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gga-miR-155对mdcc-msb1细胞生物学行为的影响

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畜牧兽医学报 2018年第11期49卷 2496-2504页

作者：余祖华丁轲郁川贾艳艳何雷廖成水李静张春杰李银聚吴庭才程相朝张梦珂邱静静罗俊河南科技大学动物疫病与公共卫生重点实验室洛阳市活载体生物材料与动物疫病防控重点实验室洛阳471023 洛阳职业技术学院洛阳471003 河南省农业科学院动物免疫学重点实验室农业部动物免疫学重点实验室河南省动物免疫学重点实验室郑州450002

为了解gga-miR-155对mdcc-msb1细胞生物学行为的影响,将人工合成的gga-miR-155模拟物、gga-miR-155抑制物以及阴性对照瞬时转染mdcc-msb1细胞。然后采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测mdcc-msb1细胞中gga-miR-155的表达水平,CCK-8法检测转染后细胞增殖能力的变化,流式细胞术检测mdcc-msb1细胞的细胞周期与凋亡的变化,Transwell检测mdcc-msb1细胞的迁移、侵袭能力的变化。结果显示,gga-miR-155模拟物可显著上调mdcc-msb1细胞gga-miR-155表达水平,促进mdcc-msb1细胞增殖,细胞G1期细胞减少,S和G2期细胞增加,同时凋亡减少,迁移、侵袭能力增加;gga-miR-155抑制物可显著下调mdccmsb1细胞gga-miR-155表达水平,抑制mdcc-msb1细胞增殖,细胞G1期细胞增加、S和G2期细胞减少,同时凋亡增加,迁移、侵袭能力下降。结果表明,gga-miR-155可促进mdcc-msb1细胞增殖、迁移和侵袭,抑制其凋亡。

关键词： gga-miR-155 mdcc-msb1细胞细胞增殖细胞凋亡迁移侵袭

鸡TGFβ1对mdcc-msb1细胞增殖、凋亡、迁移与侵袭的影响

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畜牧兽医学报 2020年第10期51卷 2567-2575页

作者：余祖华丁轲贾艳艳郁川何雷廖成水李静张春杰李银聚吴庭才程相朝门凯凯张瑾余祖玲周子誉罗俊河南科技大学动物疫病与公共卫生重点实验室洛阳市活载体生物材料与动物疫病防控重点实验室洛阳471023 洛阳职业技术学院洛阳471003 河南省农业科学院动物免疫学重点实验室农业部动物免疫学重点实验室河南省动物免疫学重点实验室郑州450002

旨在探讨鸡TGFβ1对mdcc-msb1细胞增殖、凋亡、迁移与侵袭的影响。作者将构建的鸡TGFβ1过表达载体、干扰表达载体以及相应阴性对照转染mdcc-msb1细胞,然后检测转染后各组细胞鸡TGFβ1的表达水平、细胞增殖能力、细胞周期与凋亡,细胞的... 详细信息

旨在探讨鸡TGFβ1对mdcc-msb1细胞增殖、凋亡、迁移与侵袭的影响。作者将构建的鸡TGFβ1过表达载体、干扰表达载体以及相应阴性对照转染mdcc-msb1细胞,然后检测转染后各组细胞鸡TGFβ1的表达水平、细胞增殖能力、细胞周期与凋亡,细胞的迁移与侵袭能力。结果显示,与相应阴性对照相比,转染TGFβ1过表达质粒可显著上调mdcc-msb1细胞的TGFβ1表达水平,显著抑制mdcc-msb1细胞的增殖,且使G1期细胞增加、S和G2期细胞减少,同时增加细胞凋亡率,降低细胞的迁移与侵袭能力;转染TGFβ1干扰表达质粒可显著下调mdcc-msb1细胞的TGFβ1表达水平,显著促进mdcc-msb1细胞的增殖,G1期细胞减少、S和G2期细胞增加,同时降低细胞凋亡率,增加细胞的迁移与侵袭能力。结果表明,鸡TGFβ1可抑制mdcc-msb1细胞增殖、迁移与侵袭,促进其凋亡。

关键词： TGFβ1 mdcc-msb1细胞细胞增殖细胞凋亡迁移侵袭

gga-miR-155对mdcc-msb1细胞转录组的影响

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畜牧兽医学报 2023年第2期54卷 663-672页

作者：余祖华贾艳艳何雷廖成水李静魏颖陈建陈松彪尚珂丁轲洛阳活载体生物材料与动物疫病重点实验室洛阳471003 河南科技大学功能微生物与畜禽健康实验室洛阳471003 河南科技大学动物科技学院洛阳471003

旨在探讨gga-miR-155对马立克病病毒转化的肿瘤细胞系mdcc-msb1细胞转录组水平变化的影响。本研究以mdcc-msb1细胞为研究对象,首先将gga-miR-155模拟物及其阴性对照转染mdcc-msb1细胞,在转染后48 h提取总RNA,用安捷伦2100核酸检测仪分... 详细信息

旨在探讨gga-miR-155对马立克病病毒转化的肿瘤细胞系mdcc-msb1细胞转录组水平变化的影响。本研究以mdcc-msb1细胞为研究对象,首先将gga-miR-155模拟物及其阴性对照转染mdcc-msb1细胞,在转染后48 h提取总RNA,用安捷伦2100核酸检测仪分析各组细胞总RNA的完整性,采用RT-qPCR分析gga-miR-155在mdcc-msb1细胞中的过表达情况;然后利用高通量测序技术,分析gga-miR-155过表达后mdcc-msb1细胞转录水平的变化,筛选差异表达基因,结合生物信息学分析预测差异表达基因中gga-miR-155靶mRNA。结果显示:制备了gga-miR-155在mdcc-msb1细胞过表达样本并构建了高通量测序文库;与对照组相比,gga-miR-155过表达组的差异表达基因有87个,其中,上调表达的基因有47个,下调表达的基因有40个;GO与KEGG分析显示,这些差异表达基因显著富集于代谢和蛋白结合过程/信号通路;通过Targetscan和miRada软件预测下调表达基因中鸡BACH1为gga-miR-155的靶mRNA(Pmdcc-msb1细胞的转录组水平,差异表达基因中BACH1基因可能在gga-miR-155的作用下参与了mdcc-msb1细胞的代谢过程。

关键词： gga-miR-155 马立克病 mdcc-msb1细胞转录组

gga-miRNA-155对mdcc-msb1细胞增殖的影响

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西北农林科技大学学报（自然科学版） 2019年第2期47卷 1-6页

作者：余祖华丁轲郁川贾艳艳何雷廖成水李静张梦珂邱静静张春杰程相朝河南科技大学动物疫病与公共卫生重点实验室河南洛阳471023 洛阳市活载体生物材料与动物疫病防控重点实验室河南洛阳471023 河南科技大学宏翔生物饲料实验室河南洛阳471023

【目的】构建gga-miRNA-155前体基因(pre-gga-miRNA-155)真核表达载体,验证gga-miRNA-155在mdcc-msb1细胞中的表达效果,探究其对mdcc-msb1细胞增殖的影响。【方法】采用PCR方法从鸡肝脏基因组DNA中扩增gga-miRNA-155前体基因片段pre-gga-miRNA-155,并将其克隆入pMD-18T载体,构建克隆载体pMD-18T-pre-gga-miRNA-155。用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA真核表达载体和pMD-18T-pre-gga-miRNA-155,将pre-gga-miRNA-155酶切回收片段与pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA的酶切回收片段进行连接,构建重组真核表达载体pcDNA6.2-pre-gga-miRNA-155,对其进行PCR、EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切及DNA测序鉴定。将重组载体转染到mdcc-msb1细胞中,应用实时荧光定量PCR (Real-time PCR)检测gga-mi-RNA-155的表达水平,利用MTT法检测细胞增殖能力的变化。【结果】PCR扩增获得了长度约154bp的鸡pre-gga-mi-RNA-155基因。成功构建了pre-gga-miRNA-155的真核表达载体pcDNA6.2-pre-gga-miRNA-155,瞬时转染MD-CC-msb1细胞后gga-miRNA-155表达水平显著增加,且mdcc-msb1细胞的体外增殖能力增强。【结论】成功构建了pre-gga-miRNA-155的真核表达载体,其可在mdcc-msb1细胞中过表达gga-miRNA-155,且可促进mdcc-msb1细胞的体外增殖。

关键词： gga-miRNA-155 表达载体 mdcc-msb1细胞细胞增殖

鸡传染性贫血病病毒在mdcc-msb1细胞的传代致弱研究

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中国家禽 2017年第15期39卷 26-29页

作者：李鸿鑫吴波良张新珩杨瑞杰蔺文成陈伟国谢青梅华南农业大学动物科学学院广东广州510642 广东省畜禽健康养殖与安全生产重点实验室广东广州510642

为研究鸡传染性贫血病(Chicken infectious anemia,CIA)减毒活疫苗,试验将鸡传染性贫血病病毒(CIAV)在鸡淋巴细胞mdcc-msb1上进行37℃和40℃传代致弱。结果显示:40℃条件下传至60代和37℃下传至90代,病毒的VP1氨基酸分别有2个和3个突变... 详细信息

为研究鸡传染性贫血病(Chicken infectious anemia,CIA)减毒活疫苗,试验将鸡传染性贫血病病毒(CIAV)在鸡淋巴细胞mdcc-msb1上进行37℃和40℃传代致弱。结果显示:40℃条件下传至60代和37℃下传至90代,病毒的VP1氨基酸分别有2个和3个突变,两种条件下有2个突变是在同一位置;VP2和VP3很稳定,在试验中未发生氨基酸突变;致病性试验发现,突变毒株仍具有致病性,但有降低的趋势。试验表明,鸡淋巴细胞传代CIAV可以引发包含中和抗原表位的VP1突变,且提高温度能促进变异速度,为进一步研究CIAV的变异特征、弱毒疫苗研发提供了参考依据。

关键词：鸡传染性贫血病病毒 mdcc-msb1细胞传代致弱疫苗

下调热休克蛋白60对mdcc-msb1细胞凋亡调节作用

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下调热休克蛋白60对MDCC-MSB1细胞凋亡调节作用

作者：段世豪聊城大学

学位级别：硕士

热休克蛋白(Heat shock protein,HSPs),又称应激蛋白,在各种生物中普遍存在,高度保守。按分子量不同,HSPs可以分为HSP110、HSP90、HSP70、HSP60及小分子家族。在正常生理条件下,HSPs正常表达,在新生蛋白折叠、转运等过程中发挥重要生理... 详细信息

热休克蛋白(Heat shock protein,HSPs),又称应激蛋白,在各种生物中普遍存在,高度保守。按分子量不同,HSPs可以分为HSP110、HSP90、HSP70、HSP60及小分子家族。在正常生理条件下,HSPs正常表达,在新生蛋白折叠、转运等过程中发挥重要生理作用;当机体细胞受到各种应激时,HSPs表达含量会显著变化。近来研究表明,HSPs与肿瘤的发生与发展有着密切的相关性。在MDV引起鸡肿瘤的发生、发展过程中,HSP60表达量显著升高,且主要定位于肿瘤细胞的胞浆中,暗示着HSP60对肿瘤细胞的增殖发挥着重要生物学作用。而HSP60表达量高低对于肿瘤细胞凋亡的生物学作用未见报道。mdcc-msb1细胞是MD成淋巴细胞样细胞系。本课题将mdcc-msb1细胞作为研究对象,通过设计合成HSP60的siRNA干扰序列,构建siRNA慢病毒,抑制mdcc-msb1内HSP60的转录和表达,利用荧光定量RT-PCR、Western Blot、流式细胞术等方法检测HSP60的转录、表达水平及mdcc-msb1细胞凋亡情况,研究HSP60表达量与mdcc-msb1细胞凋亡之间的相关性,阐述HSP60在肿瘤细胞增殖过程中的生物学作用。根据NCBI公布的鸡HSP60和GAPDH基因mRNA序列,利用Primer premier 5.0生物软件及参考文献,设计并合成6对引物,通过梯度普通PCR及梯度荧光定量PCR,对各引物扩增条件进行了优化。回收PCR扩增的基因片段,连接pUCm-T载体,转化DH5α感受态细胞,筛选、鉴定重组质粒,系列稀释作为阳性标准品,制作标准曲线。优化了鸡HSP60荧光定量RT-PCR方法,并对其扩增效率、敏感性、特异性进行了检测。结果证明,建立的荧光定量RT-PCR方法可以真实地反映反应管中模板初始数量,HSP60、GAPDH标准曲线斜率接近,扩增效率良好,可用于mdcc-msb1细胞中HSP60和GAPDH基因mRNA水平的检测。根据NCBI公布的HSP60序列,设计3条RNA干扰序列,构建慢病毒,优化慢病毒转染mdcc-msb1细胞的条件,利用荧光定量PCR、WesternBlot等技术,检测RNA干扰效果。结果表明,慢病毒浓度为1×10～8TU/mL,不添加助转染试剂,转染效率最佳,细胞状态良好;成功构建了mdcc-msb1细胞HSP60 RNA干扰慢病毒。其中5147序列慢病毒干扰效果最佳,转染36 h时,转录水平、蛋白表达水平分别比对照序列慢病毒组下降88.6%和70.6%;转染48 h时,与空白对照组相比转录水平、蛋白表达水平分别比对照序列慢病毒组下降87.7%和75.9%。利用5147序列慢病毒转染mdcc-msb1细胞,转染后48 h时,收集细胞,利用荧光定量PCR、Western Blot以及流式细胞技术,检测HSP60转录表达水平以及细胞凋亡水平。结果显示,5147序列慢病毒干扰48 h时,mdcc-msb1细胞HSP60转录、表达水平分别降低81.1%和85.2%,细胞凋亡率提高46.9%。证明通过降低HSP60的表达水平,能够导致mdcc-msb1细胞凋亡升高。

关键词：热休克蛋白60 mdcc-msb1细胞细胞凋亡流式细胞荧光定量PCR

鸡TGF-β1对MDV转化的肿瘤细胞系生物学特性的影响及机制研究

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鸡TGF-β1对MDV转化的肿瘤细胞系生物学特性的影响及机制研究

作者：门凯凯河南科技大学

学位级别：硕士

马立克病(Marek’s Disease,MD)是由α疱疹病毒引起的以淋巴细胞增生为主要特征的疾病,因其高致死率对全球家禽业的经济影响巨大。因此,探寻与马立克病发生、发展过程中相关的分子及其作用和机制,将为进一步探明MD的发生机制提供理论基... 详细信息

马立克病(Marek’s Disease,MD)是由α疱疹病毒引起的以淋巴细胞增生为主要特征的疾病,因其高致死率对全球家禽业的经济影响巨大。因此,探寻与马立克病发生、发展过程中相关的分子及其作用和机制,将为进一步探明MD的发生机制提供理论基础,并为临床有效防控提供实验依据。转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)通过影响细胞凋亡、细胞增殖等过程从而在肿瘤的发生发展中发挥重要的作用,其在肿瘤发生发展中的调控作用受到了越来越多的关注,但是鸡TGF-β1在MD肿瘤发生发展过程中的调控作用及其机制尚不完全明确。mdcc-msb1是鸡马立克病毒(Marek’s Disease Virus,MDV)诱导产生的T淋巴细胞增生性肿瘤细胞系之一,含有MDV基因组,是研究疱疹病毒相关肿瘤的理想模型。因此,本研究以mdcc-msb1为模型,在过表达和抑制表达鸡TGF-β1的基础上,研究鸡TGF-β1对mdcc-msb1细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭等生物学特性的影响。从胞内和胞外两条途径探究通过检测鸡TGF-β1过表达和抑制表达对mdcc-msb1细胞中TGF-β1/Smad2信号通路关键信号分子与增殖、凋亡相关分子表达相关性的影响,以探究鸡TGF-β1可通过TGF-β1/Smad2信号通路调控mdcc-msb1细胞增殖、凋亡的机制,为进一步探究鸡TGF-β1在MDV感染鸡肿瘤发生中的作用和机制奠定基础,主要内容如下:1.鸡TGF-β1原核表达及抗体制备根据Gen Bank中鸡TGF-β1序列和pET-32a(+)载体序列,构建pET-32a-TGF-β1原核表达载体,然后将其转化大肠杆菌BL21后进行诱导条件的优化与诱导表达,通过SDS-PAGE电泳检和Western blot检测鸡TGF-β1表达情况。然后将表达的鸡TGF-β1纯化后免疫Balb/c小鼠以制备鸡TGF-β1多克隆抗体。结果显示,成功构建了pET-32a-TGF-β1原核表达载体,与pET-32a质粒转化菌相比,在1 mmol/L IPTG、温度37℃、诱导6 h的最佳诱导表达条件下,pET-32a-TGF-β1重组质粒阳性菌可表达1条大小约65 KD以包涵体形式表达的蛋白。采用ELISA及间接免疫荧光法检测纯化蛋白免疫小鼠产生的多克隆抗体具有高度的特异性。2.鸡TGF-β1抑制表达载体和过表达载体的构建及表达检测通过Gen Bank中鸡TGF-β1(NM-001318456.1)序列与载体pDC316-mCMV-Zs Green和pG1.2载体多克隆位点,构建pDC316-mCMV-Gallus-TGF-β1过表达载体和pG1.2-Gallus-TGF-β1干扰表达载体。然后将过表达质粒pDC316-mCMV-Gallus-TGF-β1、干扰表达质粒pG1.2-Gallus-TGF-β1及其相应空载体对照(NC)转染mdcc-msb1细胞,于转染后48 h,采用倒置荧光显微镜观察、荧光定量PCR和Western blot检测细胞内鸡TGF-β1的表达情况。结果显示,转染后48 h,在倒置荧光显微镜下可以观察到黄绿色荧光信号,与TGF-β1过表达NC组相比,过表达质粒pDC316-mCMV-Gallus-TGF-β1组mdcc-msb1细胞中鸡TGF-β1的mRNA表达和蛋白表达均显著升高(P1干扰表达NC组相比,干扰表达质粒pG1.2-Gallus-TGF-β1组mdcc-msb1细胞中鸡TGF-β1的mRNA表达和蛋白表达均显著降低(P1对mdcc-msb1细胞生物学特性影响采用CCK-8、流式细胞术、Transwell等实验方法检测各组细胞的生物学特性。CCK-8法检测结果显示,与其相应NC对照组相比,在转染后24 h、48 h、72 h,过表达质粒pDC316-mCMV-Gallus-TGF-β1组mdcc-msb1细胞的增殖水平均显著降低(P1.2-Gallus-TGF-β1组mdcc-msb1细胞的增殖水平均显著升高(P细胞周期检测结果显示,与其相应NC组相比,过表达质粒pDC316-mCMV-Gallus-TGF-β1组mdcc-msb1细胞的G1期细胞分布显著升高(P细胞分布显著降低(P细胞分布无差异,干扰表达质粒pG1.2-Gallus-TGF-β1组mdcc-msb1细胞的G1期细胞分布显著降低(P细胞分布无差异,G2期细胞分布显著增加(P1)。细胞凋亡检测结果显示,与其相应NC组相比,过表达质粒pDC316-mCMV-Gallus-TGF-β1组细胞

关键词：鸡 TGF-β1 mdcc-msb1细胞生物学特性细胞增殖细胞凋亡