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RNAi沉默Mcpr1基因对小鼠腭突间充质细胞生物学行为的影响

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RNAi沉默Mcpr1基因对小鼠腭突间充质细胞生物学行为的影响

作者：张华利第四军医大学

学位级别：硕士

腭裂是口腔也是全身较常见的先天性发育畸形,在亚洲、尤其是中国更是高发。1996～2000年全国出生先天性畸形缺陷检测结果显示,先天性唇腭裂的发生率排在首位。对该畸形的治疗手段目前仅限于患者出生后的手术修补,术后仍然不能完全恢复... 详细信息

腭裂是口腔也是全身较常见的先天性发育畸形,在亚洲、尤其是中国更是高发。1996～2000年全国出生先天性畸形缺陷检测结果显示,先天性唇腭裂的发生率排在首位。对该畸形的治疗手段目前仅限于患者出生后的手术修补,术后仍然不能完全恢复患者语音功能,并影响以后牙齿萌出、排列和患者的心理健康。目前认为先天性腭裂属于多基因遗传性疾病,有许多基因协同作用参与疾病的发生。如能明确腭裂的发生机制,制定相应预防及早期诊断措施,将会有效预防腭裂畸形的发生。基因表达调控贯穿胚胎发育的整个过程,基因组的整套基因按照一定的时空规律进行表达,相互的正、负调控形成有序的调控网络,在胚胎发育中协调发挥作用。细胞增殖与凋亡的平衡是机体正常生长发育的关键,受到严密调控,寻找并克隆出不同发育调控过程中差异表达的基因,对预防发育畸形及疾病的发生具有重要意义。Mcpr1是我实验室通过改良消减杂交技术克隆获得的新基因,直接提取正常组和实验组(维甲酸诱导的小鼠腭裂模型)胚胎小鼠腭突组织中的mRNA,获得小鼠腭裂形成中差异基因表达的第一手资料。提交GenBank并获得登录号为AYO74887,命名为Mcpr1 (mouse cleft palate related gene-1)。Mcpr1全长711bp,其基因序列包括了国际哺乳动物基因采集计划小组克隆的GenBank中登录号为BC120606的基因的全长序列。前期工作中利用RT-PCR及原位杂交分析表明在维甲酸诱导的小鼠腭突中的表达明显高于正常对照组;RT-PCR和Western Blotting分析表明在成年小鼠的肝、心、脑、脾、肾、肺、肌肉组织中均存在转录水平及蛋白水平的表达,其表达蛋白可以抑制小鼠腭突间充质细胞(mepmCs)的生长,促进其凋亡;通过反义核酸技术下调Mcpr1的表达可以促进mepmCs的增殖,阻滞维甲酸对细胞的凋亡作用。目前的研究提示Mcpr1可能作为维甲酸信号转导途径的下游分子参与细胞的增殖和凋亡,很可能通过参与细胞凋亡在维甲酸导致腭裂中发挥重要作用。因此,我们构建Mcpr1的shRNA真核表达载体,利用RNAi技术高效特异地沉默Mcpr1的表达,以期分析其对mepmCs的生物学影响及在维甲酸诱导的腭裂发生中的具体作用。研究目的: 1.构建Mcpr1的shRNA真核表达载体,为进一步研究Mcpr1对mepmCs的生物学影响提供基础;2.观察RNAi沉默mepmCs表达Mcpr1后细胞的生物学效应;研究方法: 1.用DNA重组技术将针对Mcpr1基因的不同部位所设计的4对dsDNA序列(其中包括2对Mcpr1的特异性干扰序列、1对Mcpr1的阴性对照干扰序列和1对GAPDH的阳性对照干扰序列)克隆到真核表达质粒pGenesil-1中,构建Mcpr1的shRNA真核表达载体;2.瞬时转染mepmCs, RT-PCR检测Mcpr1和GAPDH的表达;3. MTT法绘制细胞生长曲线,观察Mcpr1基因沉默后细胞的生长;4. FCM检测细胞周期的改变;5. Western Blot法检测Mcpr1基因沉默后CDK2、Cyclin E和p21的表达。研究结果: 1.所构建的4个干扰载体pGenesil1-Mcpr1shRNA1、pGenesil1- Mcpr1shRNA2、pGenesil1-Mcpr1 negtive-shRNA和pGenesil1- GAPDHshRNA经限制性酶切鉴定和基因测序,均证实成功干扰载体构建成功;2.所构建载体经阳离子脂质体介导瞬时转染mepmCs,24h后RT-PCR检测Mcpr1和GAPDH的表达,结果显示pGenesil1-Mcpr1shRNA1、pGenesil1-Mcpr1shRNA2都能够沉默Mcpr1的mRNA表达,但二者抑制效率无差异,pGenesil1-Mcpr1 negtive-shRNA不能够沉默Mcpr1的mRNA表达,pGenesil1-GAPDHshRNA能够沉默GAPDH的mRNA表达;3. MTT结果显示转染Mcpr1 shRNA真核表达载体的pGenesil1- Mcpr1shRNA1、pGenesil1-Mcpr1shRNA2细胞增殖并无差异,但都比转染阴性对照组pGenesil1-Mcpr1 negtive-shRNA快;4. FCM结果显示转染pGenesil1-Mcpr1shRNA1较转染阴性对照组pGenesil1-Mcpr1 negtive-shRNA细胞增殖活性明显上调,促进了细胞S期向G1期的转变;5. Mcpr1基因沉默后Western Blotting结果显示CDK2和Cyclin E表达上调,p21表达下调。研究结论: 1.阳性干扰载体pGenesil1-GAPDHshRNA能够明显抑制GAPDH的表达,可以排除载体构建过程中的系统误差;阴性干扰载体pGenesil1-Mcpr1 negtive-shRNA不能够抑

关键词： Mcpr1 mepm 真核表达载体 RNAi 细胞周期

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