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重庆医科大学学报 2024年第09期 1072-1078页

作者：张涛张莲张春冬重庆医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室重庆医科大学基础医学院组织学与胚胎学教研室

目的：构建稳定敲减Misshapen/NIK-related kinase(mink1)表达肺腺癌细胞系，并检测稳定敲减其表达后对细胞增殖、迁移运动及顺铂治疗的影响。方法：利用肺腺癌A549和PC-9细胞，基于pLKO.1-shRNA慢病毒基因敲减表达系统构建稳定敲减mink... 详细信息

目的：构建稳定敲减Misshapen/NIK-related kinase(mink1)表达肺腺癌细胞系，并检测稳定敲减其表达后对细胞增殖、迁移运动及顺铂治疗的影响。方法：利用肺腺癌A549和PC-9细胞，基于pLKO.1-shRNA慢病毒基因敲减表达系统构建稳定敲减mink1表达细胞系，分别通过qRT-PCR和Western bolt在mRNA和蛋白水平检测敲减效率。CCK-8和Transwell检测稳定敲减mink1表达对细胞增殖和迁移运动的影响，流式细胞检测细胞周期与凋亡变化情况；分析稳定敲减mink1表达对顺铂治疗敏感性变化情况，并通过免疫荧光染色DNA损伤标志物γH2AX检测细胞DNA损伤水平。结果：qRT-PCR和Western bolt分析结果显示2个特异shRNA均可显著下调mink1表达。稳定敲减mink1表达的肺腺癌细胞增殖能力降低，迁移运动能力下降；且敲减mink1表达明显增强化疗药物顺铂对癌细胞杀伤作用，并诱导DNA损伤水平增加。结论：利用肺腺癌A549和PC-9细胞成功构建稳定敲减mink1肺腺癌细胞系，而稳定敲减其表达可抑制癌细胞增殖及迁移运动，且可能通过调节DNA损伤修复过程促肺癌细胞耐药。

关键词：肺腺癌 mink1 细胞增殖迁移运动 DNA损伤修复

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mink1调节核纤层稳定控制肺癌细胞衰老的分子机制究

MINK1调节核纤层稳定控制肺癌细胞衰老的分子机制究

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作者：尹讯重庆医科大学

学位级别：硕士

研究背景:肺癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,其发病率在男性和女性中分别占第一位和第二位,而致死率均高居肿瘤第一位。迄今为止,虽然通过手术、放疗化疗、靶向治疗和免疫治疗等多种方式治疗肺癌,但疗效有限。因此,积极探索开发肿瘤治疗... 详细信息

研究背景:肺癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,其发病率在男性和女性中分别占第一位和第二位,而致死率均高居肿瘤第一位。迄今为止,虽然通过手术、放疗化疗、靶向治疗和免疫治疗等多种方式治疗肺癌,但疗效有限。因此,积极探索开发肿瘤治疗新策略,对提高肺癌患者的生存率和改善患者的生存质量具有重大的理论和现实意义。细胞衰老是由应激损伤或某些生理改变而触发的一种细胞反应,其特征是长时间的、不可逆的细胞周期停滞,具有细胞炎性因子分泌、大分子损伤和代谢改变等特性。发生衰老的细胞即使在最佳生长环境和最有效有丝分裂源刺激下,细胞仍然无法摆脱增殖停滞的一种永久化状态。而癌细胞是一种借助各种机制摆脱Hayflick限制的具有无限增殖能力的细胞。已有研究表明,细胞衰老在肿瘤发生发展进程中具有抑癌与促癌双重作用。恶性肿瘤发生初期DNA损伤等诱导的细胞衰老抑制细胞增殖从而阻止细胞恶性转化,但肿瘤发生后期衰老细胞释放的衰老相关分泌因子(SASP)诱导的炎症反应具有促肿瘤发生作用。虽然现在很多研究都已阐述衰老和肿瘤的关系及作用机制,但细胞衰老具体如何与肿瘤细胞互动仍有待进一步探索。mink1是哺乳动物STE20/MAP4K家族成员之一,具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性。mink1最初作为促炎症反应的一个重要激酶,并调节多种细胞进程,包括细胞形态、细胞骨架重排和细胞存活。在本研究中,我们发现mink1调节肺癌细胞核纤层稳定并控制细胞衰老。目的:探讨mink1(Misshapen-like kinase 1)表达在调控肺癌细胞核纤层稳定及细胞衰老中的作用及潜在分子机制。方法:1.使用在线数据库及组织芯片分析mink1在肺癌组织样本中的表达水平及与生存预后的关系。2.基于plk O.1-shRNA敲减载体构建稳定敲减mink1表达A549细胞,通过q RT-PCR和Western blot在m RNA和蛋白质表达水平检测敲减效率,并通过光学显微镜观察细胞形态变化情况。***8、平板克隆及流式细胞实验检测稳定敲减mink1表达细胞增殖变化情况。4.通过β-半乳糖苷酶染色检测mink1对细胞衰老的影响。q RTPCR检测细胞衰老分泌相关因子的表达水平。*** blot和免疫荧光检测核纤层组分Lamin A/C、Lamin B1、异染色质标记物H3K9me3及常染色质标记物H3K4me2蛋白质表达与亚细胞定位变化情况。6.透射电镜观察稳定敲减mink1表达细胞核间隙结构变化情况。7.低剂量顺铂处理A549构建细胞衰老模型,并通过β-半乳糖苷酶染色、免疫荧光、Western blot和平板克隆实验检测细胞衰老、DNA损伤变化及增殖抑制情况。8.稳定敲减mink1表达A549细胞联合低剂量顺铂处理后,通过β-半乳糖苷酶染色、免疫荧光、Western blot、平板克隆检测检测细胞衰老及增殖抑制情况。9.构建稳定表达mink1-3Flag表达A549细胞,免疫共沉淀银染切胶后联合质谱技术鉴定mink1潜在互作蛋白。结果:1.在线数据分析显示mink1在肺腺癌中m RNA表达水平显著高于癌旁组织。肺腺癌组织微阵列分析发现mink1在肺癌组织的表达量明显高于癌旁组织(P1),生存分析证明mink1表达水平与患者生存时间和生存率均显著负相关(P1-shRNA表达载体成功构建稳定敲减mink1表达肺腺癌A549细胞,与对照组相比,稳定敲减组中mink1的m RNA和蛋白表达水平均显著降低(Pmink1表达后导致细胞体积变大且部分细胞形态不规则。3.利用稳定敲减mink1表达细胞进行平板克隆和CCK8实验,结果显示与对照组相比,敲减mink1导致细胞增殖速率减慢。流式细胞检测结果显示与对照相比,敲减mink1表达对细胞周期无显著影响,且细胞凋亡速率变化不明显。4.β-半乳糖苷酶(β-gal)检测结果显示肺癌细胞中稳定敲减mink1表达后深蓝衰老细胞数量增加。且q RT-PCR检测结果显示,于对照组细胞相比,衰老相关辅助分泌因子:IL-6、TNF、CCL2、MMP9等在定敲减mink1表达细胞中显著上升。5.免疫荧光检测证明稳定敲减mink1表达后Lamin A/C和Lamin B1在细胞核膜周信号强度显著下降,且导致核膜出芽和微核。异染色质标记物H3K9me3由典型颗粒装转变为核内弥散型分布,常染色质标记物H3K4me2表达水平无显著变化。6.透射电镜检测结果证明稳定敲减mink1表达后细胞核形态/结构异常;对照组细胞中核间隙均匀程度高,异染色质在核内膜上正常分布;而稳定敲减mink1导致核间隙紊乱,且核膜周围异染色质丢失。7.利用化疗药物顺铂(DDP)建立低剂量衰老诱导模型。β-半乳糖苷酶染色结果显示,低剂量(2μ

关键词：肺腺癌 mink1 细胞衰老核纤层

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