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丹芪偏瘫胶囊中羚羊角用人工牛黄替代的初步研究

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中国中药杂志 2015年第18期40卷 3616-3622页

作者：王进博陈涛李正张艳军崔维利李进天津中医药大学第一附属医院天津300193 天津中医药大学天津300193

为研究丹芪偏瘫胶囊(DPC)及其羚羊角替代方(DPCAS)对脑缺血的保护作用,初步探讨人工牛黄替代羚羊角的可能性,该文采用左侧大脑中动脉栓塞(MCAO)模型,将150只SD大鼠随机分为假手术组,模型组,DPC(0.246 g·kg-1·d-1)组,丹芪偏瘫胶囊去羚... 详细信息

为研究丹芪偏瘫胶囊(DPC)及其羚羊角替代方(DPCAS)对脑缺血的保护作用,初步探讨人工牛黄替代羚羊角的可能性,该文采用左侧大脑中动脉栓塞(MCAO)模型,将150只SD大鼠随机分为假手术组,模型组,DPC(0.246 g·kg-1·d-1)组,丹芪偏瘫胶囊去羚羊角(DPCRA,0.246 g·kg-1·d-1)组,丹芪偏瘫胶囊去羚羊角人工牛黄翻倍(DPCBD,0.246 g·kg-1·d-1)组。于第5天给药后1 h制备MCAO模型。术后24 h,眼内眦取血,测定血清超氧化物歧化酶(SOD)活性、内皮素(ET)含量。术后72 h取脑组织,氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法测定大脑梗死面积、测定脑指数。荧光定量PCR方法检测脑组织bcl-2,caspase-3,IL-1β,P-选择素,E-选择素,ICAM-1 mRNA的表达,免疫组化方法检测缺血半暗区ICAM-1,IL-1β,TNF-α,IL-6的表达。结果,与模型组比较,DPCBD和DPC组实验结果基本一致,均能明显改善脑梗死指数和脑指数(P<0.05),均可明显增强大鼠血清SOD活性(P<0.05);均可在一定程度上降低大鼠血清ET水平;均可降低脑组织caspase-3的表达(P<0.05),升高bcl-2的表达(P<0.05);均可降低脑组织IL-1β,P-选择素,E-选择素,ICAM-1 mRNA的表达(P<0.05),均能减少缺血半暗区ICAM-1,IL-1β,TNF-α,IL-6阳性细胞的表达(P<0.05)。DPCRA组对各指标的影响明显不如DPCBD和DPC组。表明DPCBD与DPC疗效相当,提示丹芪偏瘫胶囊中羚羊角可用人工牛黄进行替代。

关键词：丹芪偏瘫胶囊丹芪偏瘫胶囊去羚羊角丹芪偏瘫胶囊去羚羊角人工牛黄翻倍 MCAO 脑梗死抗氧化细胞凋亡炎症反应

牡荆苷对脑缺血再灌注大鼠脑损伤保护作用及其机制研究

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牡荆苷对脑缺血再灌注大鼠脑损伤保护作用及其机制研究

作者：曹欣欣河北北方学院

学位级别：硕士

脑血管病已成为当今世界致死致残的最主要疾病之一。目前对于脑缺血的治疗效果均不能令人满意。临床上急需寻找高效低毒、促使血液再通、减轻缺血再灌致脑损伤的神经保护剂。牡荆苷是传统中药金莲花的主要活性成分,属黄酮碳苷类。课题... 详细信息

脑血管病已成为当今世界致死致残的最主要疾病之一。目前对于脑缺血的治疗效果均不能令人满意。临床上急需寻找高效低毒、促使血液再通、减轻缺血再灌致脑损伤的神经保护剂。牡荆苷是传统中药金莲花的主要活性成分,属黄酮碳苷类。课题组研究表明牡荆苷具有很好的体内抗氧化和对衰老小鼠海马区神经细胞结构的保护作用。而牡荆苷对脑缺血再灌注大鼠脑损伤保护作用方面的研究尚未见报道,本实验以SD雄性大鼠为实验对象,采用Longa改良线栓法制造大鼠脑缺血再灌注（middle cerebral artery occlusion,MCAO）模型,以牡荆苷为干预药,依达拉奉为阳性对照,研究牡荆苷对脑缺血再灌注大鼠脑损伤保护作用并探讨其作用机制。本研究为牡荆苷作为预防和治疗脑血管病有效性药物提供可靠的实验依据,为筛选抗脑缺血药物提供新的方向。实验方法1.MCAO模型的建立采用Longa线栓法造模,缺血2h后进行再灌注,待大鼠苏醒后进行神经行为学评分,验证造模成功。2.动物分组及给药将228只SD大鼠随机分为6个组,分别是假手术组（生理盐水+溶剂）,模型组（生理盐水+溶剂）,模型+依达拉奉阳性对照组（3.24μmol·kg-1）,模型+牡荆苷（1.62,3.24,6.48μmol·kg-1）不同剂量组,大鼠缺血再灌注后1h腹腔注射给药,治疗时间为1d和3d。3.牡荆苷对MCAO大鼠脑梗死体积的影响缺血再灌注大鼠治疗1d后麻醉,断头取脑,冠状位将其切成5等份,采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑（toronto transit commission,TTC）测定大鼠脑梗死体积。4.牡荆苷对MCAO大鼠血脑屏障（bloodbrainbarrier,bbb）保护和抗氧化作用各组缺血再灌注大鼠治疗1d和3d后麻醉,断头取脑,干湿重法测定脑组织含水量;免疫组化法检测大鼠缺血侧皮层水孔通道蛋白-4（aquaporin-4,aqp-4）阳性细胞表达水平;相应试剂盒检测超氧化物歧化酶（superoxidedismutase,sod）活力、活性氧（reactiveoxygenspecies,ros）和丙二醛（malondialdehyde,mda）含量。5.牡荆苷对MCAO大鼠抗炎作用各组缺血再灌注大鼠治疗1d和3d后麻醉,断头取脑,免疫组化法检测大鼠缺血侧皮层toll样受体4（tolllikereceptor4,tlr-4）,nf-κb（p65）阳性细胞表达水平;实时荧光定量多聚核苷酸链式反应（real-timequantitativepolymerasechainreaction,rt-qpcr）检测tlr-4mrna,nf-κb（p65）mrna的表达;酶联免疫吸附试验（enzyme-linkedimmunosorbentassay,elisa）测定大鼠缺血侧脑组织肿瘤坏死因子-α（tumornecrosisfactor-α,tnf-α）。6.牡荆苷对MCAO大鼠非抗氧化作用各组缺血再灌注大鼠治疗1d和3d后麻醉,断头取缺血侧脑组织,相应试剂盒检测一氧化氮（nitricoxide,no）含量和一氧化氮合酶（nitricoxidesynthase,nos）,na+-k+-atp酶活性;氨基酸自动分析仪测定脑组织缺血区谷氨酸（glutamate,glu）,天冬氨酸（aspartate,asp）和甘氨酸（glycine,gly）含量。7.牡荆苷对MCAO大鼠脑组织缺血区形态学作用各组缺血再灌注大鼠治疗1d和3d后麻醉,断头取脑,he染色观察大鼠缺血区神经细胞形态;透射电镜下观察大鼠缺血区神经元细胞超微结构。结果1.MCAO大鼠神经功能学评分依据longa等评分标准,选取1~3分为实验模型大鼠。与假手术组相比,缺血再灌注大鼠出现不能完全伸展手术对侧前爪或向手术对侧转圈、倾倒等神经缺损症状（p＜0.01）,表明MCAO模型制作成功。2.牡荆苷减少MCAO大鼠脑梗塞体积与假手术组相比,模型组大鼠再灌注后缺血侧脑组织出现明显的梗死灶（p＜0.01）;与模型组相比,缺血再灌注大鼠治疗1d后,依达拉奉和牡荆苷各给药组均能有效减小脑梗死体积,并在一定剂量范围内,具有剂量依赖性（p＜0.01,p＜0.05）;与依达拉奉对照组相比,牡荆苷中、低剂量组作用较弱（p＜0.01,p＜0.05）;牡荆苷高剂量组与依达拉奉作用相当,无显著性差异。3.牡荆苷对MCAO大鼠bbb及抗氧化作用影响3.1牡荆苷减轻MCAO大鼠脑水肿程度与假手术组相比,大鼠脑缺血再灌注后,缺血侧脑组织含水量明显增多（p＜0.01）;与模型组相比,缺血再灌注大鼠治疗1d和3d后,依达拉奉和牡荆苷治疗组均能降低脑组织含水量,有显著性差异,（p＜0.01,p＜0.05）且呈剂量依赖性;与依达拉奉相比,缺血再灌注大鼠治疗1d和3d后,牡荆苷中、低剂量组作用较弱,有显著性差异（p＜0.05,p＜0.01）,牡荆苷高剂量组与依达拉奉作用相当,无显著

关键词：牡荆苷 MCAO 抗氧化抗炎（TLR-4,NF-κB,TNF-α） EAA

大脑中动脉闭塞大鼠不同缺血再灌注时间术后状况比较

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按摩与康复医学 2023年第4期14卷 90-93页

作者：易婉莎罗来许金森潘晓华福建中医药大学针灸学院福建福州350108 福建省中医药科学院福建福州350003 福建省经络感传重点实验室福建福州350003

目的:比较大脑中动脉闭塞(middle cerebralartery occlusion,MCAO)大鼠不同缺血再灌注时间术后部分功能状况,为MCAO模型缺血时间选择提供参考。方法:36只Sprague-Dawley(SD)大鼠采用改良线栓法制备MCAO模型,随机分为缺血再灌注1 h组、1.... 详细信息

目的:比较大脑中动脉闭塞(middle cerebralartery occlusion,MCAO)大鼠不同缺血再灌注时间术后部分功能状况,为MCAO模型缺血时间选择提供参考。方法:36只Sprague-Dawley(SD)大鼠采用改良线栓法制备MCAO模型,随机分为缺血再灌注1 h组、1.5 h组、2 h组。通过体质量、Longa评分、平衡木功能评分、脑梗死体积等指标,分析3组大鼠术后状况。结果:1.5 h组、2 h组大鼠体质量第7天较第1天体质量明显下降(PMCAO模型的再灌注时间点。

关键词： MCAO 缺血再灌注时间术后状况

Middle cerebral artery occlusion methods in rat versus mouse model of transient focal cerebral ischemic stroke

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Neural Regeneration Research 2014年第7期9卷 757-758页

作者： Seunghoon Lee Minkyung Lee Yunkyung Hong Jinyoung Won Youngjeon Lee Sung-Goo Kang Kyu-Tae Chang Yonggeun Hong Department of Rehabilitation Science Graduate School of Inje University Ubiquitous Healthcare & Anti-aging Research Center Inje University Cardiovascular & Metabolic Disease Center Inje University National Primate Research Center (NPRC) Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB) Ochang School of Biological Sciences College of Biomedical Science & Engineering Inje University Department of Physical Therapy Graduate School of Inje University

Experimental stroke research commonly employs focal cerebral ischemic rat models （Bederson et al., 1986a; Longa et al., 1989）. In human patients, ischemic stroke typically results from thrombotic or embolic occlusion of a major cerebral artery, usually the mid- dle cerebral artery （MCA）. Experimental focal cerebral ischemia models have been employed to mimic human stroke （Durukan and Tatlisumak, 2007）. Rodent models of focal cerebral ischemia that do not require craniotomy have been developed using intraluminal suture occlusion of the MCA （MCA occlusion, MCAO）（Rosamond et al., 2008）. Furthermore, mouse MCAO models have been wide- ly used and extended to genetic studies of cell death or recovery mechanisms （Liu and McCullough, 2011）. Genetically engineered mouse stroke models are particularly useful for evaluation of isch- emic pathophysiology and the design of new prophylactic, neuro- protective, and therapeutic agents and interventions （Armstead et al., 2010）. During the past two decades, MCAO surgical techniques have been developed that do not reveal surgical techniques for mouse MCAO model engineering. Therefore, we compared MCAO surgical methods in rats and mice.

关键词： MCAO CCA Middle cerebral artery occlusion methods in rat versus mouse model of transient focal cerebral ischemic stroke

内皮细胞分泌的外泌体增强神经祖细胞活性并在急性MCAO中促进神经修复的研究

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内皮细胞分泌的外泌体增强神经祖细胞活性并在急性MCAO中促进神经...

作者：周少婷皖南医学院

学位级别：硕士

目的:相关研究证实,外泌体参与细胞间通讯并调控靶细胞的相关行为。数据表明,脑微血管内皮细胞可分泌外泌体。因此,本研究旨在进一步探讨内皮细胞外泌体对神经祖细胞生存活性的影响,并在MCAO模型中进一步验证,从而为卒中后损伤区神经功... 详细信息

目的:相关研究证实,外泌体参与细胞间通讯并调控靶细胞的相关行为。数据表明,脑微血管内皮细胞可分泌外泌体。因此,本研究旨在进一步探讨内皮细胞外泌体对神经祖细胞生存活性的影响,并在MCAO模型中进一步验证,从而为卒中后损伤区神经功能重建提供新的思路及潜在的临床治疗手段。方法:1.分离培养野生型小鼠的神经祖细胞(NPC),用干细胞专用培养基对其进行培养,待纯化后利用免疫荧光法鉴定其表面特异性抗原。2.用超速离心的方法提取鼠源微血管内皮细胞(bEnd.3)的外泌体,并通过透射电镜,Western blot,动态光散射进行鉴定,分别使用不同浓度培养NPCs,利用CCK8试剂,Edu试剂盒检测其对NPCs增殖能力的影响;利用Trans-well,细胞划痕实验检测外泌体对NPCs迁移能力的作用;在营养因子剥夺的环境中,外泌体处理3h通过FACS/PI检测其对NPCs细胞凋亡的影响,采用Western blot进一步检测各类凋亡蛋白的表达情况。3.MCAO造模成功后,通过颅内立体定位仪在侧脑室注射100uL,100ug/mL的外泌体或PBS,分别在第1,3,7,14,21天进行行为学的评定,第1天和21天通过颅脑磁共振检测动物的病变情况,并分别统计脑梗死体积。结果:神经祖细胞特异性抗体Sox2、Nestin双标成功鉴定提取的细胞;通过Edu,Dapi染色证明了内皮细胞可促进神经祖细胞的增殖和迁移,且与内皮细胞的数量成正比。透射电镜下外泌体形态为椭圆形或圆形,直径大小为30-150nm。Western Blot检测显示内皮细胞培养上清液和外泌体TSG101、Alix、Flotillin-2蛋白均表达阳性。动态光散射分析分离所得细胞外囊泡大小分布均在30-200nm范围内。在加入的外泌体浓度为60ug/mL的条件培养基中,明显能促进NPCs的增殖和迁移,并抑制其凋亡。通过TTC染色确定MCAO模型构建成功,磁共振结果显示造模后第1天和21天颅内立体定位注射外泌体组的动物比注射PBS组的动物脑梗死体积有所减小,catwalk评估显示外泌体组的动物比PBS组的动物行为学结果要好。结论:内皮细胞的外泌体具有促进神经祖细胞的增殖和迁移,并抑制其凋亡的功能,并且在大脑中动脉闭塞模型中验证内皮细胞的外泌体可改善脑梗死后动物的神经功能修复,这可能是一种潜在的临床治疗手段。

关键词：外泌体神经祖细胞 MCAO 细胞间通讯缺血性脑卒中

不同强度跑台训练对脑缺血再灌注大鼠认知功能的影响及其作用机制

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不同强度跑台训练对脑缺血再灌注大鼠认知功能的影响及其作用机制

作者：凌梦钰安徽医科大学

学位级别：硕士

目的认知障碍是脑卒中后常见并发症,运动是促进卒中后运动和认知功能恢复的一种有效的康复方法。本研究中我们通过对卒中后大鼠进行跑台训练,观察运动对大鼠活动及认知的影响,并探索其发生机制,为临床卒中后认知障碍患者的治疗提供指导... 详细信息

目的认知障碍是脑卒中后常见并发症,运动是促进卒中后运动和认知功能恢复的一种有效的康复方法。本研究中我们通过对卒中后大鼠进行跑台训练,观察运动对大鼠活动及认知的影响,并探索其发生机制,为临床卒中后认知障碍患者的治疗提供指导。方法将60只雄性SD大鼠按随机数表法分成6组,跑台组一（ME1）,跑台组二（ME2）,跑台组三（ME3）,假手术跑台组（SE）,模型组（M）,假手术组（S）,每组10只。ME组和M组使用线栓法制备大脑中动脉闭塞再灌注（middle cerebral artery occlusion/reperfusion,MACO/R）模型,造模3天后,对ME组和SE组大鼠进行为期15天的跑台训练,其中ME1组速度为8m/min,ME2组跑台速度为12m/min,ME3组设定跑台速度为15m/min,每组每天运动30分钟。分别在干预后第7天和第15天使用旷场实验和新物体评估各组大鼠的认知功能、焦虑程度和活动能力。然后取缺血侧脑组织,使用尼氏染色观察皮层神经细胞数量及形态变化,采用免疫荧光染色和免疫组织化学染色测定皮层部位神经元核抗原（Neu N）、脑源性神经营养因子（Brain-derived neurotrophic factor,BDNF）突触素I（SynapsinⅠ）、细胞质FMR1相关蛋白1（Cytoplasmic FMRP interacting protein,CYFⅠP1）的阳性细胞表达情况,ELⅠSA测定大鼠血清BDNF、SynapsinⅠ和CYFⅠP1的含量,实时荧光定量PCR（q Rt-PCR）分析皮层中BDNF、SynapsinⅠ和CYFⅠP1 m RNA的相对表达水平。结果1、造模后,模型组大鼠均出现体重下降,神经功能损伤症状。S组大鼠精神状态良好,反应敏捷,毛发光滑有色泽;M组大鼠精神状态差,反应迟钝,毛发发黄干枯;ME组大鼠精神状态一般,反应稍差,毛发欠光滑。行为学结果显示,与S组相比,M组大鼠旷场实验中穿格次数减少（P＜0.0001）、中央区域活动时间明显降低（P＜0.0001）,新物体识别实验中认知指数下降（P＜0.001）;与M组比较,ME组大鼠穿格次数增加（P＜0.01）,中央区域活动时间增加（P＜0.05）,认知指数提高（P＜0.05）,其中ME2在三组中增加最为显著（P＜0.05）。2、尼氏染色结果显示,M组较S组额叶皮层尼氏体数量明显减少（P＜0.0001）,排列紊乱,而ME组较M组尼氏体数量显著增多（P＜0.001）。3、q Rt-PCR结果显示M组大鼠皮层BDNF相对表达量较S组显著增加（P＜0.0001）,SynapsinⅠ和CYFⅠP1 m RNA表达显著降低（P＜0.01）,跑台训练能增加三种m RNA的相对表达水平（P＜0.05）,ME2组大鼠基因相对表达水平增加最明显（P＜0.01）。4、免疫荧光和免疫组化染色结果均发现M组大鼠皮层Neu N、BDNF较S组显著增加（P＜0.05）,SynapsinⅠ和CYFⅠP1显著降低（P＜0.05）,ME组大鼠皮层这四种因子表达较M组均显著增加（P＜0.05）,其增高趋势与q Rt-PCR结果一致。5、Elisa结果显示,M组大鼠血清BDNF表达增加（P＜0.001）,CYFⅠP1和Synapsin Ⅰ表达减少（P＜0.01）,而跑台训练能促进BDNF、SynapsinⅠ和CYFⅠP1分泌,增加血清浓度,其中,中等强度跑台训练组血清浓度增加最为显著（P＜0.05）。结论脑缺血再灌注会导致大鼠认知功能损伤,不同强度跑台训练均能减轻神经损伤表现,改善认知功能,其机制可能与促进Neu N、BDNF、Synapsin Ⅰ和CYFⅠP1表达,增加神经发生和突触可塑性变化有关,其中,中等强度的运动训练对认知功能的改善最为显著。

关键词： MCAO 认知障碍跑台训练 BDNF Synapsin I CYFIP1

小鼠海马缺血后星形胶质细胞摄取谷氨酸及其ICAM-1、NF-κB P65的表达研究

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小鼠海马缺血后星形胶质细胞摄取谷氨酸及其ICAM-1、NF-κB P65的...

作者：李刚华北理工大学

学位级别：硕士

目的观察KM小鼠大脑中动脉缺血后脑梗死体积的改变以及海马神经细胞的变化;探讨KM小鼠大脑中动脉缺血后海马各区域星形胶质细胞数量和形态的改变;研究KM小鼠大脑中动脉缺血后海马各区域星形胶质细胞表达EAAT-2、ICAM-1和NF-κB P65的变... 详细信息

目的观察KM小鼠大脑中动脉缺血后脑梗死体积的改变以及海马神经细胞的变化;探讨KM小鼠大脑中动脉缺血后海马各区域星形胶质细胞数量和形态的改变;研究KM小鼠大脑中动脉缺血后海马各区域星形胶质细胞表达EAAT-2、ICAM-1和NF-κB P65的变化,探讨局灶性脑缺血后海马星形胶质细胞上谷氨酸转运体及炎症介质的表达。方法1采用新式线栓法制作KM小鼠右侧大脑中动脉缺血1h、3h、6h、12h、24h、48h模型,归为缺血组;同时制作假手术1h、3h、6h、12h、24h、48h对照和正常对照,分别归为假手术组和正常组。2取正常组及不同缺血时间组小鼠各3只,使用2,3,5-氯化三苯基四氮唑（2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride,TTC）染色,观察不同缺血时间后脑组织缺血部位及体积的改变。3其余小鼠处死后心脏灌注多聚甲醛,取脑切取海马所在区域,石蜡包埋后连续切片。4将正常组及缺血组小鼠脑组织切片应用苏木素-伊红（Hematoxylin-Eosin,HE）染色法染色后光镜下观察海马各区域神经细胞的形态变化。5将各组小鼠脑组织切片应用免疫组织化学法染色后光镜下观察海马各区域胶质纤维酸性蛋白（Glial Fibrillary Acidic Protein,GFAP）阳性的星形胶质细胞数量及形态变化。6将各组切片应用免疫组织荧光标记法染色后在荧光显微镜下观察海马各区域星形胶质细胞表达兴奋性氨基酸转运体2（Excitatory amino acid transporter 2,EAAT-2）、细胞粘附因子1（Intercellular adhesion molecule 1,ICAM-1）和核转录因子P65（Nuclear factor-k-gene binding P65,NF-κB P65）的改变。7统计学方法:实验所得数据使用Excel 2016办公软件及SPSS 22.0软件整理并分析,数据采用均数±标准差（（?）±s）表示,使用单因素方差分析比较数据,以P＜0.05为差异具有统计学意义。结果1使用KM小鼠制作的右侧大脑中动脉缺血模型在饲养指定时长后出现不同程度的神经损伤症状,假手术组小鼠在饲养指定时长后未出现神经损伤症状。2 TTC染色结果显示右侧大脑中动脉缺血后,缺血48h内右侧脑组织梗死体积不断扩大（P＞0.05）,且在缺血后6h波及到海马;3 HE染色结果表明正常组小鼠海马区域神经细胞未出现异常;缺血组小鼠术后右侧海马神经细胞产生损伤,并随缺血时间的延长不断加重,缺血3h后大量神经元出现水肿,缺血6h出现不可逆性损伤,对侧海马神经细胞在缺血12h后也出现肿胀等改变;4免疫组织化学法结果显示假手术组与正常组小鼠海马GFAP阳性细胞数量无明显差异（P＞0.05）,细胞形态亦无明显改变;缺血组海马各区域GFAP阳性细胞数量在缺血48h内随时间的延长数量不断增多（P＜0.05）,胞体肿胀,突起也不断延长增粗,且细胞增长速度在6h时达到高峰。5 GFAP和EAAT-2免疫荧光标记结果显示,脑缺血后海马各区域EAAT-2阳性表达细胞增多,且EAAT-2主要位于GFAP阳性细胞上,GFAP和EAAT-2共存细胞在缺血24h内数量逐渐增多（P＜0.05）,缺血48h后GFAP和EAAT-2共存细胞数量又有所减少（P＜0.05）。6 GFAP和ICAM-1免疫荧光标记结果显示,脑缺血后海马各区域ICAM-1阳性表达细胞增多,但仅有少部分ICAM-1位于GFAP阳性表达细胞上,ICAM-1和GFAP共存细胞在缺血12h后才开始明显增加（P＜0.05）。7GFAP和NF-κB P65免疫荧光标记结果显示,脑缺血后海马各区域NF-κB P65阳性细胞表达增多,但仅有少部分NF-κB P65位于GFAP阳性表达细胞上,NF-κB P65和GFAP共存细胞随缺血时间的延长逐渐增多（P＜0.05）。结论小鼠一侧大脑中动脉缺血后双侧海马神经元都会产生损伤,且缺血侧损伤更为严重;与此同时,海马区域星形胶质细胞会大量激活。小鼠大脑中动脉缺血后海马区域激活的星形胶质细胞表达EAAT-2增强,同时,其表达的ICAM-1和NF-κB P65也增强。

关键词：小鼠海马星形胶质细胞 MCAO EAAT-2 ICAM-1 NF-κB P65

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栀子中有效成分治疗抑郁症的生物学机制研究

栀子中有效成分治疗抑郁症的生物学机制研究

作者：徐洁南京中医药大学

学位级别：硕士

目的:为了尽可能的减少类似抗抑郁药副作用的发生,从天然产物种寻找有效成分,并探寻其疗效机制,从而为临床服务。栀子被认为是中药中有效的抗抑郁中药之一,同时也是许多传统处方的组成部分,而环烯醚萜苷类成分和藏红花素都是栀子中的主... 详细信息

目的:为了尽可能的减少类似抗抑郁药副作用的发生,从天然产物种寻找有效成分,并探寻其疗效机制,从而为临床服务。栀子被认为是中药中有效的抗抑郁中药之一,同时也是许多传统处方的组成部分,而环烯醚萜苷类成分和藏红花素都是栀子中的主要活性成分,该研究旨在探寻栀子中环烯醚萜类成分的抗抑郁作用及西红花苷对脑缺血的保护作用及其机制。方法:首先,采用HPLC法测定栀子活性成分的含量。其次,将雄性BALB/c小鼠随机分为对照组、模型组、氟西汀组、IGF组,每组9只,通过糖水偏好、开场实验、悬尾和强迫游泳实验研究IGF对SRS模型小鼠的抗抑郁作用,采用HT22细胞检测细胞活性,采用Western blot法检测IGF在体内调节突触可塑性相关蛋白表达,采用ELISA法测定脑皮质酮水平。接下来,选用雄性SD大鼠,通过MCAO实验,建立脑缺血模型,并将大鼠随机分为对照组,模型组,西红花苷组高低剂量组,通过神经学评分对MCAO大鼠进行神经功能评定,2,3,5-三苯基四氮唑氯化铵染色并计算梗死比,Western blot法观察MCAO脑组织自噬标记物表达的影响。结果:首先,栀子中的主要活性成分环烯醚萜类（IGF）（山栀苷甲酯、栀子苷）和西红花苷Ⅰ、西红花苷Ⅱ、新绿原酸、绿原酸的含量分别为 5.28、37.17、2.95、0.49、0.10、0.67 mg/g,其次,IGF对SRS模型小鼠具有抗抑郁作用（P＜0.05,P＜0.01）。同时,IGF可以显著抑制NR1的表达并提高GluR1表达（P＜0.05,P＜0.001）,IGF还能上调SRS小鼠海马中的Akt-mTOR水平（P＜0.05,P＜0.01,P＜0.001）,IGF显著上调4EBP1（P＜0.05）和P70S6K（P＜0.05,P＜0.01）的活化。ELISA结果显示,IGF可显著降低SRS脑内皮质酮水平（P＜0.0001）并上调了 p-mTOR/mTOR水平（P＜0.01）。最后,西红花苷能显著降低MCAO大鼠梗死面积和神经功能评分（P＜0.001）,西红花苷对MCAO大鼠的lc-Ⅱ/i有明显的下调作用（P＜0.001,P＜0.01）,对p62/SQSTM 1的表达有明显的抑制作用,并使MACO 大鼠 p-AMPK/AMPK（P＜0.05）和 ULK 1 水平下降。结论:IGF抗抑郁机制可能与mTOR通路有关,西红花苷可通过mTOR-AMPK-ULK 1通路下调自噬。这些研究结果对栀子的临床和药物开发提供基础和依据。

关键词：栀子 SRS 环烯醚萜抑郁症 mTOR MCAO mTOR-AMPK-ULK

经颈动脉注射人羊膜上皮细胞对大鼠MCAO模型的疗效研究

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经颈动脉注射人羊膜上皮细胞对大鼠MCAO模型的疗效研究

作者：王昊邈第二军医大学

学位级别：硕士

研究背景及目的:脑卒中是一类严重危害人类健康的高致残、致死类疾病,其中缺血性脑卒中占80%。而神经元在缺血缺氧环境中24-48小时便会凋亡,急救的窗口期只有3-6小时,但在现实生活中,绝大多数的患者从发病送至医院后的时间过长,使其丧... 详细信息

研究背景及目的:脑卒中是一类严重危害人类健康的高致残、致死类疾病,其中缺血性脑卒中占80%。而神经元在缺血缺氧环境中24-48小时便会凋亡,急救的窗口期只有3-6小时,但在现实生活中,绝大多数的患者从发病送至医院后的时间过长,使其丧失了最佳手术及溶栓时机。目前国内外热衷于研究通过干细胞移植治疗促进缺血性脑卒中患者神经功能的恢复,但是长期以来传统干细胞治疗却存在诸多障碍,如细胞来源,安全性,免疫排斥,以及伦理道德等诸多问题限制了干细胞治疗的发展。羊膜上皮细胞(Amniotic Epithelial Cell)来源于羊膜上皮层,单层排列生长在面向羊水的一面,是受精卵发育至第8天,所形成的囊胚内细胞团分化而来,因此保留了胚胎干细胞的特性,且具有多能干性,分化能力及可塑性较强。同时,羊膜上皮细胞具有干细胞旁分泌功能,能表达多种细胞因子和营养因子。可促进神经细胞生长,对于神经损伤修复具有较好疗效。其端粒酶活性较弱,因此自身增殖能力非常有限,无致瘤性。并且不表达HLA,无同种异体移植免疫原性。同时该类细胞能分泌表达多种抗炎症因子和相关蛋白,具有治疗炎症、纤维化的潜能。该细胞来源于新生儿产后废弃物羊膜,容易大量获得细胞,易于质量控制,不会带来伦理学问题。综上所述,人羊膜上皮细胞具有以下几个有点:1.无免疫源性、移植不需要配型;2.可以分泌多种神经递质及神经营养因子;3.具有向三个胚层分化的潜能;4.无致瘤性;5.来源广泛、无伦理问题。早在1996年Sakuragawa就提出:人羊膜上皮细胞可以作为神经元和胶质细胞的祖细胞,因为它能表达这两类细胞的分子标志物。目前,已经有越来越多的研究结果表明,人羊膜上皮细胞在体外很容易诱导分化为神经细胞,也可不经体外诱导分化,直接移植到生物体内治疗神经损伤及神经退行性疾病。因此,在治疗神经系统疾病及神经损伤方面,羊膜上皮细胞显然具有更大的向神经细胞分化的潜能。如上所述,在特定的体内微环境如通过脑室内、脑组织内和脊髓蛛网膜下腔注射,羊膜上皮细胞具有通过向神经细胞分化、向损伤部位迁移、修复神经系统损伤的作用,这也是其应用于神经系统疾病和损伤治疗的另一个作用机理。羊膜上皮细胞作为滋养层应用于临床的典型例子是维持角膜缘干细胞(Limbal stem cells,LSCs)的生长。20世纪90年代,人们主要通过外科移植羊膜或者角膜活体组织治疗眼表疾病。查阅相关文献发现,羊膜上皮细胞经侧脑室注射已证实可以恢复脑卒中大鼠部分神经功能。虽然hAECs在基础研究领域受倍受关注,但绝大部分的研究成果尚未应用到临床,但极其有望成为治疗某些疾病,如神经系统疾病、心脏疾病、肝脏疾病等的侯选细胞,用于细胞治疗或组织再生。综上所述,我们进行假设,在动物试验中,与对照组相比,移植羊膜上皮细胞的sd大鼠行为学评分有改善,脑组织切片观察发现人羊膜上皮细胞可以向靶器官聚集、迁移,并且向神经细胞定向分化,是脑梗面积减少,脑脊液中炎症相关因子明显降低。本项目具有双重的研究意义,一方面探索人羊膜上皮细胞对缺血性脑卒的治疗效果并探讨其机制,目前尚无经颈动脉移植在缺血性脑卒中动物模型及临床试验中的疗效研究,另一方面,该研究具有很高的临床应用价值,人羊膜上皮细胞可以作为一种新型的治疗方法引入临床治疗中,具有创伤性低、受众广泛、预期疗效好等优势。第一部分:大鼠大脑中动脉梗阻(MCAO)模型的建立及经颈动脉注射人羊膜上皮细胞(haecs)的疗效分析目的:建立大鼠大脑中动脉梗阻模型并通过颈动脉注射人羊膜上皮细胞来观察其初步疗效方法:1)、选取体重、性别相匹配的sd大鼠随机分为MCAO+haecs(实验组)、MCAO组,建立大脑中动脉缺血再灌注模型。2)、分离人羊膜上皮细胞并体外培养。3)、MCAO模型建立后实验组sd大鼠经颈动脉注射一定量人羊膜上皮细胞。4)、通过longa评分、改良神经功能缺损评分(mnss)量表及平衡木行走试验(beamwalking)记录术后1、3、7、14、28天后大鼠行为学评分。结果:sd大鼠建模后出现明显神经功能障碍表现;经颈动脉注射人羊膜上皮细胞后实验组大鼠较对照组脑缺血再灌注后行为学评分有明显改善。结论:人羊膜上皮细胞经MCAO模型大鼠颈动脉注射后,能够改善其大脑缺血再灌注后的神经功能缺损症状。第二部分:人羊膜上皮细胞(haecs)经颈动脉注射改善大鼠MCAO模型脑缺血症状的机制研究目的:研究人羊膜上皮细胞经颈动脉注射改善大鼠脑缺血再灌注后神经功能的作用机制。方法:1)、通过ttc染色观察大鼠脑梗死面积变化。2)、使用携带绿色荧光蛋白(gfp)基因的慢病毒感染人羊膜上皮细胞,经MCAO大鼠颈动脉注射后,荧光显微镜观察其是否通过血脑屏障进入缺血区域。3)、通过tunel法从细胞水平观察神经细胞凋亡情况。4)、取大鼠脑脊液,通过elisa法检测其中炎症因子、抑炎因子及脑源性神经生长因子含量变化。结果:大脑组织染色提示MCAO大鼠

关键词： MCAO hAECs 颈动脉脑缺血行为学