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中国病理生理杂志 2004年第6期20卷 1035-1037页

作者：易军晖郭向明肖学珊贾小云黎仕强李家璋张丰生李鸵张清炯中山大学中山眼科中心广东广州510060 湖北恩施市人民医院眼科湖北恩施445000 内蒙古包头朝聚眼科医院内蒙古包头014005

目的 :分析位于 18p11.31的mettl4基因的单核苷酸多态 (SNPs) ,探讨它们与高度近视发病的关系。方法 :收集正常对照人群 71例及高度近视患者 177例 ,其中常染色体显性遗传家系先证者 (AD组 ) 5 9例、常染色体隐性遗传家系先证者 (AR组 )... 详细信息

目的 :分析位于 18p11.31的mettl4基因的单核苷酸多态 (SNPs) ,探讨它们与高度近视发病的关系。方法 :收集正常对照人群 71例及高度近视患者 177例 ,其中常染色体显性遗传家系先证者 (AD组 ) 5 9例、常染色体隐性遗传家系先证者 (AR组 ) 4 6例、无明显家系的散发患者 (SF组 ) 5 2例。制备外周血基因组DNA ,PCR扩增mettl4基因的外显子序列 ,应用异源双链 -单链构象多态性 (HA -SSCP)方法分析PCR产物 ,对存在差异条带的PCR产物进行测序分析。结果 :在mettl4基因的编码区发现 2个SNPs位点 :SNP74 38A→C位于第 2外显子 ,Glu 2 30Asp ,在GenBank未见报道 ;SNP131C→A位于第 4外显子 ,Gln310Lys。正常人与高度近视各组SNP74 38A→C的基因型分布无明显差异 ;AR高度近视组、SF高度近视组的SNP131C→A基因型分布与对照人群无显著差异 ,而AD高度近视与对照组差异显著 (P 4 38A→C与高度近视的发病无关。SNP131C→A与AD高度近视发病的关系需要进一步研究。

关键词：近视基因 mettl4 多态性单核苷酸

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mettl4在肝脏胰岛素信号通路中的作用及机制研究

METTL4在肝脏胰岛素信号通路中的作用及机制研究

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作者：姜云峰哈尔滨工业大学

学位级别：硕士

糖尿病作为一种代谢类的疾病,常常伴有高血糖的特征,胰岛素分泌缺陷及其作用受损均可导致高血糖的结果。在生物体内的糖代谢过程中肝脏参与的比重较大,可通过严格控制胰岛素与胰高血糖素两者的比例调节血糖的稳态。DNA甲基化是表观遗传... 详细信息

糖尿病作为一种代谢类的疾病,常常伴有高血糖的特征,胰岛素分泌缺陷及其作用受损均可导致高血糖的结果。在生物体内的糖代谢过程中肝脏参与的比重较大,可通过严格控制胰岛素与胰高血糖素两者的比例调节血糖的稳态。DNA甲基化是表观遗传调控的重要组成部分。N6-甲基腺嘌呤(6m A)是原核生物中最常见的DNA甲基化修饰,其在调控影响基因表达、错配修复等方面发挥了重要作用。mettl4作为真核生物中的甲基转移酶也被研究显示可能在影响脂肪细胞分化、调节RNA剪接、调控线粒体mt DNA的6m A等方面起到重要作用,不过这研究些尚且存在争议。mettl4可能与能量代谢、葡萄糖摄取、通过甲基化影响具基因表达、肥胖的形成等方面有密不可分的关系。本文旨在研究mettl4在胰岛素信号通路及肝脏糖代谢中的作用及其机制。在本课题中,对于mettl4在胰岛素信号通路的影响进行了探究。首先通过Western Blot实验得出了在野生型小鼠肝实质细胞中过表达mettl4处理不同浓度及时间的胰岛素会促进胰岛素信号通路相关蛋白的磷酸化水平并存在剂量依赖与时间依赖的作用,且在不处理胰岛素的基础状态下不会影响相关蛋白水平,提示mettl4在胰岛素刺激下的肝脏糖代谢过程中的胰岛素信号通路有促进作用;在肝实质细胞中过表达mettl4处理不同浓度的胰高血糖素,显示mettl4对于肝脏胰高血糖素信号通路不存在明显影响,证明mettl4更主要通过影响胰岛素信号通路影响糖代谢;在过表达mettl4并处理一定浓度的胰岛素后,通过银染与质谱分析,找到了与mettl4特异性结合的蛋白LRP1并通过免疫共沉淀实验验证了这一结果;构建了肝脏mettl4特异性敲除鼠,重复上述实验得出肝脏特异性敲除mettl4会导致胰岛素信号通路相关蛋白磷酸化水平的下降,并存在浓度与时间梯度的依赖效应,与上述过表达mettl4的实验结果相匹配,提示mettl4肝脏特异性敲除对于在胰岛素刺激下的肝脏糖代谢过程中的胰岛素信号通路有减弱作用。综上所述,本研究表明mettl4可以在胰岛素刺激下参与增强肝脏的胰岛素信号通路,并且对胰高血糖素信号通路无明显影响。肝脏mettl4特异性敲除鼠中在胰岛素刺激下的胰岛素信号通路水平减弱。这为mettl4的研究与完善胰岛素信号通路提供了帮助,为糖尿病的治疗提供了可能靶点。

关键词： mettl4 甲基转移酶胰岛素信号通路

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初探mettl4和YTHDF2对小鼠棕色脂肪组织功能的影响

初探METTL4和YTHDF2对小鼠棕色脂肪组织功能的影响

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作者：高铭哈尔滨工业大学

学位级别：硕士

肥胖及其相关疾病严重影响着人们的健康和社会经济的发展。在哺乳动物体内,棕色脂肪组织(brown adipose tissue,BAT)参与能量代谢,在寒冷、应激等情况下燃烧底物,使脂肪分解产生热能,对肥胖治疗具有积极的意义。但目前在甲基化水平上,... 详细信息

肥胖及其相关疾病严重影响着人们的健康和社会经济的发展。在哺乳动物体内,棕色脂肪组织(brown adipose tissue,BAT)参与能量代谢,在寒冷、应激等情况下燃烧底物,使脂肪分解产生热能,对肥胖治疗具有积极的意义。但目前在甲基化水平上,人们对棕色脂肪功能的研究尚不完全清楚。甲基化修饰是表观遗传学中调控基因表达的重要方式。N6-甲基腺嘌呤(6m A)是发现在生物中存在丰度较高且对生命过程影响较大的修饰类型之一。其中,mettl4是一种DNA甲基转移酶,有研究显示,mettl4在脂肪的形成中行使功能,mettl4基因敲除可能影响脂肪细胞分化,在脂代谢方向的更多功能有待研究。N6-腺苷酸甲基化(mA)是一种广泛存在于各类真核生物中的可逆的RNA甲基化修饰,YTHDF2是一种重要的功能蛋白,已被证明在许多生理、病理学中起着关键作用,并且,在脂代谢方向上,YTHDF2在脂肪生成调控上具有多方面作用,但是否可以调控棕色脂肪的分化尚未有研究进展。在本课题中,我们将对mettl4对棕色脂肪的功能影响进行探讨,首先检测高脂饮食诱导(HFD)和db/db两种肥胖模型小鼠的iBAT中mettl4的表达丰度,结果表明在HFD肥胖小鼠以及db/db小鼠的iBAT中,mettl4mRNA水平表达异常降低,提示mettl4有可能参与棕色脂肪的能量调控过程;随后,我们构建了iBAT中mettl4特异性敲除小鼠,检测mettl4在小鼠iBAT中敲除后的表型。结果显示,mettl4在iBAT中特异性敲除对其重量、形态、耐寒性等能量代谢表型未有影响,产热基因Ucp1的mRNA水平无变化,Western Blot检测线粒体功能基因、UCP1以及PPARγ的蛋白表达水平未发生变化,说明mettl4未通过参与经典的UCP1产热途径对小鼠的能量代谢产生影响。在探究YTHDF2对棕色脂肪功能的影响时,本研究首先体外分离原代棕色脂肪细胞(SVF)并诱导分化,RT-qPCR验证了YTHDF2在棕色脂肪细胞分化的过程中表达量增高;随后我们将Pparg和Ucp1转录本最后一个外显子和3′-UTR的mA修饰区域克隆到p MIR报告荧光素酶载体中,并在原代棕色前脂肪细胞中进行荧光素酶测定。在原代棕色脂肪细胞中,两个单独的si RNA(si Ythdf2-1和si Ythdf2-2)转染后导致YTHDF2蛋白水平显著降低,si Ythdf2-1和si Ythdf2-2分别显著降低Pparg和Ucp1荧光素酶活性,说明YTHDF2能识别Ucp1、Pparg mA修饰相关位点,可能调控其表达并影响棕色脂肪细胞分化。本研究很大的补充完善了甲基化与动物脂代谢领域的功能关系,丰富了脂肪生成的转录调控网络。

关键词： mettl4 YTHDF2 棕色脂肪 UCP1

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海马神经元线粒体DNA 6mA在血管性认知障碍中的作用研究

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中华神经医学杂志 2024年第8期23卷 757-768页

作者：陈子怡杨凌飞王开昕李庆生贾延劼龚哲郑州大学第一附属医院神经内科郑州450000

目的探讨海马神经元线粒体DNA N6-脱氧腺苷甲基化(6mA)在血管性认知障碍中的作用及相关机制。方法(1)体内实验:采用随机数字表法将SPF级健康雄性大鼠分为假手术组及慢性脑低灌注(CCH)组,每组12只。CCH组大鼠结扎双侧颈总动脉建立CCH模型... 详细信息

目的探讨海马神经元线粒体DNA N6-脱氧腺苷甲基化(6mA)在血管性认知障碍中的作用及相关机制。方法(1)体内实验:采用随机数字表法将SPF级健康雄性大鼠分为假手术组及慢性脑低灌注(CCH)组,每组12只。CCH组大鼠结扎双侧颈总动脉建立CCH模型;假手术组大鼠仅分离双侧颈总动脉,不结扎。2组大鼠于造模后第50天采用旷场实验检测探索能力,第51~53天采用新物体识别试验进行认知功能评估,第54~59天采用Morris水迷宫法检测学习记忆能力。随后处死大鼠检测海马组织ATP浓度及活性氧(ROS)荧光强度并通过TUNEL染色检测海马CA1区神经元凋亡情况。(2)体外实验:HT-22细胞分为正常对照(NC)组、氧糖剥夺(OGD)组、OGD+siControl组、OGD+simettl4组。其中NC组正常培养细胞,OGD组给予低糖低氧处理12 h,OGD+siControl组及OGD+simettl4组分别给予NC-siRNA、mettl4-siRNA转染细胞后低糖低氧处理12 h。通过透射电镜观察细胞线粒体形态,采用流式细胞术检测细胞ROS荧光强度,通过JC-1荧光染色检测细胞线粒体膜电位,使用试剂盒检测线粒体复合物Ⅰ、Ⅲ活性。(3)体内及体外实验:采用免疫荧光染色实验及Western blotting实验检测大鼠海马组织神经元线粒体及HT-22细胞线粒体中mettl4及DNA 6mA表达。结果(1)体内实验:与假手术组比较,CCH组大鼠出现认知障碍表现,表现为旷场实验中进入中心区域次数明显增多,探索新物体时间明显减少,水迷宫实验中穿越平台次数明显减少,逃避潜伏期明显延长,差异均有统计学意义(P4488.00±255.70)AUvs.(11644.00±530.20)AU],差异均有统计学意义(Pmettl4分布以线粒体为主,表达较假手术组大鼠均明显增加。Western blotting实验结果显示CCH组大鼠海马组织线粒体中mettl4表达较假手术组大鼠明显升高(1.729±0.168vs.1.000±0.000),差异有统计学意义(Pmettl4组细胞ATP生成明显增加,ROS生成明显减少,线粒体膜电位明显升高,线粒体复合物Ⅰ和Ⅲ活性明显增加,差异均有统计学意义(Pmettl4表达较NC组明显增加,且两者以在线粒体中表达为著;OGD+simettl4组细胞线粒体DNA(mtDNA)6mA及mettl4表达较OGD组细胞均明显降低。Western blotting实验结果显示,OGD+simettl4组细胞中mettl4表达较OGD组明显降低(1.578±0.261vs.2.970±0.280),差异有统计学意义(Pmettl4促使mtDNA 6mA表达增加,进而导致线粒体能量代谢障碍及ROS升高,可能为血管性认知障碍的机制之一。

关键词：血管性认知障碍慢性脑低灌注线粒体DNA 6mA mettl4

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