检索结果-南通市图书馆

作者：荣小营西南大学

学位级别：硕士

甘蓝等芸薹属植物的自交不亲和性在遗传上受一个带有复等位基因的多态性S位点（S-locus）控制,并且存在着一个以S位点基因介导的自交不亲和信号传导途径。但是,关于这条信号传导途径相关元件编码基因之间的连锁关系、以及它们与S位点的... 详细信息

甘蓝等芸薹属植物的自交不亲和性在遗传上受一个带有复等位基因的多态性S位点（S-locus）控制,并且存在着一个以S位点基因介导的自交不亲和信号传导途径。但是,关于这条信号传导途径相关元件编码基因之间的连锁关系、以及它们与S位点的连锁关系和在甘蓝染色体上的具体位置分布至今未见报道。另外,甘蓝是芸薹属的三个基本种之一,在芸薹属的自然和人工合成过程中,甘蓝的染色体组参与的染色体配对行为十分普遍,染色体之间的重排率很高,极大地影响着甘蓝自交不亲和基因在芸薹属间的转移和遗传变异。因此,对自交不亲和基因进行染色体定位和DNA纤维定位,对芸薹属物种自交不亲和性的研究和利用具有十分重要的意义。本研究采用荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization,FISH）技术,以mlpk和SSP基因片段为探针,分别在甘蓝有丝分裂前中期染色体、减数分裂早粗线期染色体以及伸长DNA纤维（extended DNA fibers,EDFs）等3种分辨率水平的靶DNA载体上进行全面的物理定位研究。旨在为孢子体型自交不亲和性机理和信号转导途径的明确以及自交不亲和性基因的遗传变异的研究提供全新内容,并为下一步甘蓝高分辨率物理图谱的构建和细胞遗传图谱的整合打下坚实的基础。主要研究结果如下: 1.通过对相关程序的探索优化,建立了适合于甘蓝的FISH靶DNA载体制备技术流程,利用该技术体系成功制备出甘蓝有丝分裂前中期染色体、减数分裂早粗线期染色体以及伸长DNA纤维等3种层次的靶DNA载体。（1）本研究采用变温处理同步化诱导方法,使甘蓝有丝分裂前中期染色体分裂相比率达到80%以上,显著的提高了前中期染色体制片的分裂相数目。（2）甘蓝根尖在20℃条件下,采用0.002 mol/L 8-羟基喹啉预处理1h,效果最佳。（3）采用2%纤维素酶和2%果胶酶混合液37℃酶解约2h、0.075mol/L的KCl在25℃低渗30min的解离条件,制备的甘蓝前中期染色体效果最佳;采用2%纤维素酶和2%果胶酶混合酶液37℃解离约3h的方法,可获得伸展良好、背景干净的粗线期染色体。（4）采用改进的细胞核提取方法,制备出了分布较均匀、密度合适的细胞核;STE细胞核裂解液作用时间须控制在5～8min;采用分子梳理法成功制备出伸展程度较均匀,大多呈平行状态的DNA纤维。 2.通过对相关相关技术参数的探索,建立了适用于3种伸长度染色体的FISH技术体系。在前中期和早粗线期染色体上采用的FISH程序基本一致,而EDFs-FISH中,制片无需进行前处理和预变性,杂交液中探针浓度以及杂交后洗脱温度略有不同,其余程序在3种载体上可保持一致。实验结果表明,均取得较好的杂交效果,证明该方法的可行性。（1）染色体杂交前处理是否充分直接影响到原位杂交的信号检出率和信噪比的高低。（2）前中期及早粗线期染色体在70%去离子甲酰胺中,70℃变性2min,效果最佳;若变性时间稍长,对前中期染色体的影响更为明显。（3）FISH的最佳杂交液组成为:50%（v/v）去离子甲酰胺、7.5%（v/v）硫酸葡聚糖、2×SSC、1.5ng/μL探针（EDFs-FISH 0.5ng/μL）、0.5%（w/v）SDS、0.5μg/μL ssDNA。（4）针对单、低拷贝探针的3级洗脱,37℃获得的杂交信号比较稳定,信噪比较高。对于EDFs-FISH,将温度提高到40℃,能更好地减少非特异信号,提高信噪比。（5）利用抗体偶联物进行信号的级联放大,对于杂交信号检出率的提高影响显著。 3.在甘蓝前中期染色体上,mlpk与SSP探针都只在1对同源染色体上检测到绿色杂交信号。mlpk与5SrDNA探针信号存在于同一对染色体上,位于1对近中着丝粒染色体的短臂中部;SSP探针信号位于1对具有随体的近端着丝粒染色体的长臂端部。没有观察到同时出现在姊妹染色单体上的双点信号现象。mlpk探针的检出率为11.8%,SSP探针为9.1%。mlpk和SSP探针在甘蓝减数分裂早粗线期染色体上,1个分裂相内最多只观察到2个同源杂交信号,探针信号的检出率分别为31.4%和20.4%。 4.本研究使用的伸长DNA纤维的分辨率约为1.5kb。在每条DNA纤维上,1.7kb的mlpk和1.2kb的SSP探针都呈现单个的绿色杂交信号点,推断mlpk与SSP在1条DNA纤维（染色体）上可能只有1个拷贝。综合分析mlpk与SSP在3种分辨率水平的靶DNA载体上的FISH结果判断,在甘蓝染色体组中mlpk与SSP基因可能都只有1个同源序列座位,初步证明二者在甘蓝单倍体基因组中的单拷贝性。 5

关键词：甘蓝自交不亲和性 mlpk SSP 荧光原位杂交

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通过mlpk,SLG基因调控表达控制甘蓝自交不亲和性的研究

通过MLPK,SLG基因调控表达控制甘蓝自交不亲和性的研究

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作者：何绍敏西南大学

学位级别：硕士

自交不亲和性（Self-incompatibility,SI）是显花植物在长期进化过程中,雌蕊的柱头或者花柱可以辨别自体和异体花粉,阻止自体受粉而利于异花授粉,从而保持高度杂合性促进远缘繁殖时产生的一种重要生殖机制。SI现象在显花植物中非常普遍... 详细信息

自交不亲和性（Self-incompatibility,SI）是显花植物在长期进化过程中,雌蕊的柱头或者花柱可以辨别自体和异体花粉,阻止自体受粉而利于异花授粉,从而保持高度杂合性促进远缘繁殖时产生的一种重要生殖机制。SI现象在显花植物中非常普遍,生产中利用不同单倍型的自交不亲和系进行杂种配制,是芸薹属植物杂交育种的重要方式。甘蓝（Brassica oeracea L.）作为世界上重要的十字花科蔬菜作物,也是我国秋冬季重要的叶菜类蔬菜作物。自交不亲和性是甘蓝杂种生产的重要途径,具有杂种优势较强、选育易、周期短等优点。目前,甘蓝自交不亲和系的选育和繁殖主要采用蕾期人工剥蕾授粉,该方法操作麻烦、效率低、费工费时、制种成本高,大大降低了甘蓝杂种生产的经济效益。因此,如何实现自交不亲和系的简便繁殖成为甘蓝育种家们一直期望解决的问题。包括化学、物理、生物学及机械等方法被用于克服自交不亲和以实现花期自交授粉。如花期喷洒一定浓度的Nacl溶液和硼酸,电刺激,高温处理,混合花粉授粉,CO2处理,Y射线辐射,钢刷授粉等。这些方法虽然能够在一定程度上提高甘蓝自交结实率,但是这些方法操作复杂易使柱头受伤,田间操作难度大。随着自交不亲和性遗传机制及其分子机理越来越明晰,利用现代分子生物学手段,有望从根本上解决自交不亲和的调控问题。为进一步研究自交不亲和关键因子对自交不亲和性的影响,开发甘蓝自交不亲和性人工调控生物技术手段,本研究通过农杆菌介导转化法将柱头特异启动子SLR驱动下的反义mlpk基因和在柱头特异启动子SLG13驱动下的SLGi基因导入自交不亲和甘蓝材料‘TF’,通过反义干扰mlpk基因和RNA干扰SLG基因的表达,研究mlpk和SLG在自交不亲和信号传导过程中的作用及功能,为解析mlpk和SLG基因参与芸薹属SI信号传导的机制提供直接或间接的试验证据。另外,将Cre/loxp重组系统和AlcR/alcA乙醇诱导基因表达系统相结合,构建了一套基于乙醇诱导表达的甘蓝自交不亲和性人工调控系统,实现甘蓝自交不亲和系的简便繁殖和F。制种应用。本研究中获得主要结果如下：1、构建了以Bar基因为筛选标记的植物表达载体pCABarmlpk,通过农杆菌介导法将其导入自交不亲和甘蓝‘TF’中。花期柱头mlpk基因的表达显示,转基因甘蓝植株花期柱头内源mlpk mRNA积累量明显低于野生型对照植株。花粉原位萌发的荧光显微观察结果显示,转基因甘蓝植株花期自交后,吸附在柱头上的花粉粒大量萌发,且穿过柱头的花粉管明显增加,并导致花期自交结籽数量上升,转基因植株花期和蕾期自交亲和指数均明显高于野生型对照植株。试验结果表明,下调mlpk基因表达能部分打破甘蓝自交不亲和,提高其花期自交结籽能力。2、通过农杆菌介导转化法将pCABarSLGi载体导入高度自交不亲和甘蓝材料‘TF’。花粉原位萌发荧光显微观察结果显示,转基因甘蓝植株花期自交授粉后大量花粉粒被吸附于柱头表面并萌发,可见明显的花粉管束穿过柱头,导致花期自交结籽数量增加,其花期自交亲和指数在1.03-13.96之间,显著高于花期自交亲和指数为0.06的野生型对照植株。荧光定量PCR分析显示,转基因甘蓝植株花期柱头中的SLG基因mRNA积累量显著低于非转基因野生型植株。结果表明,干扰内源SLG基因的表达,对打破甘蓝自交不亲和性有积极作用,可导致花期自交结籽能力大幅度上升。3、将组合有Cre/loxp重组系统和AlcR/alcA乙醇诱导基因表达系统以及SLGi干扰结构的植物表达载体pCABaralcRSLGi,通过农杆菌介导转化法导入高度自交不亲和甘蓝材料‘TF’。花粉原位萌发荧光显微观察结果显示,转基因植株花期自交可见大量花粉粒被吸附于柱头表面并大量萌发形成花粉管束穿过柱头。转基因植株花期自交后亲和指数在0.66-14.7之间,均显著高于野生型对照植株。荧光定量PCR分析结果显示,转基因甘蓝植株在花期柱头中的SLG基因]mRNA积累量显著低于非转基因野生型植株mRNA积累量,并可在柱头中检测到alcR基因的表达。对pCABaralcRSLGi-5 T,代转基因植株用1%-5%浓度的乙醇进行灌根处理,显示5%浓度的乙醇诱导能够高效删除SLG-RNAi基因干扰表达盒。进一步对5个不同的pCABaralcRSLGi转基因单株后代群体利用5%的乙醇处理三次,结果显示,仅17号单株T1代植株获得高达60%的删除效率,其余单株后代在同样处理条件下删除效率较低,删除不完全导致嵌合体产生。基于pCABaralcRSLGi-5的后代单株乙醇诱导后Bar基因、alcR基因以及Cre基因表达随诱导时间的变化结果显示,随着乙醇诱导时间的增加,Bar基因mRNA积累量逐渐增加,而alcR基因因不断删除,其mRNA积累量逐渐下降,与此同时,Cre基因

关键词：甘蓝自交不亲和 mlpk SLG基因抑制表达 AlcR/alcA乙醇诱导系统 Cre/loxP重组系统

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芸薹属SI关键元件mlpk互作蛋白的筛选与分离

芸薹属SI关键元件MLPK互作蛋白的筛选与分离

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作者：梁云飞西南大学

学位级别：硕士

自交不亲和性(Self-incompatibility,SI)普遍存在于显花植物中,是植物在长期进化中形成的一种防止自交衰败、保持物种多样性的重要遗传机制。同时,自交不亲和系又是十字花科芸薹属作物杂交育种中重要的亲本材料。因此,深入开展自交不亲... 详细信息

自交不亲和性(Self-incompatibility,SI)普遍存在于显花植物中,是植物在长期进化中形成的一种防止自交衰败、保持物种多样性的重要遗传机制。同时,自交不亲和系又是十字花科芸薹属作物杂交育种中重要的亲本材料。因此,深入开展自交不亲和信号传导机理的研究,即可为阐明植物胞间信号传导提供新的内容,也可为生产上利用自交不亲和系配制杂交种提供理论依据。过去人们普遍认为,十字花科孢子体型自交不亲和柱头内信号传导过程是沿着SRK-ARC1-Exo70A1途径进行,但是近年来的研究表明,在转基因欧洲油菜和琴叶拟南芥中抑制ARC1的表达或者超表达Exo70A1都只能部分打破材料的自交不亲和性,由此说明ARC1-Exo70A1信号通路可能只是SRK下游信号传递途径的一个分支。柱头内可能存在其他的SI信号元件和信号传递分支与ARC1-Exo70A1共同传递来自于SRK的下游信号。本研究以自交亲和芜菁突变体SCM1和SCM2、自交不亲和甘蓝A4为材料,扩增了SRK、SCR、mlpk、ARC1、Exo70A1基因编码序列,对SI相关基因做了序列和表达分析;成功构建了基于酵母双杂交的mlpk短截体诱饵蛋白,并利用其与ARC1互作验证了mlpk短截体诱饵蛋白可行性。在对甘蓝PUB家族基因全基因组鉴定和分析后,用构建的mlpk短截体诱饵蛋白筛选互作的PUB家族基因。取得了以下结果:(1)甘蓝、芜菁SI元件的克隆与表达分析以甘蓝A4,芜菁SCM1、SCM2的柱头和花粉cDNA为模版,通过高保真酶扩增三种材料的SRK、SCR、mlpkf1、mlpkf2、mlpkn1、ARC1、Exo70A1的基因,用荧光定量PCR分析这些SI相关基因在三种材料中的表达情况。经序列分析,SCR、ARC1、Exo70A1氨基酸序列在甘蓝和芜菁中具有较高的保守性,甘蓝SRK基因为S28单倍型,存在天然缺失的情况,既可以扩增到基因全长也能扩增到缺失突变体,两种芜菁材料SRK为f2单倍型,既可以扩增到SRK基因全长也能扩增到SRK缺失突变体。芜菁材料mlpk存在关键位点氨基酸突变,194位的甘氨酸G突变为精氨酸R,丧失了自体磷酸化能力。对SI基因的表达情况分析后发现,SI的各种关键元件在甘蓝和芜菁材料中都能正常表达,不同SI元件表达量在不同材料中互有高低。(2)mlpk诱饵蛋白构建及其与ARC1互作验证依据蛋白功能域分析,分别构建了mlpk和ARC1短截体,经过对mlpk和ARC1结构域进行生物信息学分析发现,mlpk包含蛋白激酶域;ARC1包含臂重复区、U-box、亮氨酸拉链和卷曲螺旋。mlpk为定位于膜上的受体激酶,为此我们构建了mlpk去掉膜定位序列的短截体,将构建的mlpk短截体亚克隆至pGADT7,将构建的ARC1短截体亚克隆至pGBKT7,用PEG/LiAc法实施转化至AH109酵母感受态,构建的mlpk、ARC1短截体均无自激活和毒性,互作分析表明mlpk-M3M4与ARC1臂重复区互作最强,mlpk-M2M4也能与ARC1臂重复区互作,其他组合均不能互作。(3)mlpk短截体的亚细胞定位研究为了分析酵母双杂交检测不到全长mlpk与ARC1相互作用是否与mlpk不能引入细胞核有关。我们通过亚细胞定位试验观察去掉膜定位信号区的mlpk短截体定位情况。将mlpk短截体亚克隆至1391载体后,用EHA105农杆菌侵染洋葱表皮细胞的方法来进行亚细胞定位,在共聚焦显微镜下观察荧光情况。结果表明,融合蛋白GFP-mlpk全长仅在洋葱细胞膜表达,融合蛋白GFP-mlpk核心在细胞核、细胞质、细胞膜均有表达。(4)PUB家族基因的挖掘与分析利用HMMER软件对PUB保守域序列PF04564进行全基因组检索,使用结构域预测SMART软件分析HMMER软件筛选获得的PUB基因是否包含PUB结构域,利用MEGA进化分析软件对PUB氨基酸序列进行进化分析。本研究鉴定出96个甘蓝PUB成员,101个芜菁PUB成员,70个琴叶拟南芥PUB成员,62个拟南芥PUB成员。根据PUB基因的结构域的组成不同,把甘蓝分成6类,把芜菁分成12类,把琴叶拟南芥分成6类,把拟南芥分成8类。尽管甘蓝PUB家族基因由不同的结构域组成,但是U-box结构域序列较为保守。在甘蓝PUB蛋白进化关系中BoPUB95、BoPUB25、ARC1在一个分支上,其中BoPUB25与ARC1亲缘关系最近,BoPUB30、BoPUB3、BoPUB56、BoPUB43、BoPUB75、BoPUB69在进化上处于同一个分支。(5)mlpk诱饵蛋白筛选与其互作的甘蓝PUB家族成员筛选与ARC1处于同一分枝的所有的甘蓝PUB序列分别是BoPUB43,BoPUB75,BoPUB30,BoPUB3,BoPUB56,BoPUB69,BoPU

关键词：甘蓝自交不亲和 mlpk 克隆与表达蛋白互作

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油菜自交不亲和反应相关基因mlpk和ARC1的功能研究

油菜自交不亲和反应相关基因MLPK和ARC1的功能研究

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作者：陈芳华中农业大学

学位级别：硕士

芸薹属植物为了防止自交结实,促进异交,保持遗传多样性,进化出了自交不亲和系统。已发现的自交不亲和相关基因有SCR、SRK、THL-1、THL-2、Exo70A1、GLO1、ARC1和mlpk。RNA干涉ARC1能部分打破甘蓝型油菜“W1”自交不亲和反应,mlpk突变能... 详细信息

芸薹属植物为了防止自交结实,促进异交,保持遗传多样性,进化出了自交不亲和系统。已发现的自交不亲和相关基因有SCR、SRK、THL-1、THL-2、Exo70A1、GLO1、ARC1和mlpk。RNA干涉ARC1能部分打破甘蓝型油菜“W1”自交不亲和反应,mlpk突变能彻底打破白菜自交不亲和,但mlpk不参与拟南芥的自交不亲和反应,在油菜中的功能还未知。本文利用CRISPR和RNAi技术以甘蓝型油菜自交不亲和系“S-70”为材料,来研究BnARC1和Bnmlpk的基因功能。主要结果如下:1.克隆甘蓝型油菜Bnmlpk的4个拷贝克隆“S-70”Bnmlpk的4个的拷贝,分别命名为BnA3mlpk、BnC3mlpk、BnA4mlpk和BnC4mlpk。BnA3mlpk和BnC3mlpk氨基酸序列分别与Brmlpk和Bomlpk相似;BnA4mlpk和BnC4mlpk氨基酸序列分别与Brmlpkn1和Bomlpkn1相似。BnA3mlpk有BnA3mlpkf1和Bn A3mlpkf2两个转录本,其他拷贝均只有1个转录本。BnA3mlpkf 2蛋白N端为胞质区和跨膜区,其他转录本蛋白N端为脂质锚定区,所有转录本蛋白C端均为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶区。***突变彻底打破甘蓝型油菜自交不亲和Bnmlpk CRISPR载体转化“S-70”获得31株T代植株。其中,6个T株系Bnmlpk发生编辑,120株T中,50株角果伸长并大量结籽。说明Bnmlpk突变能打破自交不亲和,是自交不亲和正调控因子。***影响自交不亲和反应相关基因表达亲和因子GLO1表达量在野生型“S-70”自交授粉后显著下降,而在Bnmlpk CRISPR突变体中没有变化;自交不亲和因子SRK在Bnmlpk突变体中表达量比野生型“S-70”低。表明Bnmlpk影响GLO1的表达且与不亲和因子SRK的转录有关。4.下调表达ARC1可部分打破自交不亲和克隆“S-70”2个BnARC1的拷贝,分别命名为BnARC1-1和BnARC1-2。构建CRISPR和RNAi载体分别转化“S-70”,获得42个CRISPR T代阳性株,8个T代株系BnARC1发生编辑,180株T代植株角果不结籽或极少结籽,表现自交不亲和;获得3个T代RNAi阳性植株,T代有1/4的植株部分角果伸长并结实,所以RNAi干涉BnARC1可部分打破自交不亲和。

关键词：甘蓝型油菜自交不亲和 mlpk ARC1 CRISPR RNAi 功能验证

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甘蓝SRK激酶结构域编码区的克隆及其与mlpk的双色FISH定位研究

甘蓝SRK激酶结构域编码区的克隆及其与MLPK的双色FISH定位研究

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作者：黄丹西南大学

学位级别：硕士

芸薹属自交不亲和性由S位点所控制。SRK基因是决定自交不亲和性反应的关键因子,前人已经从芸薹属中的甘蓝、甘蓝型油菜等物种中克隆出SRK基因。SRK基因的变异和表达量都会影响自交不亲和性。SRK基因的胞外域有着较大的多态性,变异常常... 详细信息

芸薹属自交不亲和性由S位点所控制。SRK基因是决定自交不亲和性反应的关键因子,前人已经从芸薹属中的甘蓝、甘蓝型油菜等物种中克隆出SRK基因。SRK基因的变异和表达量都会影响自交不亲和性。SRK基因的胞外域有着较大的多态性,变异常常发生在此编码区。相对于胞外域,激酶结构域的保守型较强。本文专门对SRK基因激酶结构域进行了克隆分析,以期从进化的角度探讨激酶结构域对于自交不亲和性的作用。除此之外,mlpk被证明也是SI反应中必不可少的一个因子,作为SRK下游元件起作用。本文针对这两个基因在SI中的重要性,利用FISH技术将SRK和mlpk进行物理定位,从而探索其在甘蓝基因组中的分布及其拷贝数。得到的主要研究结果如下： 1.以结球甘蓝263、羽衣甘蓝AY627和甘蓝型油菜S11为材料,采用PCR、RT-PCR等技术,分别对SRK激酶结构域基因组DNA和cDNA进行了扩增、测序和序列分析,并构建了分子进化树。分别获得了1694bp和1307bp的片段、1705bp和1229bp的片段和1606bp和1214bp的片段,分别编码433,407和402个氨基酸。对获得的片段进行比对发现,结球甘蓝263包括5个外显子和4个内含子,羽衣甘蓝AY627和甘蓝型油菜S11包括6个外显子和5个内含子。并且发现结球甘蓝263的内含子少1个,并且有一段70bp左右的插入片段。对已报道的21种SRK基因和本文所克隆的3种材料的序列构建分子进化树,发现三者都与S单倍型的Ⅰ类SRK基因聚在一起,Ⅱ类基因与Ⅰ类基因分为两支,拟南芥与Ⅱ类聚在一起,而萝卜属未形成单独的一支。推导甘蓝26370bp片段的插入有可能是内含子转化而来并导致了自交不亲和性的产生。羽衣甘蓝AY627与甘蓝型油菜S11所获得的片段与预期一致,激酶结构域没有发生片段的插入或缺失,推导导致甘蓝型油菜S11自交不亲和性的原因没有发生在激酶结构域部分。通过进化树飞分析推导出萝卜属与芸薹属的分离晚于SRKⅠ类和Ⅱ类的分离。 2.在FISH过程中,对甘蓝根尖前中期染色体和DNA纤维的制片进行了一些条件的改变,试图提高FISH效果。在前中期染色体制片中,本文对冷处理时间和酶解时间进行了改变,将冷处理时间定在20h,酶解时间定在90min,制得的染色体图片前中期分裂相较多,并且粘连程度较低,背景也较干净。在DNA纤维制片中,细胞核的提取过程中,控制研磨力度和加入TritonX-100的量进行了改变;DNA纤维制片时,改变了细胞核裂解液的裂解时间。通过以上改变,降低了纤维的缠绕程度。 3.用经过以上改变条件制得的片子进行FISH。通过对前中期染色体的FISH结果表明,能够分别检测出两种颜色的信号,但是其信号检测率不高,推导其原因是除染色体本身的质量外,探针的单拷贝和小片段特点也是影响其效果的原因,所以本实验只能将SRK和mlpk初步定义在第l号染色体和第3号染色体上。通过对DNA纤维时期的FISH结果,未能检测出明显信号,推测其原因,在制片的过程中,不能从其理化性质来判断其制片的好坏,导致了FISH不甚理想。

关键词：甘蓝自交不亲和性 SRK mlpk 荧光原位杂交

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芸薹属中自交不亲和反应的信号转导

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植物生理学通讯 2005年第4期41卷 547-552页

作者：芦岩李玉花东北林业大学花卉生物工程研究所哈尔滨150040

自交不亲和现象在芸薹属(Brassica)植物中普遍存在,芸薹属中表现的是典型的孢子体型自交不亲和性。单元特异性的S位点受体激酶(SRK)基因和S位点花粉胞被蛋白(SCR/SP11)发生识别后,一系列相关蛋白——臂重复蛋白(ARC1)、M位点蛋白激酶(ML... 详细信息

自交不亲和现象在芸薹属(Brassica)植物中普遍存在,芸薹属中表现的是典型的孢子体型自交不亲和性。单元特异性的S位点受体激酶(SRK)基因和S位点花粉胞被蛋白(SCR/SP11)发生识别后,一系列相关蛋白——臂重复蛋白(ARC1)、M位点蛋白激酶(mlpk)等,引发了自交不亲和反应信号的传导,最终产生自交不亲和反应。文章就这方面的研究进展作介绍。

关键词：孢子体自交不亲和 ARC1 mlpk 信号转导自交不亲和性芸薹属反应 S位点受体激酶相关蛋白孢子体型

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羽衣甘蓝M位点蛋白激酶的表达及相互作用蛋白的研究

羽衣甘蓝M位点蛋白激酶的表达及相互作用蛋白的研究

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作者：李双辉东北林业大学

学位级别：硕士

植物自交不亲和性(Self-incompatibility,SI)是很多显花植物促进异交防止自交的一种机制。M位点蛋白激酶(M locus site pretion kinase,mlpk)是存在于柱头中的SI信号正向调节因子。羽衣甘蓝(Brassica oleracea ***)是十字花科芸薹属植物... 详细信息

植物自交不亲和性(Self-incompatibility,SI)是很多显花植物促进异交防止自交的一种机制。M位点蛋白激酶(M locus site pretion kinase,mlpk)是存在于柱头中的SI信号正向调节因子。羽衣甘蓝(Brassica oleracea ***)是十字花科芸薹属植物,具有观赏价值和良好的耐寒性,是北方重要的园艺植物之一,芸薹属植物是植物自交不亲和性的主要研究对象之一。本试验以羽衣甘蓝SS为试验材料,克隆Bomlpkf1和Bomlpkf2全长基因,并进行序列分析;利用原核表达系统获得Bomlpkf1和Bomlpkf2公共激酶域Bomlpk-KD的融合蛋白,制备Bomlpkf1、Bomlpkf2和Bomlpk-KD的多克隆抗体;检测Bomlpkf1和Bomlpkf2在羽衣甘蓝中的表达情况;克隆前期筛选到的与Bomlpk相互作用的蛋白聚糖样蛋白(proteoglycan-like protein,PGLP),对其进行蛋白表达和定位的分析;利用双荧光素酶互补实验分析BoPGLP与Bomlpk的相互作用。主要研究结果如下:1.利用RT-PCR获得Bomlpkf1和Bomlpkf2全长序列,Bomlpkf1的开放阅读框长度为1215bp,编码404个氨基酸,Bomlpkf2的开放阅读框长度为1233bp,编码410个氨基酸。序列比对显示Bomlpkf1和Bomlpkf2与芜菁(Brassica rapa)、油菜(Brassica napus)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)中同源蛋白相似度较高,N端重要结构域保守。2.构建融合表达载体pCold-SUMO-mlpk-KD,在大肠杆菌中诱导并纯化获得Bomlpk-KD融合蛋白,大小约58k Da。根据Bomlpkf1和Bomlpkf2的N端序列特异性设计合成多肽,与获得的Bomlpk-KD融合蛋白分别免疫小鼠,获得多克隆抗体。3.利用实时定量PCR检测Bomlpkf1和Bomlpkf2基因表达情况,发现Bomlpkf1在羽衣甘蓝柱头、花柱和子房较高,在萼片、花瓣和花药中表达量较低;Bomlpkf2在柱头中大量表达,在其他组织少量表达。利用免疫印迹检测Bomlpkf1和Bomlpkf2蛋白表达情况,发现Bomlpkf1在萼片中表达量较低,在花瓣、花药、柱头、花柱和子房中均有表达;Bomlpkf2仅发现在柱头中表达。4.利用5’RACE克隆BoPGLP全长基因,发现BoPGLP开放阅读框长度为390bp,编码129个氨基酸序列;构建融合表达载体p ET-14b-PGLP,在大肠杆菌中纯化获得BoPGLP重组蛋白,免疫小鼠获得多克隆抗体。5.利用免疫印迹检测BoPGLP蛋白表达情况,发现BoPGLP在萼片、花药和子房中表达较少,在花瓣、柱头和花柱中表达交多;BoPGLP在柱头发育的S2和S3时期表达较多,在S1、S4和S5时期表达较少。6.构建融合表达载体p A7-GFP-PGLP,利用真空渗透法转入洋葱表皮细胞,荧光显微镜观察发现荧光信号集中在洋葱细胞壁上,说明BoPGLP定位在细胞膜上。7.在烟草中,利用双荧光素酶互补实验分析羽衣甘蓝mlpk与BoPGLP的相互作用关系,构建融合表达载体pCAMIA1300-c LUC-PGLP、pCAMIA1300-n LUC-mlpkf1、pCAMIA1300-n LUC-mlpkf2和pCAMIA1300-n LUC-mlpk-KD,转化农杆菌后注射烟草叶片,化学发光图像分析,检测到BoPGLP分别与Bomlpkf1、Bomlpkf2和Bomlpk-KD有相互作用荧光信号,说明其存在相互作用关系。

关键词：羽衣甘蓝自交不亲和 mlpk 原核表达 PGLP

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