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mcur1介导的Ca2+稳态对酮病奶牛乳腺组织线粒体损伤的调控机制

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MCUR1介导的Ca2+稳态对酮病奶牛乳腺组织线粒体损伤的调控机制

作者：罗胜缤黑龙江八一农垦大学

学位级别：硕士

奶牛酮病(Ketosis)作为是围产期最常见的一种营养代谢病,于1849年被Lander赋予了定义:奶牛酮病是一种代谢紊乱性疾病,其特点为低血糖、高游离脂肪酸、高血酮。奶牛患病后,代谢紊乱导致机体中产生产生过量的活性氧(reactive oxygen speci... 详细信息

奶牛酮病(Ketosis)作为是围产期最常见的一种营养代谢病,于1849年被Lander赋予了定义:奶牛酮病是一种代谢紊乱性疾病,其特点为低血糖、高游离脂肪酸、高血酮。奶牛患病后,代谢紊乱导致机体中产生产生过量的活性氧(reactive oxygen species,ROS)导致氧化应激,会损伤乳腺上皮细胞,致使奶牛的产奶量和乳品质降低。线粒体是细胞内的一个能量转换器,为细胞持续不断的提供能量。线粒体作为细胞生命活动的调控中心,是细胞内的ROS主要在线粒体产生和聚集,同时也是细胞内最大的Ca池之一。线粒体钙单向调节分子1(Mitochondrial Calcium Uniporter Regulator1,mcur1)是维持线粒体Ca稳态的关键分子,对维持细胞能量代谢起重要作用。代谢紊乱时线粒体Ca稳态失衡可诱导细胞氧化损伤,但在奶牛酮病导致的乳腺损伤中起作用目前尚不明确。因此,本研究旨在明确mcur1介导的线粒体Ca稳态对酮病奶牛乳腺组织损伤的调节机制。本研究通过检测围产期健康奶牛、亚临床/临床酮病奶牛(subclinical ketosis,SCK)(clinical ketosis,CK)乳腺组织生化指标,明确乳腺组织中氧化应激和mcur1蛋白的表达变化。结果表明,亚临床型酮病奶牛和临床型酮病奶牛乳腺组织中包含的过氧化氢(hydrogen peroxide,HO)还有丙二醛(malondialdehyde,MDA)明显提高,而乳腺组织中标志性的抗氧化酶:超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)与过氧化氢酶(catalase,CAT)的活性显著降低,以上结果表明,酮病奶牛的乳房组织中氧化应激水平很高。同时亚临床型酮病奶牛和临床型酮病奶牛乳腺组织中mcur1蛋白表达升高。基于上述研究,提出假设:mcur1的高表达是奶牛乳腺组织出氧化应激状态的原因之一。采用同浓度LPS不同时间处理体外培养的奶牛乳腺上皮细胞。结果发现,经LPS处理后mcur1蛋白高表达、Ca在线粒体内富集、线粒体损伤、Mito-ROS水平升高,进而诱导氧化应激。这些结果表明,mcur1可能参与调控LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞氧化应激。采用钙离子过载物(Ryanodine)处理奶牛乳腺上皮细胞后,添加LPS处理。结果发现,Ryanodine可以缓解LPS诱导的细胞中mcur1蛋白水平高表达、Ca在线粒体内富集以及Mito-ROS含量升高。另外,添加LPS处理后用Mito-ROS清除剂(Mito-TEMPO)处理的结果表明:Mito-TEMPO可以降低乳腺细胞由于LPS诱导所生成的过量Mito-ROS并缓解线粒体损伤。转染mcur1 si RNA后,添加LPS,结果发现,敲低mcur1可以缓解LPS导致的细胞中Ca在线粒体内富集以及Mito-ROS含量升高并缓解线粒体损伤。奶牛乳腺上皮细胞中转染mcur1过表达腺病毒,结果发现,mcur1过表达会导致Ca在线粒体内富集以及Mito-ROS含量升高并导致线粒体损伤。这些结果表明,mcur1可以通过介导线粒体Ca稳态对Mito-ROS和线粒体损伤进行调控。综上所述,酮病牛的代谢失调可引起乳腺组织氧化应激,且酮病奶牛乳腺组织氧化应激与mcur1的高表达有关。同时,抑制mcur1可以缓解LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞线粒体损伤。

关键词：酮病乳腺 mcur1 氧化应激线粒体损伤

mcur1介导线粒体钙稳态重塑调控ROS产生促进肝癌生长的作用机制研究

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MCUR1介导线粒体钙稳态重塑调控ROS产生促进肝癌生长的作用机制研...

作者：王姣姣第四军医大学

学位级别：硕士

线粒体钙稳态对线粒体功能及细胞的影响至关重要,线粒体钙维持胞浆钙离子浓度动态平衡,是线粒体呼吸功能的重要调节因素,钙离子失衡导致细胞凋亡。线粒体钙稳态重塑是多种疾病发生的主要原因,但这一改变是否在肿瘤恶性进展中发挥关键作... 详细信息

线粒体钙稳态对线粒体功能及细胞的影响至关重要,线粒体钙维持胞浆钙离子浓度动态平衡,是线粒体呼吸功能的重要调节因素,钙离子失衡导致细胞凋亡。线粒体钙稳态重塑是多种疾病发生的主要原因,但这一改变是否在肿瘤恶性进展中发挥关键作用尚无明确报道。我们的研究团队首次发现:新近报道的线粒体钙离子摄取关键调节分子mcur1,促进肝癌细胞粒体钙稳态摄取,其表达水平在肝癌组织细胞中异常升高,mcur1高表达能够通过加速细胞增殖抑制线粒体依赖的内源性细胞凋亡而促进了肝癌细胞的生长能力,并且与肝癌病人的不良预后相关。文献报道,线粒体的钙离子环境是调控细胞活性氧ROS生成的关键因素,而活性氧ROS作为胞内重要的第二信使,能够激活包括与肿瘤细胞增殖,凋亡,转移与肿瘤细胞的血管生成相关的多种关键信号通路,最终导致恶性肿瘤发生。我们进一步研究发现mcur1介导的线粒体钙稳态重塑导致肝癌细胞活性氧ROS水平上调,这一改变与其下游P53降解,AKT/MDM2信号通路活化密切相关。基于此,我们提出假说:mcur1上调引发线粒体钙稳态重塑,通过调控胞内第二信使ROS生成影响其下游akt/mdm2介导的p53降解信号通路,最终促进肝癌的恶性进展。【目的】本课题以肝癌为研究对象,选择线粒体钙离子摄取关键调节分子mcur1,明确mcur1介导的线粒体钙稳态重塑是否参与对肝癌生长的调控,并探索mcur1介导的线粒体钙稳态重塑调控肝癌生长的作用机制。【方法】1.利用免疫组化实验分析mcur1以及p53在原发性肝癌临床标本的表达及相关性。2.利用mts法测定细胞生长曲线、克隆形成实验、annexin-v凋亡检测、流式细胞周期检测、edu细胞增殖等实验方法,分析mcur1对肝癌细胞增殖凋亡及生长的影响。3.利用裸鼠皮下荷瘤实验,分析mcur1在体内对肝癌生长的影响。4.利用rhod-2,fluo-4活细胞染色,分析mcur1对肝癌细胞线粒体基础钙离子水平以及线粒体对胞浆钙的缓冲作用的影响。5.利用dcf及mitosox染料对细胞ros及线粒体ros进行染色,分析mcur1对肝癌细胞线粒体ros生成的影响。6.利用westernblot检测凋亡相关分子,以及增殖相关分子的表达改变,分析mcur1介导的线粒体钙稳态重塑促进肝癌细胞的生长的作用机制。【结果】第一部分:通过对原发性肝癌临床标本进行分析,发现mcur1在肝癌组织中表达上调,与肝癌不良预后相关。通过采用mts法测定细胞生长曲线、克隆形成实验、annexin-v凋亡检测、流式细胞周期检测、edu细胞增殖等实验方法,发现肝癌细胞中mcur1通过抑制细胞凋亡并且加速细胞增殖而促进肝癌细胞的生长。通过进行裸鼠皮下荷瘤实验,证实mcur1通过抑制肝癌凋亡,加速肝癌增殖,而促进肝癌的生长。第二部分:通过rhod-2,fluo-4染色检测线粒体钙以及胞浆钙,发现:mcur1能够促进线粒体钙离子摄入,提升线粒体基础钙离子浓度,并且在应急状态下线粒体对胞浆钙的缓冲力。通过对线粒体单向转运体mcu进行干预处理,发现mcur1依赖于mcu促进肝癌细胞线粒体钙的摄取。第三部分:通过对细胞ROS以及线粒体ROS的检测,发现mcur1能够促进肝癌细胞线粒体ROS生成。通过线粒体的ROS清除剂Mito-TEMPO对细胞中线粒体ROS进行清除,以及线粒体钙清除载体PV-Mito对线粒体内的钙离子进行清除,发现mcur1介导的线粒体钙离子稳态重塑通过促进肝癌细胞线粒体ROS生成,而抑制细胞凋亡促进细胞增殖。第四部分:通过检测凋亡相关分子,增殖相关分子,P53,AKT及MDM2磷酸化的检测,证实:mcur1介导的线粒体钙稳态重塑通过ROS/AKT/MDM2途径使P53失活促进肝癌细胞生长。【结论】本课题研究发现:mcur1介导肝癌线粒体钙离子摄入增强,重塑的线粒体钙稳态影响ROS的生成,通过ROS/AKT/MDM2途径使P53失活,调控肝癌的增殖凋亡,最终促进肿瘤进一步恶化。

关键词： mcur1 线粒体钙稳态细胞生长肝癌 ROS AKT/MDM2 P53

AFG3L2调控mcur1减轻肠缺血再灌注损伤

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AFG3L2调控MCUR1减轻肠缺血再灌注损伤

作者：田东海大连医科大学

学位级别：硕士

肠缺血再灌注(Ischemia/Reperfusion,I/R)损伤是临床疾病中常见的病理过程,肠I/R损伤病理机制复杂涉及多种因素,其中线粒体受损导致钙离子超载是I/R损伤的主要致病机制之一。尽管有大量关于肠I/R损伤的基础和临床研究,但目前对线粒体受... 详细信息

肠缺血再灌注(Ischemia/Reperfusion,I/R)损伤是临床疾病中常见的病理过程,肠I/R损伤病理机制复杂涉及多种因素,其中线粒体受损导致钙离子超载是I/R损伤的主要致病机制之一。尽管有大量关于肠I/R损伤的基础和临床研究,但目前对线粒体受损导致钙离子超载加重肠I/R损伤的具体机制仍不完全了解。线粒体损伤发生在I/R早期,I/R导致线粒体钙超载造成线粒体功能紊乱激活多种病理损伤系统,共同导致I/R后的细胞损伤。Ca通过线粒体钙离子通道进入线粒体,钙离子通道是由线粒体钙转运蛋白(Mitochondrial Cacium Uniporter,MCU)、线粒体钙离子摄入蛋白1(Mitochondrial Calcium Uptake 1,MICU1)、必要的线粒体钙单向转运体调节蛋白(Essential MCU Regulator,EMRE)及线粒体钙单向转运体调节分子1(Mitochondrial Calcium Uniporter Regulator 1,mcur1)等共同组成的复合体,其调节线粒体钙吸收,稳定线粒体钙平衡。新近研究证实,线粒体Ca信号通路在肠道I/R诱导的细胞损伤中起着显著的作用,I/R导致大量的Ca通过钙离子通道进入线粒体,当线粒体内Ca超载时,Ca诱导线粒体通透性转变孔(mitochondrial Permeability Transition Pore,m PTP)开放,释放细胞色素c,引发细胞凋亡。然而钙离子通道在肠I/R中的具体机制尚不明确。AFG3L2(AFG3 Like Matrix AAA Peptidase Subunit 2,AFG3L2)是m-AAA(membrane-Anchored AAA,m-AAA)蛋白酶体中发挥主要作用的蛋白水解酶,AFG3L2自我装配于线粒体内膜并依赖ATP供能发挥作用,维持线粒体蛋白稳定以及高效的氧化磷酸化活性。AFG3L2基因突变会导致脊髓小脑共济失调,其在脑退行性疾病中可以通过与MCU亚基EMRE结合参与调节线粒体Ca稳态平衡。然而AFG3L2是否参与肠I/R的病理过程仍不清楚。此外,其与钙离子通道蛋白的关系未被明确。为此,我们进行了临床预实验,通过对人缺血小肠组织检测分析,发现AFG3L2与EMRE、mcur1均发生了改变,其中mcur1升高最为明显。据此我们认为:AFG3L2和mcur1可能参与了肠缺血的病理损伤过程。进一步体内实验显示,肠I/R后,AFG3L2蛋白水平降低,mcur1升高。据此,我们提出科学假说:AFG3L2和mcur1可能参与肠I/R病理损伤过程,肠I/R发生后AFG3L2蛋白水平降低,减弱了对mcur1的调控,线粒体钙离子吸收增加,造成线粒体钙离子超载。靶向上调AFG3L2可明显抑制肠上皮细胞线粒体钙离子吸收,减轻线粒体超载,改善肠I/R损伤。深入研究其调控机制对肠I/R防治具有重要意义。为了验证以上假说,本研究结合临床病人缺血小肠标本,利用体内外模型,通过Western blot、免疫组化、q PCR、共聚焦显微镜、基因干扰、过表达等技术,探讨AFG3L2与mcur1在肠I/R中的关系及可能的调控机制。结果表明:(1)肠I/R后AFG3L2蛋白水平降低,H&E染色显示小肠粘膜绒毛肿胀水肿,部分绒毛顶端脱落,Chiu’s病理评分升高,过表达AFG3L2后小肠粘膜绒毛肿胀水肿减轻。与I/R相比,体内过表达AFG3L2后,血清中TNF-α和IL-6水平降低,肝脏和肺脏的组织病理学评分降低。(2)AFG3L2可与mcur1结合且在Ser发生磷酸化修饰,肠I/R后,mcur1蛋白水平升高。(3)Caco-2细胞H/R后,过表达mcur1可增加线粒体钙吸收,敲低mcur1后,线粒体Ca含量降低。过表达AFG3L2后,mcur1的蛋白水平降低,线粒体Ca含量降低,细胞凋亡数量减少。AFG3L2在Ser位点发生磷酸化修饰且在肠I/R损伤中发挥了重要作用。肠I/R后,AFG3L2蛋白水平降低,减弱了对mcur1的调控,线粒体钙离子吸收增加,导致线粒体钙超载。上调AFG3L2可明显减轻小肠上皮细胞线粒体钙超载造成的I/R损伤。本研究丰富了对肠I/R机制的探究,AFG3L2可作为肠I/R损伤的潜在治疗靶点,为治疗I/R损伤以及预防缺血性相关临床疾病提供了重要的依据。

关键词：肠缺血再灌注 AFG3L2 mcur1 钙超载

Hsa＿circ＿0000098参与肝癌进展的分子机制及靶向治疗研究

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Hsa＿circ＿0000098参与肝癌进展的分子机制及靶向治疗研究

作者：李祎南通大学

学位级别：硕士

目的1.探讨环状RNA(circular RNA,circRNA)hsa＿circ＿0000098在肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)中的表达与功能;2.探讨hsa＿circ＿0000098/miR-383/线粒体钙单向转运体调节分子1(mitochondrial calcium uniporter regulator 1,mcur1)参与HCC进展的分子机制;3.以血小板(blood platelet,PLT)为载体靶向hsa＿circ＿0000098及mcur1联合阿霉素(doxorubicin,DOX)治疗HCC的研究。方法1.根据GSE97332数据库circRNA芯片结果,采用实时荧光定量PCR(quantitative Real-time PCR,q RT-PCR)技术筛选出在HCC中差异表达的hsa＿circ＿0000098,Sanger测序和RNase R酶试验验证hsa＿circ＿0000098的环化特性;2.构建hsa＿circ＿0000098过表达及RNA干扰载体;分析其对HCC细胞功能的影响;3.核浆分离试验确定hsa＿circ＿0000098在细胞中的定位;4.生物信息学预测及双荧光素酶试验验证hsa＿circ＿0000098与miR-383之间的关系;5.生物信息学预测及双荧光素酶试验验证miR-383与mcur1之间的关系;6.q RT-PCR和Western blot分析hsa＿circ＿0000098、miR-383调控mcur1的表达;7.回复试验分析hsa＿circ＿0000098/miR-383/mcur1轴对HCC细胞功能的影响;8.体内实验探讨hsa＿circ＿0000098对HCC裸鼠移植瘤生长的影响;9.通过超声技术将DOX与sh-circ＿0000098、sh-mcur1载体包载入PLT形成DOX/sh-circ＿0000098/sh-mcur1@PLT复合药物;扫描电镜、粒径分析、激光共聚焦显微镜技术与电位分析技术对复合药物进行表征;10.体外试验分析DOX/sh-circ＿000098/sh-mcur1@PLT在HCC细胞中代谢情况;11.体内试验探讨DOX/sh-circ＿000098/sh-mcur1@PLT在HCC中的作用;12.q RT-PCR和Western blot探讨复合药物作用机制。结果***＿circ＿0000098在HCC组织及细胞中显著高表达;Sanger测序证实了特异性的扩增产物中存在hsa＿circ＿0000098的环化位点,Rnase R酶试验与凝胶电泳也证实了hsa＿circ＿0000098的成环性;2.体外实验提示,RNA干扰hsa＿circ＿0000098后,能抑制HCC细胞增殖、侵袭、迁移潜能;过表达hsa＿circ＿0000098后,则增强了HCC细胞增殖、侵袭、迁移潜能;3.核浆分离试验提示hsa＿circ＿0000098主要位于胞质;4.生物信息学预测及双荧光素酶试验证实hsa＿circ＿0000098与miR-383之间存在互作关系;且在HCC组织中二者表达呈负相关;5.生物信息学预测及双荧光素酶试验证实mcur1为miR-383的靶基因之一;且在HCC组织中mcur1表达与miR-383呈负相关,与hsa＿circ＿0000098呈正相关;*** R-383可下调HCC细胞中mcur1的表达;而hsa＿circ＿0000098可上调mcur1的表达;7.回复试验显示,miR-383可使HCC细胞增殖与转移能力下降;而过表达hsa＿circ＿0000098则可逆转此现象;进一步RNA干扰mcur1后,HCC细胞增殖与转移能力再次被削弱;8.在体试验显示,RNA干扰hsa＿circ＿0000098可抑制裸鼠移植瘤的生长及mcur1的表达;9.成功构建DOX/sh-circ＿0000098/sh-mcur1@PLT复合药物,表征实验证实该复合药物电位为-9.93mv,粒径为220nm,符合人体所需负电性,能作为纳米载药微粒进入肿瘤组织;10.体外实验显示,该复合药物在HCC细胞内显示出较强的荧光强度,其能有效的聚集在细胞,降低自身的代谢;11.体内实验显示,将复合药物尾静脉注射入小鼠体内后靶向肿瘤组织能减少细胞的药物外排,抑制肿瘤生长;12.机制研究发现复合药物通过降低HCC细胞中的ATP,使得ATP依赖性的药物外排泵P-糖蛋白(permeability glycoprotein,P-gp)表达减少,继而抑制复合药物外排。结论Hsa＿circ＿0000098在HCC中高表达,可作为癌基因促进肿瘤生长、转移,并通过hsa＿circ＿0000098/miR-383/mcur1轴促进HCC进展。靶向

关键词： hsa_circ_0000098 miR-383 mcur1 肝癌药物外排

HBV HBx蛋白调控肝癌细胞增殖的机制研究

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医学分子生物学杂志 2023年第1期20卷 70-77页

作者：宋平辉张毅吴忠坤李春博李勤新陕西省核工业二一五医院普通外科陕西省咸阳市712000 兴平市人民医院儿科陕西省兴平市713199

目的探讨HBV HBx蛋白调控肝癌细胞增殖的潜在机制.方法过表达HBx后,检测肝癌细胞HepG2的增殖水平.在过表达Flag-HBx的肝癌细胞HepG2中免疫共沉淀HBx后进行蛋白质质谱鉴定,Score阈值设定为大于50,Coverage阈值设定为大于10.过表达HBx的... 详细信息

目的探讨HBV HBx蛋白调控肝癌细胞增殖的潜在机制.方法过表达HBx后,检测肝癌细胞HepG2的增殖水平.在过表达Flag-HBx的肝癌细胞HepG2中免疫共沉淀HBx后进行蛋白质质谱鉴定,Score阈值设定为大于50,Coverage阈值设定为大于10.过表达HBx的肝癌细胞HepG2中,使用siRNA敲低质谱鉴定的相应基因,检测HepG2的增殖水平.结果过表达Flag-HBx后,肝癌细胞HepG2的增殖水平上升(Pmcur1后肝癌细胞HepG2的增殖水平下降(Pmcur1和HBx能够促进肝癌细胞HepG2的增殖(Pmcur1对肝癌细胞HepG2的增殖无显著影响.与过表达HBx组比较,过表达HBx的同时敲低mcur1时肝癌细胞HepG2的增殖水平下降(Pmcur1时肝癌细胞HepG2的ROS水平无显著变化.与对照组或过表达HBx组比较,同时过表达mcur1和HBx能够增加肝癌细胞HepG2的ROS水平(Pmcur1时肝癌细胞HepG2的增殖水平下降(P1后Nrf2在细胞核中的定位无显著变化.与对照组比较,过表达HBx后肝癌细胞HepG2中转录因子Notch的激活形式NICD1在细胞核中的定位增加(P1在细胞核中的定位无显著变化.与过表达HBx组比较,过表达HBx的同时ML385处理后肝癌细胞HepG2的增殖水平下降(P1处理后肝癌细胞HepG2的增殖水平下降(Pmcur1/ROS/Nrf2/Notch轴有关.

关键词： HBx 肝癌增殖 ROS mcur1