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LBP通过mst1调控非酒精性脂肪性肝纤维化相关基因和蛋白的表达

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LBP通过Mst1调控非酒精性脂肪性肝纤维化相关基因和蛋白的表达

作者：梁涵子宁夏医科大学

学位级别：硕士

研究目的1.证实mst1能够调控非酒精性脂肪性肝纤维化相关基因和蛋白的表达;2.证实LBP可能通过靶向mst1调控非酒精性脂肪性肝纤维化相关基因和蛋白的表达而为临床治疗提供新的策略和靶点。研究方法1.选用人肝星状细胞LX-2与人肝癌细胞Hep... 详细信息

研究目的1.证实mst1能够调控非酒精性脂肪性肝纤维化相关基因和蛋白的表达;2.证实LBP可能通过靶向mst1调控非酒精性脂肪性肝纤维化相关基因和蛋白的表达而为临床治疗提供新的策略和靶点。研究方法1.选用人肝星状细胞LX-2与人肝癌细胞Hep G2,分别给予100μM、200μM、400μM棕榈酸(PA)处理及2 ng/m L、5 ng/m L、10 ng/m L转化生长因子-β1(TGF-β1)处理,均处理24 h,随后利用MTT细胞毒性实验检测细胞存活率,通过油红O染色检测细胞脂肪变性,通过Western blot实验与q RT-PCR实验检测细胞纤维化因子α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及Ⅰ型胶原蛋白(CollagenⅠ)的蛋白及m RNA表达水平。2.采用si mst1转染正常培养或TGF-β1诱导的LX-2细胞24 h,通过Western blot实验对细胞中mst1、p Smad2/3、Smad2/3、α-SMA及CollagenⅠ的蛋白表达水平进行检测;通过q RT-PCR实验对细胞中mst1、Smad3、CollagenⅠ、Smad4、α-SMA的m RNA表达水平进行检测。3.采用pCDH-mst1过表达质粒转染正常培养或TGF-β1诱导的LX-2细胞24 h,通过Western blot实验对细胞中mst1、p Smad2/3、Smad2/3、α-SMA及CollagenⅠ的蛋白表达水平进行检测;通过q RT-PCR实验对细胞中mst1、Smad3、CollagenⅠ、Smad4、α-SMA的m RNA表达水平进行检测。4.给予不同剂量LBP干预正常培养或TGF-β1诱导的LX-2细胞24 h,通过MTT细胞毒性实验检测细胞存活率;通过Western blot实验对细胞中mst1、CollagenⅠ及α-SMA的蛋白表达水平进行检测;通过q RT-PCR实验对细胞中mst1、CollagenⅠ与α-SMA的m RNA表达水平进行检测。5.给予相同剂量LBP干预正常培养或TGF-β1诱导的LX-2细胞,在不同时间点收集细胞进行分析,通过MTT细胞毒性实验检测细胞存活率;通过Western blot实验对细胞中mst1、CollagenⅠ及α-SMA的蛋白表达水平进行检测;通过q RT-PCR实验对细胞中mst1、CollagenⅠ与α-SMA的m RNA表达水平进行检测。6.采用LBP干预si mst1转染TGF-β1诱导的LX-2细胞24 h,通过MTT细胞毒性实验检测细胞存活率;通过Western blot实验对细胞中mst1、p Smad2/3、Smad2/3、α-SMA及CollagenⅠ的蛋白表达水平进行检测;通过q RT-PCR实验对细胞中mst1、Smad3、CollagenⅠ、Smad4、α-SMA的m RNA表达水平进行检测。7.采用LBP干预pCDH-mst1过表达质粒转染TGF-β1诱导的LX-2细胞24 h,通过MTT细胞毒性实验检测细胞存活率;通过Western blot实验对细胞中mst1、p Smad2/3、Smad2/3、α-SMA及CollagenⅠ的蛋白表达水平进行检测;通过q RT-PCR实验对细胞中mst1、Smad3、CollagenⅠ、Smad4、α-SMA的m RNA表达水平进行检测。研究结果1.分别采用PA和TGF-β1诱导LX-2细胞与Hep G2细胞,成功构建脂肪性肝纤维化模型使用100μM、200μM、400μM PA及2 ng/m L、5 ng/m L、10 ng/m L TGF-β1分别诱导LX-2细胞、Hep G2细胞24 h,MTT实验结果显示PA、TGF-β1诱导Hep G2、LX-2细胞后细胞存活率均随诱导因子浓度的升高而显著降低(P1),其中PA诱导组相较TGF-β1诱导组对Hep G2、LX-2细胞存活率抑制更明显;油红O染色结果显示,PA诱导组Hep G2、LX-2细胞内脂滴含量随PA浓度的升高显著增多,TGF-β1诱导组中LX-2细胞内脂滴含量随TGF-β1浓度的升高而增多;Western blot实验结果显示,200μM、400μM PA诱导Hep G2细胞后细胞内α-SMA及CollagenⅠ的蛋白表达水平显著上调(P1),5 ng/m L、10 ng/m L TGF-β1诱导后LX-2细胞内α-SMA、CollagenⅠ蛋白表达水平显著上调(P1);q RT-PCR结果显示,200μM PA诱导后Hep G2细胞内α-SMA、CollagenⅠm RNA表达水平显著升高(P1),5 ng/m L、10 ng/m L TGF-β1诱导后LX-2细胞内α-SMA、CollagenⅠm RNA表达水平显著上调(P1)。上述结果表明,200μM、400μM PA诱导对Hep G2、LX-2细胞

关键词：枸杞多糖肝纤维化 mst1 TGF-β1 Smad2/3

β-catenin及mst1在小鼠心肌缺血再灌注损伤中的作用机制研究

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β-catenin及Mst1在小鼠心肌缺血再灌注损伤中的作用机制研究

作者：乔莉安徽大学

学位级别：硕士

缺血再灌注损伤是器官移植过程中不可避免的一种现象,是导致器官衰竭和移植物器官受损的重要原因之一。近年来,心肌疾病的发生率日益升高,心肌的缺血再灌注损伤受到越来越多的关注。但是心肌缺血再灌注损伤的过程复杂,导致其发生的原因... 详细信息

缺血再灌注损伤是器官移植过程中不可避免的一种现象,是导致器官衰竭和移植物器官受损的重要原因之一。近年来,心肌疾病的发生率日益升高,心肌的缺血再灌注损伤受到越来越多的关注。但是心肌缺血再灌注损伤的过程复杂,导致其发生的原因目前没有明确的解释。许多研究表明,氧化损伤、细胞凋亡、钙离子超载等是导致细胞因缺血再灌注损伤而死亡的重要原因。β-catenin信号通路主要参与各种肿瘤和细胞生长发育等生命活动。β-catenin通路在众多器官的缺血再灌注损伤中有较多的研究,但在心肌的缺血再灌注损伤中作用机制如何除本研究外却未有报道,所以本研究以小鼠颈部异位心脏移植为基础模型,揭示β-catenin通路对心肌缺血再灌注损伤的作用。另有文献表明,缺血再灌注损伤的过程也涉及到细胞的氧化损伤,mst1在氧化损伤过程中被激活。所以本研究的另一个方向是在体内外构建mst1敲低模型,探究mst1在缺血再灌注损伤中的作用。本研究中用到的实验方法有两种,一是在探究β-catenin通路时,构建小鼠颈部异位心脏移植模型,对移植物心脏分别缺血不同的时间和再灌注不同的时间,摘取移植物心脏检测β-catenin、Pten等相关基因在转录和翻译水平上的变化。为了进一步探究β-catenin在缺血再灌注损伤中的作用,用CoCl在小鼠心肌细胞(HL-1)中构建低氧复氧模型,探究β-catenin过表达时,β-catenin及相关基因在转录和翻译水平上的变化。二是在探究mst1信号通路时,通过尾静脉注射mst1敲低慢病毒的方法制备mst1基因敲低的小鼠,以此小鼠当作供体小鼠来制备小鼠颈部异位心脏移植模型。通过将移植物心脏放在心脏停博液(HTK)中8h造成冷缺血损伤,检测mst1在冷缺血中的作用。在体外实验中用CoCl处理巨噬细胞以构建低氧复氧模型,检测mst1等相关基因在转录和翻译水平上的表达情况。通过上述实验,我们得到以下的结果。在β-catenin通路的研究中,缺血时间为10min,再灌注时间是1d时,β-catenin在转录和翻译水平上的表达量显著降低,Pten的表达量明显升高,心肌损伤也最为严重。用CoCl在HL-1细胞中构建低氧复氧模型,CoCl的最适浓度为600μmol/L,处理时间是24h。β-catenin过表达后用CoCl处理,β-catenin的表达量升高,Pten的表达量降低,β-catenin可以反向调节Pten,减轻心肌细胞受到的损伤。在mst1通路的研究中,心肌细胞冷缺血后会导致mst1在转录水平上的升高。在体外细胞低氧复氧模型中,CoCl的最适浓度是900μmol/L,处理时间是32h。mst1敲低后再用CoCl处理,相对于mst1敲低组,mst1的表达量在转录和翻译水平上均升高,而Keap1的表达下调,Nrf2和HO-1的表达上调。由此我们得到的结论是在小鼠心肌缺血再灌注损伤模型中,β-catenin可以通过调节Pten/Rock的表达,改善心肌细胞的生长状态,从而缓解缺血再灌注所造成的损伤。心肌的缺血再灌注损伤导致ROS的产生,ROS激活了mst1激酶,mst1的激活阻止Keap1的聚合,阻断Nrf2的降解,使抗氧化酶活性增高,从而减轻细胞的氧化损伤。

关键词：心脏异位移植缺血再灌注损伤 β-catenin mst1

靶向肝脏mst1的人脂肪源性miRNA的筛选及机制验证

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靶向肝脏MST1的人脂肪源性miRNA的筛选及机制验证

作者：栾延松宁夏医科大学

学位级别：硕士

目的非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是导致慢性肝病和肝相关疾病发生率及死亡率的常见病因,现已成为欧美等发达国家和我国富裕地区慢性肝病的重要病因,患病率已超过15%。对于NAFLD的治疗,至今仍然没有特异性的靶向药物,因此,寻找新的靶点是当... 详细信息

目的非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是导致慢性肝病和肝相关疾病发生率及死亡率的常见病因,现已成为欧美等发达国家和我国富裕地区慢性肝病的重要病因,患病率已超过15%。对于NAFLD的治疗,至今仍然没有特异性的靶向药物,因此,寻找新的靶点是当务之急。通过文献学习以及课题组前期工作积累,我们意识到脂肪组织来源的循环miRNA可能通过介导肝脏组织中mst1基因的表达,调节肝脏脂质代谢进而影响NAFLD的发生发展。对于这一假设的探讨和验证,将为肝脏与脂肪组织的代谢联系提供新的实验证据,并为NAFLD的治疗与诊断提供新的方案和手段。方法1.参考文献“Adipose-derived circulating miRNAs regulate gene expression in other tissues”中的Supplementary Table 1-人脂肪组织来源循环miRNA数据库,得到人脂肪组织循环miRNA数据信息;随后利用TargetScan、miRDB数据库筛选得到可能靶向人mst1 3’UTR的miRNAs;最后通过维恩图取交集得到九个miRNAs,即筛选到可能靶向人mst1 3’UTR区的脂肪来源的miRNAs。通过Western blotting及双荧光素酶报告实验筛选出具有明显的靶向mst1作用的microRNA。2.设计并合成hsa-miR-448和hsa-miR-518a-3p引物,以人基因组DNA为模板,利用PrimeSTARMax DNA Polymerase高保真酶扩增目的基因hsa-miR-448和hsa-miR-518a-3p全长。使用限制性内切酶BamH I和Sal I将CD810A-1-EGFP载体和目的片段hsa-miR-448和hsa-miR-518a-3p基因分别双酶切,核酸电泳后使用胶回收试剂盒回收纯化目的条带,使用DNA Ligation Kit Ver.2.1快速连接酶在16℃水浴条件下30min,快速连接线性化的载体与目的片段。将连接产物转化至Stbl3感受态细胞,在LB固体培养基上过夜培养12 h-16 h,挑选合适的单克隆溶于微量无菌ddHO,对其进行快速PCR鉴定。初步鉴定成功的单克隆在LB液体培养基中过夜振荡培养12 h-16 h,使用质粒小提试剂盒提取质粒,并将重组质粒进行双酶切鉴定,鉴定结果正确的菌落克隆用于测序,测序正确的克隆即为构建成功的CD810A-1-EGFP-miR448和CD810A-1-EGFP-miR518a-3p重组质粒,进行无类毒素中提备用。3.HepG2细胞铺于6孔板,每孔约1.2×10个细胞,培养12 h后,分别用0μM,125μM,250μM棕榈酸(palmitic acid,PA)孵育HepG2细胞12 h或24 h,选择最适孵育浓度及时间建立体外非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)细胞模型,通过油红O染色、细胞内甘油三酯(TG)含量测定以及Western blotting实验检测mst1表达水平判断造模情况。将重组质粒CD810A-1-EGFP-miR448、CD810A-1-EGFP-miR518a-3p及对照组转染到HepG2细胞中,转染48 h后采用PA诱导24 h。油红O染色检测细胞内脂滴堆积情况,采用甘油三酯检测试剂盒测定细胞内甘油三酯的含量,通过Western blotting检测细胞内pmst1/mst1蛋白及其下游脂代谢相关蛋白pSREBP/SREBP、pAMPK/AMPK的表达水平。4.从临床收取NAFLD病人组及NAFLD对照组的血液样本、肝脏组织以及脂肪组织。通过B超检查、血生化检查及肝脏组织切片HE染色判断肝脏细胞内脂滴堆积情况,其中NAFLD疾病组入组13例,NAFLD阴性对照组入组11例。qPCR检测血液样本、肝脏组织及脂肪组织中mst1基因的表达水平以及hsa-miR-448和hsa-miR-518a-3p的表达差异。结果1.成功筛选到靶向肝脏mst1基因的hsa-miRNA从文献“Adipose-derived circulating miRNAs regulate gene expression in other tissues”的Supplementary Table 4-可得到脂肪代谢障碍病人体内下调的hsa-miRNA共231个;通过TargetScan、miRbase等数据库预测可能靶向人mst1-3’UTR区的hsa-miRNA共15个,取二者之交集,筛选出可能靶向人mst1-3’UTR区的脂肪来源的hsa-miRNA共计9个。通过Western blotting实验检测各组细胞中mst1的蛋白表达,在候选的9个hsa-miRNA中,miR-448和miR-518a-3p的蛋白表达水平明显下降。双荧光素酶报告基因实验检测人mst1 3’UTR区的荧光素酶活性的表达,亦发现miR-448和miR-518a-3

关键词：非酒精性脂肪肝病 mst1 miRNA-448 miR-518a-3p

mst1在结直肠癌SW480细胞增殖与凋亡中的作用

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MST1在结直肠癌SW480细胞增殖与凋亡中的作用

作者：卢洪飞南昌大学

学位级别：硕士

哺乳动物不育系20样激酶1/2(mst1/2)是果蝇hippo基因在哺乳类动物中的同源基因mst1/2编码的蛋白,也是哺乳动物中Hippo信号通路的核心组分,具有调节器官大小、影响细胞增殖、凋亡及抑制肿瘤生长等功能。本实验从分子、细胞及动物水平上探... 详细信息

哺乳动物不育系20样激酶1/2(mst1/2)是果蝇hippo基因在哺乳类动物中的同源基因mst1/2编码的蛋白,也是哺乳动物中Hippo信号通路的核心组分,具有调节器官大小、影响细胞增殖、凋亡及抑制肿瘤生长等功能。本实验从分子、细胞及动物水平上探讨mst1在结直肠癌中的作用及分子机制,旨在为结直肠癌的治疗提供新的潜在靶点。方法:1、质粒的双酶切鉴定、纯化及扩增感受态细胞扩增及AgeI和EcoRI双酶切鉴定质粒p-EGFP-mst1和p-EGFP-N1。鉴定后进行大量扩增、纯化及浓度的测定。2、不同浓度、时间5-FU对SW480细胞增殖及mst1、Phospho-YAP1(Ser127)、PUMA等蛋白的影响不同浓度梯度、时间的5-FU处理SW480细胞,MTS比色法检测细胞增殖抑制率,Western blot检测不同浓度5-FU对mst1、YAP、Phospho-YAP1(Ser127)、p73、p53、PUMA和caspase-3蛋白表达的影响。3、mst1对SW480细胞作用的体外实验研究Western blot和RT-qPCR检测3个siRNA干扰片段对SW480细胞mst1的沉默效率,筛选沉默效率高的片段。体外DNA转染试剂转染siRNA或p-EGFP-mst1至细胞或与5-FU共同处理SW480细胞,MTS比色法、流式细胞术及Hoechst 33342染色法检测高表达和沉默mst1对细胞增殖与凋亡的影响;RT-qPCR检测mst1、yap、p73、p53、caspase3、CTGF和AREG的m RNA的转录水平,Western blot方法检测mst1、YAP、Phospho-YAP1(Ser127)、p73、p53、PUMA和caspase-3蛋白表达情况,初步探讨mst1在体外对SW480增殖及凋亡影响的分子机制及mst1表达与5-FU促进细胞凋亡的关系。4、mst1高表达对人结直肠癌SW480细胞鼠移植瘤生长的影响构建SW480细胞的人结直肠癌裸鼠移植瘤模型,mst1进行基因治疗或联合5-FU共同治疗,观察移植瘤的生长情况,免疫组化分析移植瘤中mst1、Phospho-YAP1(Ser127)、及PUMA蛋白的表达,初步研究mst1抑制肿瘤生长的分子机制。结果:1、体外5-fu处理sw480细胞,随药物浓度和处理时间升高细胞生长抑制率明显升高,随5-fu作用浓度升高,mst1表达升高,yap磷酸化形成phospho-yap1(ser127)的水平升高,促凋亡相关蛋白p73、p53、puma及caspase3表达量显著升高。2、mst1高表达明显抑制sw480细胞生长,促进凋亡。体外介导p-egfp-mst1质粒转染sw480细胞,细胞生长抑制率及细胞凋亡率明显升高;与5-fu联合处理时,对细胞生长抑制率及凋亡率的升高更明显。3、mst1高表达促进p73、p53、puma、caspase-3蛋白表达及yap磷酸化水平。mst1升高,yap磷酸化成phospho-yap1(ser127)的水平升高及促凋亡相关p73、p53、puma、caspase3蛋白量及各相应mrna水平显著上升。4、mst1高表达下调ctgf、aregmrna的水平。体外介导p-egfp-mst1质粒转染sw480细胞后,yap表达水平下调,ctgf和aregmrna水平显著下调,5-fu联合处理能够促进mst1功能。5、mst1沉默促进sw480细胞的增殖,抑制sw480细胞凋亡。转染mst1-sirna3片段后sw480细胞生长抑制率及细胞凋亡率明显降低。6、沉默mst1下调p73、p53、puma和caspase-3mrna的水平及上调yap、ctgf、aregmrna的水平。沉默mst1使yap磷酸化形成phospho-yap1(ser127)的水平下降,促凋亡相关p73、p53、puma、caspase-3蛋白表达量及mrna水平显著下降,但yap的蛋白及mrna水平升高且ctgf和aregmrna水平上升明显。7、裸鼠移植瘤模型结果显示,应用mst1、5-fu及5-fu联合mst13个组在治疗27天后的平均瘤块体积和重量均显著低于control或阴性对照组,并且5-fu联合mst1治疗组的抑瘤效果更明显,并伴随着mst1、phospho-yap1(ser127)、puma蛋白的移植瘤组织阳性率的升高。结论:1、mst1高表达可抑制结直肠癌sw480细胞增殖,促进凋亡,且生长抑制率随着作用时间延长而加强;mst1与5-fu联合使用,对细胞增殖抑制及促凋亡效果更好;2、mst1高表达能够促进sw480细胞中yap1(ser127)蛋白的磷酸化及升高p73、p53、puma、caspase3蛋白表达量,降低了细胞中ctgf、aregmrna的水平。这可能是mst1抑制SW480细胞生长的重要机制之一;3、mst1高表达能增强结

关键词：结直肠癌 mst1 5-FU 磷酸化YAP1 细胞凋亡裸鼠移植瘤

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Hippo通路与血液系统肿瘤相关进展

生命的化学 2020年第11期40卷 1988-1993页

作者：胡琛婕闵凤玲扬州大学医学院扬州225009 扬州大学附属医院血液科扬州225009

Hippo通路是一条在进化上高度保守的信号通路,对控制组织器官大小、细胞增殖及凋亡有关键调节作用。Hippo通路核心组分的表达可影响血液系统肿瘤的发生及预后,在大多数情况下,其上游因子(如KIBBRA、RASSF)因高甲基化呈低表达,mst1/2呈... 详细信息

Hippo通路是一条在进化上高度保守的信号通路,对控制组织器官大小、细胞增殖及凋亡有关键调节作用。Hippo通路核心组分的表达可影响血液系统肿瘤的发生及预后,在大多数情况下,其上游因子(如KIBBRA、RASSF)因高甲基化呈低表达,mst1/2呈低表达,LATS1/2及YAP呈高表达,但YAP在弥漫大B细胞淋巴瘤及多发性骨髓瘤中低表达。受Aurora激酶调控及其他信号分子作用引起的LATS1/2表达异常,也与白血病分期及进展有密切关系。在治疗方面,针对Hippo通路核心组分的靶向药物,如:丝/苏氨酸激酶mst靶向抑制剂及酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors,TKI)等药物在临床取得良好效果,为血液系统肿瘤的治疗提供了新思路。本文就近年该领域的研究作一综述。

关键词： Hippo信号通路血液系统恶性肿瘤 LATS mst1 YAP 治疗

PKM2与mst1相互作用抑制他莫昔芬诱导的人乳腺癌细胞凋亡

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PKM2与MST1相互作用抑制他莫昔芬诱导的人乳腺癌细胞凋亡

作者：季飞虎重庆医科大学

学位级别：硕士

目的:探讨4-羟基他莫昔芬(4-hydroxytamoxifen,4-OHT)对M2型丙酮酸激酶(M2-pyruvate kinase,PKM2)表达的影响,研究PKM2与mst1(Mammalian Sterile20-like kinase 1,mst1)相互作用的机制及其对mst1介导的人乳腺癌细胞MCF-7、SKBR3凋亡的影响。方法:1.4-OHT处理人乳腺癌MCF-7、SKBR3细胞及人正常乳腺上皮MCF-10A细胞后,流式检测4-OHT对MCF-7、SKBR3和MCF-10A细胞凋亡的影响,Western blot检测细胞PKM2、Cleaved-Caspase3以及mst1的表达情况。用4-OHT浓度梯度法长期诱导人乳腺癌MCF-7细胞,获得他莫昔芬耐药细胞株MCF-7R,并用CCK-8检测MCF-7和MCF-7R对4-OHT的药物敏感性,Western blot检测PKM2的表达。2.Co-IP实验证明PKM2与mst1存在相互作用,并找出与PKM2作用的mst1的变构体,免疫荧光检测PKM2与mst1在细胞内定位情况。3.构建PKM2的shRNA慢病毒,感染乳腺癌MCF-7细胞株,用4-OHT诱导细胞凋亡,采用Western blot检测PKM2干扰后,乳腺癌细胞MCF-7和SKBR3中凋亡蛋白Cleaved-Caspase3和mst1蛋白的表达,核浆分离和免疫荧光实验检测细胞内mst1的分布情况。4.在4-OHT处理细胞的基础上,通过干扰或者过表达PKM2蛋白,同时过表达mst1,Western blot检测凋亡蛋白Cleaved-Caspase3的表达,流式检测细胞凋亡发生的比例。结果:1.流式和Western blot结果表明,4-OHT能诱导乳腺癌细胞SKBR3和MCF-7发生凋亡,对正常乳腺上皮细胞MCF-10A凋亡没有影响;随着浓度的增高,PKM2表达逐渐减少,cl-Casepase3和cl-mst1逐渐增多。他莫昔芬耐药细胞株MCF-7R的PKM2表达量明显升高。2.Co-IP结果显示mst1与PKM2存在相互作用,且与PKM2相互作用的mst1的变构体为cl-mst1,他莫昔芬能明显减弱此蛋白间的相互作用。免疫荧光实验显示,在MCF-7和SK-BR-3细胞中,PKM2与mst1主要共定位于细胞浆中。3.采用sh-PKM2慢病毒感染乳腺癌MCF-7细胞,Western blot实验结果表明PKM2的表达显著减少,cl-mst1增多,核浆蛋白分离实验和免疫荧光证实,PKM2干扰能够促进mst1剪切后入核,从而促进细胞的凋亡。4.Western blot结果表明,PKM2过表达能够抑制凋亡蛋白cl-Caspase3的表达,反之,PKM2干扰能够增强cl-Caspase3的表达。流式结果表明,PKM2过表达能够抑制mst1介导的细胞凋亡作用,反之,PKM2干扰能够增强mst1介导的细胞凋亡作用。结论:1.他莫昔芬促进乳腺癌MCF-7和SKBR3细胞凋亡,并且下调PKM2的表达,同时促进cl-mst1的表达。2.mst1与PKM2存在相互作用,与PKM2相互作用的mst1的变构体为cl-mst1.3.干扰PKM2能够上调cl-mst1并促进其入核。4.PKM2抑制mst1介导的细胞凋亡,PKM2可能是mst1上游的调控乳腺癌细胞凋亡的重要靶点。

关键词：他莫昔芬 M2型丙酮酸激酶 mst1 乳腺癌细胞凋亡

高表达蛋白mst1对人胚肾HEK293细胞凋亡和增殖的影响

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高表达蛋白Mst1对人胚肾HEK293细胞凋亡和增殖的影响

作者：李兆明华中科技大学

学位级别：硕士

目的建立受四环素诱导表达外源基因mst1的真核表达体系人胚肾293(HEK293)细胞株,用于进一步基因功能的研究。方法利用T-REx (Tetracycline - Regulated Expression)系统建立四环素可调控的表达体系。首先,构建含有目的基因mst1的质粒pcD... 详细信息

目的建立受四环素诱导表达外源基因mst1的真核表达体系人胚肾293(HEK293)细胞株,用于进一步基因功能的研究。方法利用T-REx (Tetracycline - Regulated Expression)系统建立四环素可调控的表达体系。首先,构建含有目的基因mst1的质粒pcDNA4/TO-mst1。其次,将调节性pcDNA6/TR质粒用脂质体介导法转染人胚肾293细胞,经药物Blasticidin S筛选后的克隆用有限稀释法进行单克隆化。单克隆扩增后再瞬时转染质粒pcDNA4/TO-mst1并用Zeocin筛选并挑选单克隆。然后经四环素诱导表达,通过Western Blot方法检测目的基因mst1的表达水平,从而筛选出由四环素诱导的高表达外源基因mst1的人胚肾293单克隆细胞株。结果通过T-REx系统成功构建由四环素调控的高表达外源基因mst1的人胚肾293细胞株。结论四环素诱导表达目的基因mst1的人胚肾293细胞株可用于外源基因的真核调控表达,为研究目的基因mst1及其它真核基因功能提供了一种有力的实验手段。目的探讨四环素诱导性表达外源性mst1(Mammalian sterile 20-like kinase 1)对HEK 293细胞增殖与凋亡的影响。方法在已经成功构建的四环素可诱导表达mst1的HEK 293细胞系中,加入四环素诱导mst1在HEK293细胞中高表达。通过蛋白Western Blot分析mst1在HEK 293细胞中的表达情况;分别在加入四环素后12, 24,36,48小时通过四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT)观察高表达mst1后对细胞增殖的影响;加入四环素后36小时加入BrdU,通过其掺入比率来显示mst1对细胞增殖的影响;加入四环素后后36小时,加入顺铂作用14小时后通过Annexin V检测其对细胞凋亡的影响。结果四环素成功诱导mst1高表达;MTT及BrdU结果显示在HEK 293细胞中高表达mst1后细胞增殖明显受到抑制;Annexin V检测结果提示高表达mst1后,细胞的凋亡率相对增高。结论在HEK 293细胞中高表达mst1,不仅可以抑制细胞增殖,还可促进细胞凋亡。

关键词： mst1 四环素诱导表达质粒构建 MTT hippo

GPR119/mst1/FoxO1通路在鼠胰腺β细胞脂毒性损伤中的作用研究

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GPR119/MST1/FoxO1通路在鼠胰腺β细胞脂毒性损伤中的作用研究

作者：马立荣宁夏医科大学

学位级别：硕士

研究目的证实脂毒背景下鼠胰腺β细胞膜G蛋白偶联受体119(GPR119)通过Ca2+-CaM活化mst1-FoxO1通路引起细胞功能损伤的途径和机制。研究方法1.经棕榈酸(PA)孵育大鼠胰岛素瘤细胞株INS-1,采用MTT实验检测INS-1细胞存活率;采用蛋白免疫印... 详细信息

研究目的证实脂毒背景下鼠胰腺β细胞膜G蛋白偶联受体119(GPR119)通过Ca2+-CaM活化mst1-FoxO1通路引起细胞功能损伤的途径和机制。研究方法1.经棕榈酸(PA)孵育大鼠胰岛素瘤细胞株INS-1,采用MTT实验检测INS-1细胞存活率;采用蛋白免疫印迹实验(Western Blotting,WB)证实PA对Caspase-3及clCaspase-3的表达调节作用。2.GPR119激动剂MBX孵育INS-1细胞,通过MTT实验检测细胞存活率;运用流式细胞术检测INS-1细胞的凋亡率和钙离子浓度的变化;运用细胞免疫化学法鉴定GPR119的分布及表达;运用WB检测GPR119,phospho-mst1,clmst1,mst1,phospho-FoxO1,FoxO1,Caspase-3,clC3 及 Pdx1 的表达水平;运用qPCR检测BCL-2,Bax,Pdx1及Insulin的mRNA表达;运用酶比色法检测INS-1细胞内甘油三酯、游离脂肪酸及胰岛素的含量。3.Ca2+螯合剂EGTA和CaM抑制剂CPZ孵育INS-1细胞,通过MTT实验检测细胞存活率;运用流式细胞术检测INS-1细胞的凋亡率;运用WB检测phospho-mst1,clmst1,mst1,phospho-FoxO 1 及 FoxO 1 的表达水平。4.采用pcDNA3-mst1过表达质粒及mst1 shRNA质粒转染正常和PA孵育 12hrs 后的 INS-1 细胞 72hrs,运用 WB 检测 phospho-mst1,clmst1,mst1,phospho-FoxO 1,FoxO1,Caspase-3,clC3 及 Pdx1 的表达水平。5.C57BL/6J小鼠80只分为10组,其中高/低脂饮食各5组持续喂养到第18周,期间记录投食量,摄食量并称重。在第12周检测胰岛素耐量和糖耐量,以判断造模进展。6.GPR119过表达载体的体内干预将构建成功的 pCDH-GFP、pCDH-GPR119、shCtrl、shGPR119 质粒经脂质体转染入HEK293T细胞,经过包装、扩增后,得到实验性的重组慢病毒。采用尾静脉注射技术,将重组慢病毒LV-GFP、LV-GPR119、LV-shCtrl、LV-shGPR119分别注入8组小鼠(高脂/低脂持续喂养第18周)尾静脉。一周后处死小鼠取胰腺组织采用免疫组织化学法观察各组胰岛细胞GPR119蛋白表达量,HE染色和电镜观察胰腺胰岛细胞损伤情况;运用酶比色法检测胰腺组织内游离脂肪酸、TG及胰岛素含量;运用WB检测各组小鼠胰腺组织内GPR119,phospho-mst1,clmst1,mst1,phospho-FoxO1,FoxO1,Caspase-3,clC3及Pdx1的表达水平。研究结果1.PA以浓度或时间依赖性增加INS-1细胞Caspase-3的表达WB 及 MTT 证实用 250.0uM/L 和 500.0uM/L PA 分别孵育 INS-1 细胞 12hrs,PA以浓度依赖性增加Caspase-3的表达水平;250.OuM/L PA分别孵育INS-1细胞 Ohr、1hr、3hrs、6hrs、12hrs、24hrs、48hrs,PA 以时间依赖性增加 Caspase-3及clCaspase-3的表达水平。2.250.0uM/LPA 孵育 INS-1 细胞 12hrs后,GPR119 激动剂 MBX 4.0uM/L干预细胞10min,检测到细胞内TG,FFA含量降低;WB结果显示MBX抑制了 mst1和FoxO1的磷酸化表达;qPCR结果显示经PA诱导后加GPR119激动剂MBX降低细胞内Bax的mRNA表达,同时Pdx1和Insulin的mRNA表达增加。3.WB实验结果显示细胞外的Ca2+对mst1的磷酸化表达没有明显影响;经 250.0uM/L PA 处理 INS-1 细胞 12hrs 后,CaM 抑制剂 CPZ 100.0uM/L 作用60min,WB实验结果显示CPZ增加了 mst1和FoxO1的磷酸化表达水平。4.pcDNA3-mst1过表达质粒及mst1 shRNA质粒分别转染正常培养和PA孵育12hrs后的INS-1细胞72hrs,WB实验结果显示mst1过表达增加了mst1的磷酸化表达和FoxO1的磷酸化表达;mst1 shRNA明显抑制了 mst1的磷酸化表达和FoxO1的磷酸化表达。5.高脂诱导C57BL/6J小鼠,尾静脉注射GPR119,GPR119 shRNA慢病毒一周后,采用HE染色和电镜观察到GPR119过表达组胰腺胰岛细胞较GPR119 shRNA组损伤程度轻,血清甘油三酯及游离脂肪酸含量降低,血清胰岛素水平增加,注射慢病毒一周后HFD-LV-GPR119较HFD-LV-shGPR119组葡萄糖耐量和胰岛素耐量均降低。WB结果显示GPR119过表达抑制了磷酸化的mst1

关键词：脂毒 GPR119 Ca2+-CaM mst1 FoxO1 胰腺β 细胞损伤

IGF1R、SHC1、GRB2、mst1及MDM2在脂溢性角化病、鲍恩病、皮肤鳞状细胞癌中的表达及意义

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IGF1R、SHC1、GRB2、MST1及MDM2在脂溢性角化病、鲍恩病、皮肤鳞...

作者：王翠芹承德医学院

学位级别：硕士

目的:近年来皮肤肿瘤的发病率逐年增高,不但给人们的生命健康带来了严重的威胁,还给人们的经济带来了沉重的负担,因此积极探讨皮肤肿瘤的发病机制,积极寻找皮肤肿瘤发病过程中的特异性指标至关重要。本研究探讨IGF1R、SHC1、GRB2、mst1... 详细信息

目的:近年来皮肤肿瘤的发病率逐年增高,不但给人们的生命健康带来了严重的威胁,还给人们的经济带来了沉重的负担,因此积极探讨皮肤肿瘤的发病机制,积极寻找皮肤肿瘤发病过程中的特异性指标至关重要。本研究探讨IGF1R、SHC1、GRB2、mst1及MDM2在脂溢性角化病(seborrheic keratosis,SK)、鲍恩病(Bowen’s disease,BD)、皮肤鳞状细胞癌(cutaneous squamous cell carcinoma,cSCC)组织中的表达水平,并分析其意义,以期为皮肤肿瘤的早期诊断、鉴别或预后提供理论基础。方法:1收集承德医学院附属医院及沧州市中心医院手术切除的50例SK、20例BD、22例cSCC组织蜡块标本及10例色素痣周围正常皮肤组织,采用免疫组织化学SP染色法检测上述四组组织中IGF1R、SHC1、GRB2、mst1及MDM2的表达情况。2数据处理采用SPSS19.0软件,计数资料以n(%)表示,阳性率之间比较采用Pearsonχ2检验、连续性校正χ2检验或Fisher确切概率法;以P1 IGF1R在正常组、SK组、BD组及cSCC组患者皮损中的阳性率依次为0(0/10)、64.00%(32/50)、90.00%(18/20)、90.91%(20/22)。cSCC组、BD组、SK组阳性率均高于正常组(P均0.05)。(Tab.1)2 SHC1在正常组及SK组、BD组、cSCC组患者皮损中的阳性率依次0(0/10)、88.00%(44/50)、100.00%(20/20)、95.45%(21/22)。cSCC组、BD组、SK组阳性率均高于正常组(P均0.05)。(Tab.2)3 GRB2在正常组及SK组、BD组、cSCC组患者皮损中的阳性率依次为0(0/10)、18.00%(9/50)、55.00%(11/20)、72.73%(16/22)。cSCC组和BD组阳性率高于SK组和正常组(P均0.05)。(Tab.3)4 mst1在正常组及SK组、BD组、cSCC组患者皮损中的阳性率依次为100.00%(10/10)、80.00%(40/50)、95.00%(19/20)、72.73%(16/22),各组间阳性率两两比较比较差异无统计学意义(P均>0.05)。(Tab.4)5 MDM2在正常组及SK组、BD组、cSCC组患者皮损中的阳性率依次为0(0/10)、74.00%(37/50)、100.00%(20/20)、100.00%(22/22)。cSCC组、BD组、SK组阳性率均高于正常组(P均1 IGF1R在cSCC组、BD组、SK组的阳性表达率均明显高于正常组,且差异有统计学意义,推测IGF1R表达上调可能在上述表皮增生性肿瘤的进展中发挥作用;cSCC组、BD组阳性表达率均高于与SK组,且差异有统计学意义,推测IGF1R可能对上述表皮增生性疾病角质形成细胞的间变和恶变具有促进和参考意义;cSCC组阳性率与BD组比较,差异无统计学意义,推测IGF1R可能对上述表皮增生性肿瘤的发生有促进作用,但对皮肤鳞状细胞癌的侵袭和转移无预示作用。2 SHC1在cSCC组、BD组、SK组的阳性表达率均明显高于正常组,差异有统计学意义,说明SHC1可能在脂溢性角化病、皮肤原位鳞癌及皮肤浸润性鳞癌中存在异常活化;SHC1的阳性表达率在SK组、BD组、cSCC组相互之间比较差异无统计学意义,说明SHC1可能对表皮角质形成细胞的增生有促进作用,而对其间变、恶变、侵袭、转移无明显促进作用。3 GRB2的阳性表达率在cSCC组和BD组均明显高于SK组和正常组,且差异有统计学意义,但SK组与正常组阳性率相比,差异无统计学意义,表明GRB2可能参与了皮肤鳞状细胞癌的发生,而在脂溢性角化病这一良性肿瘤中作用不明显;cSCC组与BD组阳性率比较,差异无统计学意义,提示GRB2可能尚不能对皮肤鳞状细胞癌是否发生侵袭转移做出预示。4 mst1的阳性表达率在正常组、SK组、BD组及cSCC组组间多重比较中差异无统计学意义,表明mst1可能未参与脂溢性角化病和皮肤鳞状细胞癌的发生发展。5 MDM2的阳性表达率在cSCC组、BD组、SK组均高于正常组,且差异有统计学意义,提示MDM2表达上调可能在上述表皮增生性肿瘤的发生发展中起促进作用;cSCC组、BD组阳性率均高于SK组,且差异有统计

关键词： IGF1R SHC1 GRB2 mst1 MDM2 皮肤肿瘤