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不同感染剂量mdrv对番鸭免疫反应和细胞毒性作用的影响

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中国兽医学报 2010年第12期30卷 1586-1589页

作者：林锋强陈仕龙陈少莺朱小丽王劭程晓霞高春亮蔡羲李兆龙福建省农业科学院畜牧兽医研究所福建福州350013 福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心福建福州350013

用不同剂量番鸭呼肠孤病毒(mdrv MW9710株)感染8日龄番鸭后,通过检测血液中淋巴细胞对ConA、LPS的反应和NK细胞、细胞毒T细胞(CTL)的细胞毒性作用,探讨mdrv感染对番鸭免疫细胞功能和细胞毒性作用的影响。结果显示,不同感染剂量mdrv均会... 详细信息

用不同剂量番鸭呼肠孤病毒(mdrv MW9710株)感染8日龄番鸭后,通过检测血液中淋巴细胞对ConA、LPS的反应和NK细胞、细胞毒T细胞(CTL)的细胞毒性作用,探讨mdrv感染对番鸭免疫细胞功能和细胞毒性作用的影响。结果显示,不同感染剂量mdrv均会抑制番鸭血液淋巴细胞对ConA、LPS的增殖反应,降低NK细胞和CTL细胞的杀伤活性,且影响程度与剂量相关;同时感染番鸭生长缓慢,脾脏肿大,胸腺和法氏囊缩小。上述结果表明,mdrv感染能导致番鸭免疫抑制,且细胞免疫抑制程度与感染病毒量有关。

关键词： mdrv 细胞免疫细胞毒性作用免疫抑制

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不同致病力mdrv双重RT-PCR检测方法建立及诱导细胞凋亡研究

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不同致病力MDRV双重RT-PCR检测方法建立及诱导细胞凋亡研究

作者：周五朵福建农林大学

学位级别：硕士

番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus,mdrv)是以感染番鸭出现“肝白点”为主要病变特征,并可引起软脚,喜卧,趾、跗关节肿胀等症状的一种传染性很强的病毒。2001年以来,本实验室分离出多株番鸭呼肠孤病毒,其中包括不同致病力的YB株和YJ... 详细信息

番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus,mdrv)是以感染番鸭出现“肝白点”为主要病变特征,并可引起软脚,喜卧,趾、跗关节肿胀等症状的一种传染性很强的病毒。2001年以来,本实验室分离出多株番鸭呼肠孤病毒,其中包括不同致病力的YB株和YJL株。经测序分析,YB株与mdrv法国89026株的S4基因同源性达94%以上,而YJL株与禽呼肠孤病毒(Avian reovirus,ARV)S1133株、176株的S1基因之间同源率高达96%以上,YB株与YJL株之间S组基因同源性低于30%。YB毒株在临床上表现为高致病力的特点,能够引起高的致死率,YJL毒株,在临床上对番鸭表现为低致病力的特点。由于两毒株在临床症状上有着类似发病症状和致病机理,通过临床诊断鉴别比较困难,所以建立一种快速、高效、特异的检测方法对于临床上区分不同致病力毒株具有重要意义。YJL株的S1基因编码P10、P17和σ C三个蛋白,而YB株的S4基因编码P10和σC两个蛋白,不含有P17蛋白,且两个毒株的P10蛋白基因的同源性极低。根据这2株病毒基因特点,分别针对YB株P10蛋白基因和YJL株P17蛋白基因设计2对特异性引物,通过条件优化成功建立了可鉴别这2个毒株的双重RT-PCR。结果显示:该方法可同时扩增出YB288 bp、YJL441 bp长度的特异性片段,而对其他番鸭病病原无扩增结果;该方法最佳反应条件为95℃预变性5 min,94 ℃1 min,55℃ 45 s,72℃ 1 min,30 个循环,72℃延伸 10 min;该方法最低能检出10 pg YB和YJL株RNA模板;使用单重PCR和多重PCR方法对60份临床疑似病料检测验证,两者符合率为100%。结果表明该方法特异性、敏感性和重复性良好,具有快速、准确的特点,可用于这2种不同致病力毒株的鉴别。针对临床上番鸭群存在不同致病力毒株感染情况,为该病的防治增加了难度,因此对其致病机理的阐明显得尤其重要。在病毒感染的过程中,对宿主免疫器官和嗜性器官有致凋亡的作用,本研究用2株病毒(YB株与YJL株)对宿主、原代鸭胚成纤维细胞(Muscovy duck embryo fibroblasts,MDEF)感染,探讨2株病毒诱导细胞凋亡的情况。实验首先测定两毒株的TCID,用MTS法测定病毒感染后12h、24h、36h、48h、72h、96h共6个时间段的MDEF细胞活力,根据细胞活力出现的拐点时间用荧光显微镜、DNA Ladder提取、流式细胞仪检测三种方法,对病毒诱导的细胞凋亡情况进行了定性和定量检测;最后用Western Bloting检测宿主肝脏细胞、脾脏细胞以及MDEF细胞的(48h、72h)空白组、YB、YJL接毒组共12份细胞样品中的凋亡执行蛋白Caspase-3的活化水平。结果表明:YB毒株在MDEF细胞上的TCID远高于YJL毒株,为其3倍。MTS活力检测出细胞接毒组活力拐点在48h,有大幅活力降低现象,YB组活力低于YJL组。荧光显微镜在48h可观察到YB和YJL组均能诱导细胞早期凋亡,YB比YJL株表现出更多的晚期凋亡。DNA ladder检测表明,两个毒株均表现出经典的Ladder特征,YB组比YJL组时间更早,Ladder更明显,空白组未出现。流式细胞仪检测结果表明,YB组诱导组织细胞凋亡的能力高于YJL组,YB组肝脏细胞凋亡水平远高达75%,脾脏为23%,症状明显期肝脏细胞凋亡集中于中晚期,脾脏细胞凋亡分布于各个时期;YJL组肝脏、脾脏水平相差不大,均在10%左右;检测MDEF细胞凋亡发现,48h的接毒组较空白组细胞凋亡水平明显增加,72h的YB组凋亡细胞主要处于中晚期,YJL组则在早、中晚期均有分布。Western Bloting检测凋亡执行蛋白Caspase-3的活化水平发现,空白组肝脏和脾脏未见活化的Caspase-3(17KD)蛋白表达;YB组肝脏、脾脏细胞活化的Caspase-3(17KD)有明显增量表达;YJL组肝脏和脾脏则有少量活化的Caspase-3(17KD)表达。MDEF空白细胞48h和72h Caspase-3蛋白没有明显活化,MDEF细胞72h的YB组Caspase-3蛋白活化水平较空白组明显增加;YJL组Caspase-3蛋白活化水平表达量较YB组明显低了很多,72h较48h活化水平增加。本研究对2株不同致病力毒株建立了一种快速高效的双重RT-PCR诊断方法,对实际生产、实验室诊断提供借鉴;并从细胞凋亡角度对两毒株的致病机理进行了研究,确定了两毒株的感染能力,以及两毒株致细胞发生病变的时间拐点和具体的凋亡水平和时间,为后续病毒蛋白功能和相关信号通路研究提供了基础数据;从对宿主肝、脾组织进行凋亡检测结果来看,病毒致细胞凋亡在病毒感染机体机制中扮演

关键词： mdrv 双重RT-PCR 检测细胞凋亡

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中国家禽 2011年第20期33卷 69-71页

mdrv与H9AIV共感染可协同抑制番鸭免疫反应福建省农业科学院畜牧兽医研究所林峰强等将8日龄番鸭人工感染番鸭呼肠孤病毒(mdrv)或/和H9亚型禽流感病毒(AIV),探讨二者对番鸭胸腺免疫功能的影响。结果显示,H9AIV感染后番鸭发病率低,无

关键词：番鸭呼肠孤病毒腺苷 mdrv AIV mRNA IMO 共感染翻译抑制产蛋鸡胸腺萎缩

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中国家禽 2011年第11期33卷 70-71页

作者：俞燕

以禽源U6启动子介导筛选马立克氏病病毒gI、gE基因特异siRNA中国农业科学院哈尔滨兽医研究所全炎铭等以鸡胚成纤维细胞(CEF)的DNA为模板,扩增禽源cU6-3启动子序列,并合成针对gI和gE基因的10条shRNA序列。通过重叠PCR将cU6-3启动子与shRN... 详细信息

以禽源U6启动子介导筛选马立克氏病病毒gI、gE基因特异siRNA中国农业科学院哈尔滨兽医研究所全炎铭等以鸡胚成纤维细胞(CEF)的DNA为模板,扩增禽源cU6-3启动子序列,并合成针对gI和gE基因的10条shRNA序列。通过重叠PCR将cU6-3启动子与shRNA融合扩增制备shRNA表达盒,将制备的shRNA表达盒分别与重组质粒pEGFP-gI或pEGFP-gE共转染CEF细

关键词：空肠弯曲杆菌感染胴体喷雾处理沙门菌屠体阳性菌株禽呼肠孤病毒禽源黄羽肉鸡鸡舍环境肉鸡加工弯曲杆菌鸡盲肠 mdrv 产毒

水禽呼肠孤病毒感染番鸭肝脏的差异蛋白质组学研究

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水禽呼肠孤病毒感染番鸭肝脏的差异蛋白质组学研究

作者：朱果真福建农林大学

学位级别：硕士

水禽呼肠孤病毒病包括番鸭呼肠孤病毒病（俗称“番鸭肝白点病”，Muscovy duckreovirusis，MDR）和新型鸭呼肠孤病毒病（俗称”鸭出血坏死性肝炎”，Novel duck reovirusis，NDR）均是近年我国新出现的危害养鸭业的重要疫病，但这两者... 详细信息

水禽呼肠孤病毒病包括番鸭呼肠孤病毒病（俗称“番鸭肝白点病”，Muscovy duckreovirusis，MDR）和新型鸭呼肠孤病毒病（俗称”鸭出血坏死性肝炎”，Novel duck reovirusis，NDR）均是近年我国新出现的危害养鸭业的重要疫病，但这两者的致病性差异较大，致病差异机理不明。本研究首次应用差异蛋白质组学分别研究mdrv和NDRV感染雏番鸭的肝脏蛋白质组差异，为深入研究两种病毒之间的致病机理奠定良好理论基础。1番鸭人工感染实验4日龄健康番鸭随机分成mdrv感染组、NDRV感染组和正常对照组，同等条件下隔离饲养。其中mdrv感染组腿肌接种0.2mL mdrv细胞毒;NDRV感染组腿肌接种0.2mL NDRV细胞毒;正常对照组腿肌接种0.2mL Hank’s液。分别采集接种病毒/Hank’s液1、3、4、5、6d后的肝脏并冻存于-70℃，同时观察记录肝脏的病理变化。结果发现在攻毒后第3d两组番鸭肝脏都出现轻微病变和症状，第5d mdrv组番鸭肝脏见大量白色坏死点，NDRV组番鸭肝脏见大量出血点/斑或出血灶，本研究选用攻毒后病变最典型的第5d番鸭的肝脏为样品。2番鸭肝脏二维双向凝胶电泳条件的建立和优化本研究对不同裂解液、不同上样量和相应的聚焦程序进行优化，确立了番鸭肝脏二维双向电泳凝胶技术：研磨-超声-裂解液(7M尿素，2M硫脲，4%CHAPS，65mM DTT，40mMTris-base，0.5%IPG buffer)法提取肝脏蛋白质;上样时使用2D clean-up kit以及去拖尾DeStreak试剂;上样量为1100μg;一向等电聚焦程序为：50V12h、200V1.5h、500V1h、1000V1h、8000V3h、8000V60000Vh、500V10h;采用胶体考马斯亮蓝染色方法染色。3mdrv和对照组之间的番鸭肝脏差异蛋白质通过二维双向凝胶电泳技术和PDQest8.0软件分析获取49个mdrv试验组与对照组之间的差异表达蛋白，之后运用MALDI-TOF-TOF质谱仪得到这些胶点蛋白的质量谱图，最后运用蛋白质搜索鉴定软件Mascot2.3.02鉴定蛋白，结果共鉴定出38个差异表达蛋白，包括10个表达下调的蛋白、17个表达上调的蛋白、7个仅在正常番鸭肝脏里表达的蛋白和4个仅在感染mdrv的番鸭肝脏里表达的蛋白。4NDRV和对照组之间的番鸭肝脏差异蛋白质步骤同3，获取32个NDRV试验组与对照组之间的差异表达蛋白，进一步鉴定后共有26个，包括9个表达下调的蛋白、12个表达上调的蛋白、3个仅在正常番鸭肝脏里表达的蛋白和2个仅在感染NDRV的番鸭肝脏里表达的蛋白。5mdrv和NDRV的番鸭肝脏差异蛋白点分析由于鸭的蛋白质组数据库信息不全，因此本研究运用NCBI下载的鸟纲蛋白库构建的数据库、GO数据库和Panther Classification System数据库对上面两组共64个蛋白展开进一步分析，结果发现大多数蛋白都是预测蛋白，其中有4个未知蛋白。两组可以进行亚细胞定位的蛋白分别占16.22%、3.70%。对差异表达蛋白的分子功能分析发现，mdrv组和NDRV组中具有结合功能和具有催化活性的蛋白最可能受到番鸭呼肠孤病毒感染的影响，肝脏中的代谢和抗氧化活性的变化可能是发病番鸭肝脏特点之一。分析mdrv组和NDRV组中的差异表达蛋白，发现mdrv组中的蛋白主要反映神经系统和肌肉细胞受到损伤，而NDRV组中的蛋白主要反映肝细胞受损。两组都有细胞凋亡现象，影响机体生长发育，并且诱导免疫抑制。两组发病番鸭体内同时也在进行修复机制。mdrv组中Utrophin蛋白有抗肌萎缩功能，而两组中过氧化物酶的升高也说明机体抗氧化能力增强。

关键词： mdrv NDRV 番鸭肝脏蛋白质组学

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番鸭呼肠孤病毒病(肝白点病)研究进展

福建畜牧兽医 2004年第Z1期26卷 7-9页

作者：胡奇林陈少莺福建省农业科学院畜牧兽医研究所 350003

　　番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus,mdrv)病(番鸭肝白点病、白点病、花肝病)是由番鸭呼肠孤病毒引起的番鸭一种高发病率、高致死率的传染病,该病主要发生于40 d内番鸭,临床上以软脚、腹泻、生长障碍为主要症状,以肝、脾表面坏... 详细信息

　　番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus,mdrv)病(番鸭肝白点病、白点病、花肝病)是由番鸭呼肠孤病毒引起的番鸭一种高发病率、高致死率的传染病,该病主要发生于40 d内番鸭,临床上以软脚、腹泻、生长障碍为主要症状,以肝、脾表面坏死、纤维素性心包炎为主要病变.Kaschula等(1950年)在南非首次报道了该病的发生,法国学者Gaudry等(1972年)在国际上首次从患上述症状和病变的番鸭中分离到番鸭呼肠孤病毒,目前该病已广泛流行于法国、以色列、德国、意大利等国.在我国,番鸭呼肠孤病毒病是1997年新发现的番鸭传染病,最早在福建莆田、福清等地发生,以后相继在广东佛山、浙江金华和我国各番鸭饲养区发生,以肝、脾出现灰白色小点为主要病变,俗称番鸭"肝白点病"、"白点病"、"花肝病",发病日龄以10～30 d居多,发病率为30%～90%,病死率为60%～80%,病鸭耐过后成为僵鸭,当时临床上无法防治,引起国内学者的广泛关注.本文就该病的病原学、诊断、防制技术做一综述.　　……

关键词：番鸭呼肠孤病毒白点病 ARV 病变发病率小瓜虫病纤毛虫病 mdrv 基因编码

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