倍)和统计学阈值P3.癫痫患者与非癫痫患者差异表达蛋白与Uniprot蛋白质数据库中人星形胶质、小胶质细胞和少突胶质细胞相关蛋白数据作比对,分别发现一个与上述三种胶质细胞相关的蛋白:与星型胶质细胞相关蛋白-金属硫蛋白-3(Metallothionein-III,mt-3)、与小胶质细胞相关蛋白-分拣蛋白1(Sortilin 1,SORT1)以及与少突胶质细胞相关蛋白-酪氨酸蛋白激酶(Src family tyrosine kinase,FYN)。与非癫痫患者相比,癫痫患者mt-3和FYN蛋白表达上调而SORT1表现为下调,三种胶质细胞相关蛋白在脑组织切片上的定量表达与蛋白组学分析数据较为一致。4.在人脑组织石蜡切片中发现星形胶质细胞和小胶质细胞在癫痫患者尤其是致痫灶核心区异常增生,少突胶质细胞标记蛋白(MBP,Myelin Basic Protein)的表达提示在致痫灶核心区有髓鞘严重缺失情况。***1基因沉默小鼠海马脑区,癫痫发作程度和频率下降,癫痫易感性降低。结论:1.胶质细胞及其相关分子可能参与了癫痫发生、发展的病理过程。***-3、SORT1与FYN三种胶质细胞相关蛋白分子可能是胶质细胞参与癫痫病理过程的分子机制之一。***1基因沉默可以降低小鼠癫痫易感性。

关键词：癫痫蛋白组学胶质细胞 mt-3 SORT1 FYN

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基于人源脑组织蛋白质组学技术的多组间联合筛选癫痫致病及发作关键分子研究

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中国药理学与毒理学杂志 2023年第7期37卷 488-488页

作者：周娜静邸阳刚伟张迪曲凯天李文玲张海林河北医科大学基础医学院药理学教研室

目的通过DIA定量蛋白质组学技术筛选与药物难治性伴有海马硬化的颞叶内侧型癫痫（TLE）相关的关键蛋白质，并探讨其参与癫痫发生的可能机制。方法本研究采用DIA定量蛋白质组学技术对手术切除的难治性TLE癫痫组织病灶核心区、灶旁区以... 详细信息

目的通过DIA定量蛋白质组学技术筛选与药物难治性伴有海马硬化的颞叶内侧型癫痫（TLE）相关的关键蛋白质，并探讨其参与癫痫发生的可能机制。方法本研究采用DIA定量蛋白质组学技术对手术切除的难治性TLE癫痫组织病灶核心区、灶旁区以及非癫痫非肿瘤手术切除颞叶组织的蛋白质表达谱变化进行了多组间联合分析。通过电生理学，免疫组织化学、免疫荧光技术、动物癫痫行为学检测等手段，验证与细胞兴奋性密切相关的Kv3.2分子及分别与3种胶质细胞功能密切相关的Sort1,mt-3和Fyn分子表达。结果免疫组织化学、免疫荧光结果提示Kv3.2和Sort1在癫痫患者病灶区的表达明显降低；而mt-3和Fyn的表达则明显升高；Kv3.2和Sort1在C57小鼠海马CA1区表达降低。电生理学结果提示，应用膜片钳技术，在whole-cell模式下，Kv3.2在C57小鼠海马CA1区表达降低可引起同区域GABA能神经元兴奋性降低，导致小鼠脑电异常增加，提高了小鼠的癫痫易感性。结论 Kv3.2和Sort1表达的降低，mt-3和Fyn表达的升高可能参与了癫痫的致病和发作。

关键词：颞叶内侧型癫痫 DIA Kv3.2 Sort mt-3 Fyn

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