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Fully synthetic Tn-based three-component cancer vaccine using covalently linked TLR4 ligand mpla and iNKT cell agonist KRN-7000 as built-in adjuvant effectively protects mice from tumor development

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Acta Pharmaceutica Sinica B 2022年第12期12卷 4432-4445页

作者： Deying Yang Xiang Luo Qinghai Lian Lingqiang Gao Chengxin Wang Xiaoxiao Qi Rong Zhang Zhongqiu Liu Guochao Liao Joint Laboratory for Translational Cancer Research of Chinese Medicine of the Ministry of Education of the People's Republic of China International Institute for Translational Chinese MedicineGuangzhou University of Chinese MedicineGuangzhou 510006China Guangdong-Hong Kong-Macao Joint Lab on Chinese Medicine and Immune Disease Research Guangzhou 510120China

We present a new strategy for self-adjuvanting vaccine development that has different types of covalently-linked immunostimulants as the carrier molecule.Using Tn antigen as the model,a three-component vaccine(mpla-Tn-KRN7000)containing the TLR4 ligand mpla and the iNKT cell agonist KRN7000 was designed and synthesized.This expands fully synthetic self-adjuvanting vaccine studies that use a single carrier to one with two different types of carriers.The corresponding two-component conjugate vaccines Tn-mpla,Tn-KRN7000 and Tn-CRM197 were also synthesized,as controls.The immunological evaluation found that mpla-Tn-KRN7000 elicits robust Tn-specific and T cell-dependent immunity.The antibodies specifically recognized,bound to and exhibited complement-dependent cytotoxicity against Tn-positive cancer cells.In addition,mpla-Tn-KRN7000 increased the survival rate and survival time of tumor-challenged mice,and surviving mice reject further tumor attacks without any additional treatment.Compared to the glycoprotein vaccine Tn-CRM197,the two-component conjugate vaccines,Tn-mpla and Tn-KRN7000,and the physical mixture of Tn-mpla and Tn-KRN7000,mpla-Tn-KRN7000 showed the most effect at combating tumor cells both in vitro and in vivo.The comparison of immunological studies in wild-type and TLR4 knockout mice,along with the test of binding affinity to CD1d protein suggests that the covalently linked mpla-KRN7000 immunostimulant induces a synergistic activation of TLR4 and iNKT cell that improves the immunogenicity of Tn.This work demonstrates that mpla-Tn-KRN7000 has the potential to be a vaccine candidate and provides a new direction for fully synthetic vaccine design.

关键词： Cancer vaccine Tn antigen mpla KRN7000 Immunotherapy

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Programmed polymersomes with spatio-temporal delivery of antigen and dual-adjuvants for efficient dendritic cells-based cancer immunotherapy

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Chinese Chemical Letters 2022年第9期33卷 4179-4184页

作者： Hanyong Wang Xinyu Yang Chunyan Hu Chenlu Huang Hai Wang Dunwan Zhu Linhua Zhang Tianjin Key Laboratory of Biomedical Materials Key Laboratory of Biomaterials and Nanotechnology for Cancer ImmunotherapyInstitute of Biomedical EngineeringChinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical CollegeTianjin 300192China

Since antigen and adjuvant are rapid clearance in vivo,insufficient delivery to induce dendritic cells(DCs)maturation and cross-presentation,as well as limited migration efficiency of DCs to secondary lymph organs,greatly hinders the development of DCs-based immunotherapy.Herein,PCL-PEG-PCL polymersomes(PCEP-PS)as antigen and adjuvants delivery nanoplatforms(IMO-PS)were well-designed,which can electrostatically adsorb OVA antigen on the surface via DOTAP lipid and effectively encapsulate OVA antigen into the inner hydrophilic cavity to achieve both initial antigen exposure as well as slow and sustained antigen release,incorporate mpla within the lipid layer to ligate with extracellular TLR4 of DCs as well as encapsulate IMQ in the hydrophobic membrane to ligate with intracellular TLR7/8 of DCs for activating synergistic immune responses via different signaling pathways.The IMO-PS significantly improved antigen uptake,promoted DCs maturation and cytokines production.DCs treated with IMO-PS could enhance migration into draining lymphoid nodes,and eventually induced antigen-specific CD8+and CD4+T cell responses and OVA-specific cytotoxic T lymphocyte(CTL)responses.Prophylactic vaccination of EG7-OVA tumor-bearing mice by IMO-PS+DCs significantly extended tumor-free time,effectively suppressed tumor growth,and greatly extended median survival time.The strategy may provide an effective nanoplatform for co-delivery antigen and dual-adjuvants in a spatio-temporally programmed manner for DC-based cancer immunotherapy.

关键词： DCs vaccine Immunotherapy Imiquimod mpla DOTAP OVA

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mpla联合R848诱导巨噬细胞向M1型极化的作用及初步机制研究

MPLA联合R848诱导巨噬细胞向M1型极化的作用及初步机制研究

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作者：吴奕萱吉林大学

学位级别：硕士

近年来,TLRs激动剂作为肿瘤疫苗佐剂被广泛投入应用,可单独使用,为增强疫苗的免疫反应,也可将其联合应用。将TLRs配体联合应用于免疫细胞作用不尽相同,可能表现为协同促进,亦可能相互间拮抗。因此,研究巨噬细胞被TLRs配体作用后对其极... 详细信息

近年来,TLRs激动剂作为肿瘤疫苗佐剂被广泛投入应用,可单独使用,为增强疫苗的免疫反应,也可将其联合应用。将TLRs配体联合应用于免疫细胞作用不尽相同,可能表现为协同促进,亦可能相互间拮抗。因此,研究巨噬细胞被TLRs配体作用后对其极化的影响及机制有望为TLRs信号在免疫细胞间的联合应用机制研究提供理论基础。本组前期研究发现TLR4激动剂LPS以及TLR7/8激动剂R848联合可协同诱导小鼠巨噬细胞系(RAW264.7)向M1型极化。然而,LPS作为一种内毒素,本身具一定的副作用,不适用于后续的动物实验及疫苗佐剂的开发。因而,本研究选用TLR4激动剂——单磷酰脂质A(mpla)替换LPS,将其与TLR7/8激动剂R848联合作用,探讨其对巨噬细胞极化影响并初步探讨其机制:首先,为验证mpla及R848联合对巨噬细胞极化的影响,将mpla和R848单独或联合作用于RAW264.7,采用Griess法、Western blot、q PCR检测巨噬细胞极化指标NO分泌,及i NOS、Arg-1的表达情况。结果显示:与对照或单独给药组相比,mpla及R848联合作用后,NO分泌量及i NOS的表达水平最高,Arg-1的表达水平最低,提示两药联合作用于巨噬细胞可使其活化并向M1型极化的效果最显著。然后,我们使用小鼠腹腔巨噬细胞用IL-4刺激诱导M2型巨噬细胞,随后加入mpla及R848,通过检测i NOS、Arg-1,探讨mpla和R848联合能否将M2型巨噬细胞翻转为M1型,结果表明:mpla及R848单独作用时,不具备翻转能力,二者联合作用时可将M2型腹腔巨噬细胞翻转为M1型。进一步,我们以STAT3的表达情况为切入点,探讨mpla和R848联合诱导巨噬细胞极化的机制,采用Western blot、q PCR分析STAT3的上下游信号AKT、STAT1、SOCS3、SOCS1、IκB的表达,结果表明:mpla及R848处理巨噬细胞后,单独组中STAT3、SOCS3与IκB的表达与对照组相比均升高,AKT、STAT1和SOCS1的表达均降低;当两药联合后,STAT3、SOCS3与IκB的表达升高最为显著,AKT、STAT1、SOCS1的表达降低最显著。随后,为验证在巨噬细胞极化过程中STAT3起到的作用,我们加入STAT3抑制剂后,再分析mpla及R848对巨噬细胞极化及信号的影响。结果显示:加入STAT3抑制剂后,mpla或R848单独给药组i NOS的表达与对照组相比略微升高,但与未加入抑制剂相比,显著降低,两药联合组中的协同效果被解除,而Arg-1的变化趋势不显著;在加入STAT3抑制剂后,单独组中SOCS3与IκB的表达与对照组相比略有降低,两激动剂联合组中的表达与对照组相比略有升高,但与只加入激动剂相比其协同效果被解除,STAT1和SOCS1的效果不显著。提示STAT3在mpla联合R848诱导的巨噬细胞极化中起重要作用。本研究提示mpla和R848联合可使巨噬细胞活化并向M1型极化,且可以翻转由IL-4诱导的M2型巨噬细胞为M1型,同时,揭示了STAT3在巨噬细胞极化过程中起着重要作用。研究有望为肿瘤治疗提供理论基础,同时为免疫佐剂的研发提供新策略。

关键词： mpla R848 巨噬细胞极化 STAT3

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mpla对口蹄疫O型灭活疫苗的免疫增强效应

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甘肃农业大学学报 2019年第5期54卷 1-9页

作者：赵波房永祥贾怀杰陈国华何小兵杨孝朴景志忠甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070 中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部兽医公共卫生重点实验室甘肃兰州730046

【目的】探讨单磷酰脂质A(monophosphoryl lipid A,mpla)对口蹄疫(food and mouth disease,FMD)O型灭活疫苗的免疫增强效应,提高口蹄疫灭活疫苗的免疫效果.【方法】通过检测mpla刺激脾脏细胞的增殖情况和刺激DC后成熟及吞噬能力的大小,... 详细信息

【目的】探讨单磷酰脂质A(monophosphoryl lipid A,mpla)对口蹄疫(food and mouth disease,FMD)O型灭活疫苗的免疫增强效应,提高口蹄疫灭活疫苗的免疫效果.【方法】通过检测mpla刺激脾脏细胞的增殖情况和刺激DC后成熟及吞噬能力的大小,对mpla的体外免疫刺激效应进行评价;将mpla与ISA 206和灭活FMDVO型抗原配制疫苗后免疫小鼠,通过检测抗体水平、T细胞亚群、抗原特异性淋巴细胞增殖及浆细胞的比例,评价mpla对口蹄疫O型灭活疫苗的免疫增强作用.【结果】mpla体外可刺激B淋巴细胞增殖,上调DC表面共刺激分子的表达,使其吞噬能力减弱;制备疫苗免疫小鼠,血清抗体水平检测发现,mpla组在7、14 d时抗体水平显著高于ISA 206组,且其抗原特异性的B淋巴细胞增殖,外周血中CD19+CD27+CD38+浆细胞的比例也显著高于ISA 206组.【结论】mpla通过促进B淋巴细胞的增殖与活化增加了抗体的产生,增强了小鼠对口蹄疫疫苗的免疫应答能力,证实mpla是口蹄疫疫苗的良好候选免疫佐剂.

关键词： mpla 口蹄疫免疫疫苗佐剂

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mpla对雄性小鼠生殖系统的辐射防护作用及机制研究

MPLA对雄性小鼠生殖系统的辐射防护作用及机制研究

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作者：刘哲中国人民解放军海军军医大学

学位级别：硕士

一、研究背景随着核能利用的日益广泛,对电离辐射暴露的防护也逐渐的到人们的重视。研究发现,电离辐射可导致生物体细胞DNA损伤,继而导致细胞遗传物质受损甚至细胞死亡。人体各种组织器官的辐射敏感性差异较大,雄性生殖系统的主要器官... 详细信息

一、研究背景随着核能利用的日益广泛,对电离辐射暴露的防护也逐渐的到人们的重视。研究发现,电离辐射可导致生物体细胞DNA损伤,继而导致细胞遗传物质受损甚至细胞死亡。人体各种组织器官的辐射敏感性差异较大,雄性生殖系统的主要器官睾丸对电离辐射十分敏感,2Gy以上暴露于电离辐射可直接导致精原细胞,精原干细胞死亡,精曲小管内皮损伤等。因此寻找雄性生殖系统辐射防护的新方法是一个亟待解决的科学问题。Toll样受体(TLRs)是一类广泛存在的模式识别受体,参与抗原识别,肿瘤免疫,抗病毒等多种病理生理过程。在人们寻找有效辐射防护方法的过程中,逐渐发现,通过激活某些Toll样受体可产生一定的辐射防护作用。这其中又以激活TLR4辐射防护效果最为显著,提示TLR4在辐射防护中的重要作用。然而,传统TLR4激动剂内毒素(LPS)是一种由细菌细胞壁分离得到的成分,具有极强的免疫原性,由于毒性较大,严重制约了其在辐射防护中的应用。在后续的研究中,人们通过水解反应等一系列步骤,以LPS为原料,成功制备出一种减毒的TLR4激动剂,即单磷酰脂质A(mpla)。mpla是一种高效的TLR4激动剂,目前主要作为免疫佐剂应用于肿瘤免疫,目前已有超过300000人次的实验证明了其安全性。本教研室前期工作发现,mpla通过激活TLR4,可对小鼠骨髓,肠道,脾脏产生明显辐射防护作用,提示其在临床辐射防护中的巨大应用前景。本课题探讨了mpla对雄性生殖系统的辐射防护作用,发现mpla对小鼠睾丸具有很好的辐射防护作用。然而,由于不同组织,细胞的辐射敏感性差异极大,TLR4在全身组织,细胞中的分布也各不相同,mpla激活TLR4的主要靶细胞也有待鉴定。因此,基于单一细胞模型来解释TLRs在辐射防护中的作用机制无法全面解释TLR4辐射防护的机制,也不利于研究成果向应用转化。基于以上原因,本课题以雄性生殖系统辐射防护为研究重点,在充分考虑生物整体性以及组织细胞间差异性的基础上,初步阐明了mpla对雄性生殖系统辐射防护的作用及机制。二、研究内容(一)探究mpla对小鼠睾丸及小鼠精原细胞的辐射防护效应。我们主要从细胞层面及动物层面对mpla的辐射防护效果进行探究。在细胞层面,我们选取小鼠精原细胞为研究对象,主要探究mpla对其照后细胞增殖能力的影响。在动物体内层面,我们选取多种检测指标,主要探究mpla对小鼠睾丸照射后组织结构损伤,细胞周期,内分泌功能,以及精子生成能力的影响。(二)mpla对小鼠睾丸及精原细胞辐射防护作用的机制研究为研究mpla对小鼠睾丸辐射防护作用的分子机制,我们检测了mpla刺激后小鼠睾丸细胞凋亡情况,以及小鼠睾丸和精原细胞DNA损伤修复通路以及凋亡通路关键分子的激活情况,并通过使用敲除小鼠明确mpla发挥作用的通路依赖关系。通过效应研究,我们发现mpla对小鼠睾丸有明确辐射防护作用,而对精原细胞则无辐射防护作用。我们推测,由于各种组织TLR4表达及激活情况不同,可能存在TLR4激活明显的靶器官,靶细胞对睾丸及精原细胞产生间接辐射防护作用。为寻找上述靶器官,靶细胞,我们检测并明确了各种组织TLR4表达量以及激活情况,并寻找mpla处理后TLR4激活最为明显的靶器官,在锁定靶器官后,进一步在其中寻找TLR4激活明显的靶细胞。接下来,我们通过建立靶细胞与小鼠精原细胞的共培养体系,明确了靶细胞对小鼠精原细胞辐射敏感性的影响,进一步寻找靶细胞来源的影响小鼠精原细胞辐射敏感性的亚细胞效应物,并最终确定巨噬细胞来源的外泌体对精原细胞起到辐射防护作用。在进行上述探索的过程中,我们也检测了mpla刺激后共培养体系下精原细胞以及巨噬细胞处理后精原细胞的DNA损伤修复通路以及凋亡通路关键分子的表达变化。为更进一步探究外泌体内发挥辐射防护作用的具体成分,我们通过蛋白芯片的方法检测了mpla处理后巨噬细胞外泌体内蛋白表达的变化,并通过阻断蛋白效应的研究方式,最终确定发挥辐射防护作用蛋白的具体构成。三、研究方法(一)探究mpla对小鼠睾丸及小鼠精原细胞的辐射防护效应在细胞层面,主要通过克隆形成率的方法检测细胞照后增殖能力;在动物体内层面,我们选取睾丸H&E染色法探究睾丸照后组织结构损伤情况;通过对小鼠单侧附睾内精子进行计数检测小鼠精子生成能力;通过流式细胞仪检测小鼠睾丸照后细胞周期阻滞情况;通过对小鼠睾丸及血清内睾丸酮进行ELISA试剂盒检测,探究辐射对小鼠睾丸内分泌功能的影响。(二)寻找mpla激活TLR4最为明显的靶器官、靶细胞,并探究其与睾丸辐射损伤防护的关系在本部分研究中,我们通过蛋白印迹的方法,探究了不同组织细胞中TLR4的表达情况;通过TLR4免疫荧光染色明确其在睾丸中的分布规律;通过p-P65免疫荧光染色并量化的方法寻找TLR4通路激活明显的靶器官;在靶器官中:p-P65与F4/80免疫荧光共染的方法确定TLR4激活的靶细胞。在明确靶细胞的基础上,我们建立靶细胞与小鼠精原

关键词： mpla TLR4 睾丸辐射防护外泌体

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产低毒性脂多糖大肠杆菌J5重组株的构建及其相关产物的鉴定分析

产低毒性脂多糖大肠杆菌J5重组株的构建及其相关产物的鉴定分析

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作者：朱纯南京农业大学

学位级别：硕士

脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分,对于细菌的生存和生长发挥至关重要的作用。一方面LPS可以刺激机体的免疫系统,增强机体的免疫功能,另一方面其又具有较强的细胞毒性,易对机体造成损伤。单磷酸类脂A(mono... 详细信息

脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分,对于细菌的生存和生长发挥至关重要的作用。一方面LPS可以刺激机体的免疫系统,增强机体的免疫功能,另一方面其又具有较强的细胞毒性,易对机体造成损伤。单磷酸类脂A(monophosphoryl lipid A,mpla)是LPS最主要成分类脂A的一种衍生物,具有非常好的免疫佐剂效用。现今商品化的mpla主要是采用苯酚-氯仿-石油醚(phenol-chloroform-petroleum ether,PCP)法等化学手段提取沙门菌的LPS,再通过酸化脱去LPS的磷酸基团得到。但精制mpla的过程产率较低,工艺复杂,且生产成本高;产物仍然含有Ca+和Mg2+等无机离子和带阳电荷的多胺物质,溶解度低。同时,沙门菌作为一种重要的人兽共患致病菌,其生产的mpla产品仍然有可能造成公共卫生安全的威胁。本研究选择天然O-抗原不完全的大肠杆菌J5疫苗株为原始出发菌株,利用λ-Red同源重组技术,导入外源弗朗西斯菌lpxE基因定向去除类脂AC1位的磷酸基团,同时缺失大肠杆菌lpxM基因从而减少一条酰基链,将大肠杆菌J5改造成可以生产低毒性mpla的工程菌株。其菌株构建过程具体如下:根据GenBank上发布的E.colilacl基因和E.novicida lpxE基因序列,设计用于置换lacI基因的重组引物。通过SOE-PCR融合lpxE基因和氯霉素抗性cat基因片段,制备带有lacI基因同源臂的lpxE-cat重组片段。其产物纯化后导入含有质粒pKD46的大肠杆菌J5株感受态细胞中,在Red重组酶Beta、Exo、Gam作用下,lpxE-cat重组片段依靠两侧同源序列与细菌染色体的靶基因发生重组,将lacI基因置换,氯霉素抗性平板筛选获得一次同源重组菌J5ΔlacI::lpxE-cat并进行PCR鉴定。然后导入编码Flp重组酶的质粒pCP20,通过对lpxE-cat两侧Flp位点的识别消除抗性基因,即获得二次重组菌J5ΔlacI::lpxE,PCR和测序验证重组株正确。最后,再以构建的J5ΔlacI::lpxE为出发菌株,根据GenBank上发布的E.coli lpxM基因序列设计引物,同上述同源重组方法,成功缺失lpxM基因获得J5ΔlacI::lpxEΔlpxM二次重组株。本研究采用热酚水法来从分别从大肠杆菌DH5α,J5株和J5ΔlacI::lpxEΔlpxM基因重组株提取LPS,通过加入DNase和RNase对LPS进一步纯化,最后利用银染法鉴定提取的LPS质量。结果显示,提取的LPS中核酸和蛋白的残留量均较低,不影响后续实验。利用鲎试剂定量法测定DH5α的LPS活性为2.3×105 EU/mg,J5原菌的LPS活性为 1.7×105EU/mg,改造菌株 J5ΔlacI::lpxEΔlpxM的LPS 活性为 4.3×103 EU/mg。改造菌株J5ΔlacI::lpxEΔlpxM的LPS活性较DH5α和J5原菌显著降低。对4周龄的ICR小鼠腹腔注射LPS提取物,观测攻毒后小鼠的生理精神状态和病症,并在剖杀小鼠后取肝脏组织制作石蜡切片,判定不同LPS提取物的毒性强弱。结果显示,大肠杆菌J5和DH5α的LPS提取物攻毒组,小鼠被毛凌乱,精神抑郁,有明显毒性反应;而J5ΔlacI::lpxEΔlpxM的LPS提取物和PBS组的小鼠正常,无任何临床症状。综上所述,本研究成功构建产低毒性脂多糖的大肠杆菌J5ΔlacI::lpxEΔpxM重组株,其直接产生的低毒性的mpla可以改进现有生产工艺,显著降低生产成本,从而将廉价、高效的mpla佐剂运用在兽用疫苗中,为新型兽用佐剂的发展提供基础。

关键词：脂多糖 λ-Red同源重组技术低毒 mpla

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一种新型狂犬病毒表位复合疫苗的筛选、鉴定及其免疫原性研究

一种新型狂犬病毒表位复合疫苗的筛选、鉴定及其免疫原性研究

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作者：胡晓波复旦大学

学位级别：硕士

狂犬病是由狂犬病病毒(Rabies Virus)引起的人兽共患的世界性传染病,每年全世界有超过55,000人死于狂犬病毒的感染,中国是狂犬病的高发国家之一。动物或人感染狂犬病后,病毒会进入中枢神经系统,引起神经细胞功能的紊乱,一旦发病,目前无... 详细信息

狂犬病是由狂犬病病毒(Rabies Virus)引起的人兽共患的世界性传染病,每年全世界有超过55,000人死于狂犬病毒的感染,中国是狂犬病的高发国家之一。动物或人感染狂犬病后,病毒会进入中枢神经系统,引起神经细胞功能的紊乱,一旦发病,目前无法医治,疫苗是唯一能够预防狂犬病的方法。狂犬病疫苗的开发已经有120多年的历史,目前中国使用的疫苗是由狂犬病毒弱毒株开发的灭活疫苗,且自从2005年之后,国内生产的疫苗中都不含有任何佐剂。因此现有的疫苗往往存在免疫原性较差、抗体产生缓慢、免疫程序繁琐等不足,在严重咬伤的情况下,还需要注射昂贵的免疫球蛋白进行辅助治疗。另一方面,由于狂犬病毒的潜伏期最短在7天左右,在注射疫苗后仍然有可能由于机体未能产生有效的体液免疫和细胞免疫而发病,造成严重后果。因此开发新型狂犬疫苗是解决现有疫苗不足的有效途径,而国内外关于改进现有狂犬疫苗的研究报道并不多,仅仅停留在改进免疫策略或者探索使用基因工程技术改造疫苗等,取得有效进展的很少。本文主要从疫苗佐剂和表位疫苗的角度开发了一种新型狂犬病毒复合表位疫苗,研究内容分为如下几个部分：首先,本文初次研究了单磷酰脂质A(mpla)作为狂犬疫苗佐剂促进机体免疫应答的机制,证明了其作为狂犬疫苗潜在佐剂的可行性。研究证明mpla作为一种已知的TLR4配体,一方面能够加快特异性狂犬病毒抗体在机体内产生的速度,另一方面能够诱导小鼠产生具有细胞杀伤作用的Tc细胞和以Th2型为主的免疫应答反应,并诱导免疫细胞产生IFN-γ和IL-4。其次,本文从表位疫苗的角度出发,筛选出4条狂犬病毒的细胞表位,为下一步狂犬病表位疫苗的研究奠定了基础。这部分的研究以BALB/c小鼠为哺乳动物模型,通过生物信息学手段,从狂犬病毒糖蛋白和核蛋白中预测出12条细胞表位,并利用免疫学实验方法(ELISPOT、流式细胞术等),从12条表位中筛选出4条狂犬病毒的候选表位(G367-381、G333-341、N92-106和N409423),这些表位经过体外实验验证,证明其能够促进淋巴细胞增殖、细胞因子IFN-γ和IL-4的分泌及T细胞的分化。其中G333-341作为CTL表位,而G36-381、N92-106和N409-423作为Th表位。最后,本文进一步将筛选到的细胞表位加上棕榈酸基团,合成了4条不同的多肽,添加mpla研制成了一种狂犬病毒复合表位疫苗,并在动物体内进行了初步的机理研究。通过免疫BALB/c小鼠以及检测其相关细胞免疫应答指标,发现合成的多肽中,多肽C具有显著的促进Th1类免疫应答的作用,多肽B和多肽D能够部分促进Thl类和Th2类免疫应答。综上所述,本研究从疫苗佐剂和表位疫苗的角度出发,初步证明了mpla+脂肽表位疫苗的组合能够促进机体Th1/Th2类细胞免疫应答,可能有助于机体清除病毒的感染,也有利于解决目前狂犬病疫苗的种种不足,为下一步开发新型高效狂犬疫苗提供了实验基础和新思路。

关键词：狂犬病毒疫苗佐剂 mpla 表位疫苗脂肽

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结核分枝杆菌酚糖脂PGLs相关衍生物的合成研究

结核分枝杆菌酚糖脂PGLs相关衍生物的合成研究

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作者：李新胜山东大学

学位级别：硕士

结核病是全球所有潜在致命细菌感染中最普遍的全球流行性疾病,是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）引起。据统计,2015年结核分枝杆菌感染了 1050万人,在全球造成180万人死亡。研究发现,感染多药耐药（MDR）和广泛耐药（XDR... 详细信息

结核病是全球所有潜在致命细菌感染中最普遍的全球流行性疾病,是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）引起。据统计,2015年结核分枝杆菌感染了 1050万人,在全球造成180万人死亡。研究发现,感染多药耐药（MDR）和广泛耐药（XDR）的结核分枝杆菌人数逐年呈上升趋势,仅2015年就报告了48万例新增多药耐药感染病例。此外,结核病和艾滋病毒（HIV）混合感染的病例的人数也逐年增加,使结核病的治疗更加困难。至今,可用于预防结核病的疫苗是卡介苗。近年来,研究者对接种卡介苗的人群进行研究发现该疫苗对儿童有很高的保护率,但它对成年人的保护效果欠佳,保护率从0%到80%不等。因此,人们需要研发更有效的疫苗和药物来预防和治疗结核病。研究发现结核分枝杆菌细胞壁上的糖脂化合物是重要的毒力因子,在宿主-病原相互作用和疾病发病过程中起着关键作用。酚糖脂（PGLs）的三糖糖链由L-鼠李糖和L-岩藻糖组成,并含有独特的甲基化模式修饰。研究表明,PGLs三糖糖链部分对结核分枝杆菌的发病机制很重要,能够抑制宿主免疫细胞分泌促炎细胞因子。对羟基苯甲酸衍生物（p-HBADs）是细菌细胞壁的另一个组成部分,与PGLs不同,它没有脂质链部分,但糖链部分与PGLs相同。同样,p-HBADs具有抑制感染巨噬细胞的促炎反应。可以看出,两者相同的三糖糖链结构部分对细菌的发病极其重要,是调节生物活性的重要因素。在本论文中,我们设计了两种含有不同甲基化模式的三糖衍生物和不同脂链长的三糖衍生物,并且通过化学手段立体选择性合成三糖衍生物,同时制备了相应的PGLs寡糖-单磷酰类脂A（mpla）糖脂复合物。本论文主要包含以下三章内容:第一章对结核分枝杆菌细胞壁的酚糖脂（PGLs）和对羟基苯甲酸衍生物（p-HBADs）的结构特点和相关合成研究工作等做了简要的概括。第二章介绍了结核分枝杆菌酚糖脂PGLs三糖衍生物的化学合成。本章我们采用DMF溶剂效应高效地构建了 α-糖苷键,成功合成了目标化合物。合成目标三糖XS-Ⅰ时,构建了岩藻糖模块XS-4、鼠李糖模块XS-11和鼠李糖模块XS-17三个单糖模块,然后采用非还原端到还原端的糖链组装策略,利用碘代丁二酰亚胺（NIS）、三氟甲基磺酸三甲基硅脂（TMSOTf）催化和DMF的溶剂效应进行糖苷化反应,制得目标三糖XS-Ⅰ;合成目标三糖XS-Ⅱ时,构建岩藻糖模块XS-20、鼠李糖模块XS-21和已合成的鼠李糖模块XS-17三个单糖模块合成,采用还原端到非还原端的糖链组装策略,在相同的糖苷化反应条件下得到目标三糖XS-Ⅱ;合成目标三糖XS-Ⅲ时,利用已合成的二糖化合物XS-18和新构建鼠李糖模块XS-26,同样利用相同的糖苷化反应条件制得三糖XS-Ⅲ。第三章介绍了两种结核分枝杆菌PGLs相关单磷酰类脂A（mpla）糖脂复合物的合成。在0℃下,选择性氢解还原全保护三糖还原端丙基链上的叠氮基为氨基,制得化合物XS-30和XS-31,然后与丙炔酸衍生物反应,制得含有炔基化的三糖衍生物,最后通过点击化学反应与单磷酰类脂A衍生物进行偶联,制得相关的糖脂复合物。

关键词：结核分枝杆菌 PGLs 化学合成 mpla 糖脂

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NKT细胞与TLR4受体双重激动剂缀合Tn糖抗原的肿瘤疫苗的全合成与初步活性评价

NKT细胞与TLR4受体双重激动剂缀合Tn糖抗原的肿瘤疫苗的全合成与...

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作者：杨德盈广州中医药大学

学位级别：硕士

肿瘤相关的糖抗原（TACAs）一般属于T细胞非依赖性抗原,只产生低亲和力的IgM,具有免疫原性差和免疫耐受等缺点。因此,目前抗肿瘤糖疫苗面临的主要挑战是如何克服糖抗原的免疫耐受,增强其免疫原性,使机体产生高亲和力的IgG抗体和免疫记忆... 详细信息

肿瘤相关的糖抗原（TACAs）一般属于T细胞非依赖性抗原,只产生低亲和力的IgM,具有免疫原性差和免疫耐受等缺点。因此,目前抗肿瘤糖疫苗面临的主要挑战是如何克服糖抗原的免疫耐受,增强其免疫原性,使机体产生高亲和力的IgG抗体和免疫记忆,从而达到杀死肿瘤细胞的目的。经典的策略是将糖抗原与载体蛋白缀合来增强其免疫原性,但糖蛋白疫苗有偶联位点不确定、偶联率不稳定、组成成分复杂等缺点。目前研究表明:内源性佐剂如TLR4激动剂mpla和NKT细胞激动剂KRN7000,可以帮助糖抗原提呈到相应的免疫细胞,从而产生疫苗应答;将其代替载体蛋白,与TACAs糖抗原偶联得到两组分疫苗具有非常好免疫效果。同时,TACAs糖抗原Tn在多种肿瘤细胞中有过量表达,其糖蛋白疫苗正处于临床研究中,具有较好的发展前景。目的:为了克服糖蛋白疫苗自身的缺点,本课题中设计一类含有TLR4和NKT细胞激动剂（mpla和KRN7000）的Tn三组分疫苗,通过同时激活TLR4和NKT细胞,比单一激活免疫系统,以期产生更强的免疫应答,来克服Tn免疫原性差的弱点。同时我们也合成了 mpla-Tn、KRN7000-Tn二组分疫苗,为详细地研究其免疫活性与结构的关系及进一步Tn疫苗合理设计提供物质基础。方法:KRN7000构建砌块的合成:以D-半乳糖为起始原料进行乙酰化,对甲苯硫酚选择性保护O-1位;脱去所有的乙酰基,苯甲醛醛二甲缩醛选择性保护C-4位与C-6位羟基,苄基保护C-2位与C-3位羟基;还原成羟基的O-6位,被叠氮化钠取代得到得到糖基化供体;与植物鞘氨醇受体4糖苷化得到未脱保护的KRN7000;叠氮被还原成氨基,与己二酸酐反应得到6-位修饰的KRN7000砌块。Tn糖抗原砌块的合成:以D-氨基半乳糖盐酸盐为起始原料,O-2位变叠氮,O-1位、O-3位、O-4位与O-6位全乙酰化;脱掉O-1位的乙酰基,用三氯乙腈活化C-1位羟基得到糖基化供体;与带有炔基的苏氨酸受体糖基化,C-2位的叠氮还原成氨基并乙酰话,脱去芴甲氧羰酰基（Fmoc）得到Tn糖抗原砌块。mpla构建砌块的合成:乙酸酐取代化合物24的C-3位羟基得到糖基化供体;对化合物24的C-3位羟基进行溴苄保护,叠氮乙醇取代C-1位的对甲苯硫基,选择性还原6-位羟基得到糖基化受体;糖基化反应得到二糖,脱去O-2位与O-2’位的邻苯二甲酰基以及O-3’位的乙酰基,接上自制的脂肪酸链、选择性断开O-4位并接上磷酸基团得到mpla构建砌块。mpla-Tn-KRN7000三组分糖抗原抗肿瘤疫苗的偶合:KRN7000砌块与Tn糖抗原砌块经过酯化反应,脱去保护基团三甲基硅烷（TBS）与乙酰基得到带有炔基的砌块Tn-KRN7000;在碘化亚铜（CuI）与N,N-二异丙基乙胺（DIEA）的催化下砌块Tn-KRN7000的炔基与mpla砌块上的叠氮通过经典的点击反应（Click反应）偶合得到mpla-Tn-KRN7000三组分糖抗原抗肿瘤疫苗。二组分糖抗原抗肿瘤疫苗的偶合:Linker2通过经典的偶联反应（点击反应）偶联Tn砌块与1-位修饰的mpla砌块得到mpla-Tn二组分糖抗原抗肿瘤疫苗;偶联Tn砌块与KRN7000砌块得到KRN7000-Tn二组分糖抗原抗肿瘤疫苗。初步活性评价:对三个化合物进行初步的免疫活性研究,将三个化合物分别对小鼠进行1、14天、21天、28天进行免疫,对第21天采血样并测量其IgG抗体的滴度。结果与结论:通过化学方法合成了 mpla、Tn与KRN7000三个砌块;经过39步反应成功合成了 mpla-Tn-KRN7000三组分糖抗原抗肿瘤疫苗,同时合成mpla-Tn与KRN7000-Tn二组分糖抗原抗肿瘤疫苗作为阳性对照;目标产物化合物的结构通过核磁共振技术、高分辨质谱等方法确定;通过全合成的方法合成糖疫苗具有合成路线清晰、产物质量稳定可控的优点。初步免疫研究表明,mpla-Tn-KRN7000三组分疫苗诱导的IgG滴度显著高于mpla-Tn或KRN7000-Tn二组分疫苗;证明mpla-Tn-KRN7000三组分疫苗的双重佐剂的设计能有效提高Tn糖抗原的免疫原性,佐剂mpla和KRN7000在Tn抗原的特异性免疫中具有协同作用,能克服糖抗原免疫性弱和易产生免疫耐受性的缺点。

关键词： KRN7000 mpla 全合成糖抗原疫苗活性评价

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mpla及LTs63k联合辅佐SpaP的免疫保护研究

MPLA及LTs63k联合辅佐SpaP的免疫保护研究

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第十届全国免疫学学术大会

作者：刘开云张卫军付强杜方川徐丽敏中国人民解放军第三军医大学药学系微生物与生化药学教研室国家免疫制品技术工程研究中心

背景:单磷酸脂质A(mpla)来自沙门菌Re595脂质A,LTs63k是大肠杆菌不耐热肠毒素无毒突变体,它们在保留了强有力的黏膜刺激的同时且降低了毒性。Spa P是变异链球菌的外膜蛋白,对龋齿的免疫保护效果已被广泛研究。目前还未有通过mpla和LTs63... 详细信息

背景:单磷酸脂质A(mpla)来自沙门菌Re595脂质A,LTs63k是大肠杆菌不耐热肠毒素无毒突变体,它们在保留了强有力的黏膜刺激的同时且降低了毒性。Spa P是变异链球菌的外膜蛋白,对龋齿的免疫保护效果已被广泛研究。目前还未有通过mpla和LTs63k联合辅助Spa P抗原来增强龋齿免疫保护效果的文献报道。目的 :本研究用mpla与LTs63k佐剂联合辅佐Spa P抗原来验证唾液Ig A抗体应答水平增高及对变异链球菌感染的免疫保护效果。方法 :选取SPF级SD大鼠为研究对象,共分为5组,每组20只,mpla 10μg/只、LTs63k 20μg/只、Spa P 50μg/只。按0、7d、14d免疫程序进行滴鼻免疫,末次免疫后第7天检测唾液Ig A及血清Ig G水平,末次免疫后第14天用109cfu变异链球菌菌液进行连续3天的感染攻毒,一天2次。末次感染后10天、20天检测感染定植。使用t检验分析组间抗体应答水平及感染率,使用卡方检验比较组间差异。结果 :唾液Ig A抗体应答水平mpla+LT+Spa P组显著高于LT+Spa P组、mpla+Spa P组、Spa P组、对照组(Pmpla+Spa P组、LT+Spa P组显著高于Spa P组(P0.05)。保护率:mpla+LT+Spa P组、LT+Spa P组、mpla+Spa P组、Spa P组、对照组(70%、40%、30%、0%、0%),且mpla+LT+Spa P组与其它组间统计学有显著差异(Pmpla联合LTs63k辅助Spa P抗原不仅能显著促进唾液Ig A抗体应答,同时提高了免疫保护效果。这使mpla佐剂联合LTs63k佐剂来辅助抗原以增强免疫保护效果成为了可能。

关键词： mpla LTs63k SpaP 变异链球菌

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