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eR-α-eRK5信号通路介导流体剪切力促进mc3t3-e1细胞增殖

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中国医学物理学杂志 2017年第3期34卷 291-296页

作者：孟会强姜金郭来威许田恩丁宁夏亚一兰州大学第二医院甘肃兰州730000 甘肃省骨关节疾病研究重点实验室甘肃兰州730000

目的:研究雌激素受体α(eR-α)在流体剪切力促进细胞外信号调节激酶5(eRK5)活化以及eR-α-eRK5信号通路在成骨细胞增殖中的具体分子机制。方法:给予成骨mc3t3-e1细胞孵育特异性eR-α抑制剂MPP(methyl-piperidinopyrazole,1μmol/L),孵... 详细信息

目的:研究雌激素受体α(eR-α)在流体剪切力促进细胞外信号调节激酶5(eRK5)活化以及eR-α-eRK5信号通路在成骨细胞增殖中的具体分子机制。方法:给予成骨mc3t3-e1细胞孵育特异性eR-α抑制剂MPP(methyl-piperidinopyrazole,1μmol/L),孵育高选择性eRK5活性抑制剂XMD8-92(5μmol/L),和/或加载12 dyn/cm^2流体剪切力处理。采用Mtt实验检测成骨细胞的增殖活性,采用蛋白免疫印记实验检测eR-α、P-eRK5、eRK5、Cyclin D1(细胞周期蛋白)和CDK4(细胞周期蛋白依赖性激酶)蛋白的表达水平。结果:生理强度(12 dyn/cm^2)的流体剪切力作用于成骨mc3t3-e1细胞60 min后能显著促进成骨细胞增殖,促进Cyclin D1和CDK4的表达;同时eR-α和P-eRK5的表达显著增加。成骨细胞孵育MPP抑制eR-α后,P-eRK5的表达显著下降,Cyclin D1和CDK4表达也显著降低。孵育XMD8-92抑制eRK5活性后,流体剪切力促进成骨细胞中Cyclin D1和CDK4表达水平显著下降。结论:流体剪切力通过eR-α-eRK5信号通路上调Cyclin D1和CDK4的表达水平,最终导致成骨mc3t3-e1细胞增殖。

关键词：流体剪切力 mc3t3-e1细胞细胞增殖细胞外信号调节激酶5 雌激素受体α 细胞周期蛋白细胞周期蛋白依赖性激酶

女贞子水提液促mc3t3-e1细胞增殖和OPG表达的相关通路试验

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中国兽医杂志 2016年第5期52卷 59-62页

作者：李琴范迎赛高宗勤范开刘钟杰中国农业大学动物医学院北京海淀100193 河北工程大学农学院河北邯郸056000

本试验以mc3t3-e1细胞为模型细胞,用一定浓度的女贞子水提液组、通路抑制剂(ICI182780、RO318220和PDtC)组,女贞子水提液与通路抑制剂的混合组作用细胞72 h后,用CCK-8法和eLISA法检测细胞活性及细胞上清中骨保护素(OPG)蛋白水平。结果显... 详细信息

本试验以mc3t3-e1细胞为模型细胞,用一定浓度的女贞子水提液组、通路抑制剂(ICI182780、RO318220和PDtC)组,女贞子水提液与通路抑制剂的混合组作用细胞72 h后,用CCK-8法和eLISA法检测细胞活性及细胞上清中骨保护素(OPG)蛋白水平。结果显示,与对照组相比,女贞子水提液组的细胞活性显著提高,ICI182780组、RO318220组、水提液+ICI182780混合组和水提液+RO318220混合组细胞活性显著下降。水提液组OPG蛋白水平显著提高,3种抑制剂组及3种混合组的OPG蛋白水平均显著下降;并且女贞子水提液可以加强ICI182780抑制OPG蛋白的作用。表明女贞子水提液可通过eR、PKC和NF-κB通路发挥促进mc3t3-e1细胞增殖及OPG蛋白表达的作用。

关键词：女贞子水提液 mc3t3-e1细胞 eR PKC NF-κB

胶原蛋白肽经由HO-1途径保护H_2O_2诱导的mc3t3-e1细胞损伤

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中国海洋药物 2018年第1期37卷 25-30页

作者：耿敏苗贺韩彦弢王春波青岛大学药学院山东青岛266021 青岛大学医学部基础医学院山东青岛266021

目的骨质疏松症与氧化应激和活性氧(ROS)的产生密切相关,胶原蛋白肽具有潜在的抗氧化作用,其作用机理尚不清楚,因此,本研究在胶原蛋白肽对过氧化氢(H_2O_2)诱导的mc3t3-e1小鼠前成骨细胞氧化应激的保护作用的基础上,探讨其分子作用机制... 详细信息

目的骨质疏松症与氧化应激和活性氧(ROS)的产生密切相关,胶原蛋白肽具有潜在的抗氧化作用,其作用机理尚不清楚,因此,本研究在胶原蛋白肽对过氧化氢(H_2O_2)诱导的mc3t3-e1小鼠前成骨细胞氧化应激的保护作用的基础上,探讨其分子作用机制。方法实验分为正常组,H_2O_2组,胶原蛋白肽低、中、高剂量组(10、100、500g·L^(-1))。胶原蛋白肽各组加入相应浓度的药物预处理24h后,与H_2O_2组一起加入400μmol·L^(-1) H_2O_2孵育24h,空白对照组正常培养。CCK 8和乳酸脱氢酶(LDH)的释放检测细胞毒性。抗氧化试剂盒检测细胞内活性氧(ROS)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH)和丙二醛(MDA)含量的变化,Western blot和Rt-PCR分别检测细胞内HO-1蛋白及mRNA的表达水平。结果胶原蛋白肽能够上调H_2O_2诱导的细胞存活率,以剂量依赖的方式显著降低H_2O_2诱导的氧化损伤。胶原蛋白肽能够及时清除细胞内的活性氧,显著上调HO-1的基因表达,提高GSH、MDA的活性,减轻脂质过氧化反应。结论胶原蛋白肽通过激活HO-1基因表达水平,提高抗氧化活性,对H_2O_2诱导mc3t3-e1细胞的氧化损伤发挥保护作用。

关键词：胶原蛋白肽过氧化氢 mc3t3-e1细胞 HO-1

木豆中产牡荆苷内生真菌的分离鉴定及其对mc3t3-e1细胞增殖作用研究

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木豆中产牡荆苷内生真菌的分离鉴定及其对MC3T3-E1细胞增殖作用研...

作者：牛丽丽东北林业大学

学位级别：硕士

内生真菌是生活于健康植物的各种组织和器官中,能够产生与宿主植物相同或相似的化合物,其次生代谢产物种类繁多,生物活性各异,在农业、医药、工业等领域表现出良好的应用前景。木豆为豆科木豆属植物,具有丰富的药理活性,黄酮类和芪类是... 详细信息

内生真菌是生活于健康植物的各种组织和器官中,能够产生与宿主植物相同或相似的化合物,其次生代谢产物种类繁多,生物活性各异,在农业、医药、工业等领域表现出良好的应用前景。木豆为豆科木豆属植物,具有丰富的药理活性,黄酮类和芪类是其主要活性成分,从木豆当中分离获得的活性成分在抗肿瘤、抗炎、抗病毒、抗氧化及抗菌等方面都具有非常重要的作用。牡荆苷(Vitexin),是存在于木豆中的一类重要的黄酮类物质,临床上用于治疗心脑血管疾病,对缺血性心肌损伤具有良好的保护作用,其机理是增加冠状动脉的血流量、降低射血阻力及血浆粘度、提高RBC的变性能力、抑制血栓形成。本课题主要进行木豆产牡荆苷内生真菌的分离鉴定及其对促进成骨细胞mc3t3-e1增殖作用的研究。研究结果如下：1.以木豆根、茎、叶为材料,将已消毒的植物材料接种至PDA上进行分离培养,传代和纯化,最终获得纯化菌株154株,其中从根中获得76株;从茎中获得15株;从叶中获得63株,均在PDA斜面试管,4度保存。2.参照《真菌鉴定手册》和分子生物学方法鉴定,根据木豆内生真菌不同形态,将分离得到的154株木豆内生真菌进行分类,大致分为：镰刀菌属(Fusarium sp.),毛壳菌属(Chaetomium sp.),附球孢属(epicoccum sp.),节菱孢属(Arthrinium sp.),刺毛霉属(Actinomucor sp.),链格孢属(Alternaria sp.)等。3.运用HPLC-UV和LC-MS/MS方法,确定了木豆产牡荆苷内生真菌的检测条件,色谱条件为：色谱柱：HiQ sil C18W (4.6 mmψ×250 mm,5μm);流动相为乙腈：1%乙酸水溶液=20：80(v/v);检测波长：332 nm;流速：1 mL/min;进样量：15 μL。通过HPLC技术分析与检测,发现两株产牡荆苷的内生真菌,分别是镰刀菌属(Fusarium sp.)的G6和毛壳属(Chaetomium sp.)的Y3。4.利用单因素-响应面中心组合设计方法对液体发酵培养基的种类、组分、初始pH值及培养条件进行优化,以G6菌株为实验对象,考察了影响内生真菌牡荆苷产量的主要因素,包括不同种类培养基、碳源浓度、氮源浓度、培养时间、培养温度及培养基初始pH值等。确定了最佳的木豆内生真菌G6菌株发酵培养条件：培养基为PDB液体培养基、添加2%的葡萄糖为碳源、添加1%的硫酸铵为氮源、培养基初始pH值为5、培养时间为6天、培养温度为28℃,该条件下培养G6获得牡荆苷的量达到18.51 mg/L。5.通过利用Mtt法研究内生真菌产牡荆苷菌株提取物对成骨细胞mc3t3-e1促进增殖的效果,采取牡荆苷标准品为阳性对照,木豆产内生真菌粗提物为待测样品,结果如下：产牡荆苷内生真菌对成骨细胞mc3t3-e1的增殖产生不同程度的影响,从时间和浓度梯度来看,药物浓度为1×10-4μg/mL的内生真菌产牡荆苷发酵液粗提物对细胞作用12 h时的增殖效果最显著,最大增殖率达到33.46%。本文以木豆植株作为宿主植物,分别从根、茎、叶中分离内生真菌,通过形态学和分子生物学方法鉴定内生真菌的种属分类;利用HPLC方法筛选出产牡荆苷的内生真菌并计算其产量;通过响应面中心组合设计实验对牡荆苷内生真菌液体培养条件进行优化;以成骨细胞mc3t3-e1为体外模型,考察内生真菌产牡荆苷菌株对mc3t3-e1成骨细胞增殖率的影响。本研究首次从木豆中获得了产牡荆苷的内生真菌菌株G6和Y3,利用该菌株生产牡荆苷时间短产量高,易于实现规模化生产,应用前景广阔。

关键词：内生真菌木豆牡荆苷 mc3t3-e1细胞

牵张应力介导miR-132-3p靶向调节Smad5对mc3t3-e1细胞增殖及成骨分化的影响

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牵张应力介导miR-132-3p靶向调节Smad5对MC3T3-E1细胞增殖及成骨...

作者：孙芬山西医科大学

学位级别：硕士

目的:应力状态下牙周组织的改建是临床错牙合畸形矫治的生物学基础。在机械应力作用下,细胞成骨分化的过程受到多种信号通路的调控。同时越来越多的研究发现,MicroRNA(miRNA)是调控细胞成骨分化的重要因子之一。但目前对牵引力作用下,mi... 详细信息

目的:应力状态下牙周组织的改建是临床错牙合畸形矫治的生物学基础。在机械应力作用下,细胞成骨分化的过程受到多种信号通路的调控。同时越来越多的研究发现,MicroRNA(miRNA)是调控细胞成骨分化的重要因子之一。但目前对牵引力作用下,miRNA在tGF-β/BMP信号通路或其相关的信号分子调控细胞成骨分化的过程中所扮演的角色尚未见报道。因此,本研究拟通过mc3t3-e1细胞体外培养-力学刺激模型,筛查12%周期性牵引力作用下细胞内差异表达的miRNAs,鉴定与tGF-β/BMP信号传导通路相关的差异miRNAs。并进一步确定miRNAs在tGF-β/BMP信号通路的靶标基因及其对细胞增殖和成骨分化的影响。为阐明正畸治疗过程中局部骨改建机制提供新思路。方法:1.利用miRNA基因芯片技术初步筛选出12%牵张应力作用下mc3t3-e1细胞差异表达的miRNAs,结合文献报道对与tGF-β/BMP信号通路相关的miRNAs进行qRt-PCR验证。2.基于方法1的研究结果,确定差异表达的miRNA。通过生物信息学软件预测差异表达的miRNA在tGF-β/BMP信号通路上可能的靶基因,并通过Western Blot验证牵引力作用下靶基因在mc3t3-e1细胞中的表达。通过miRNA转染、qRt-PCR、Western Blot以及双荧光素酶报告基因实验进行靶基因的验证。在miRNA转染的细胞中通过CCK8法检测细胞增殖能力的变化,qRt-PCR检测成骨分化标志因子表达变化,探讨miRNA在mc3t3-e1细胞增殖及成骨分化中的作用。结果:1.MiRNAs芯片结果显示,相比于对照组,应力加载组细胞中差异表达的miRNAs有44种(pt-PCR结果显示,应力加载组细胞中miR-132-3p表达改变最显著且其表达上调。2.生物信息学软件分析显示,miR-132-3p在tGF-β/BMP信号通路上的可能靶基因为Smad2、Smad5,同时Western Blot结果也显示应力加载后Smad2和Smad5及p-Smad2和p-Smad5表达降低。QRt-PCR和Western Blot结果表明过表达miR-132-3p可以抑制Smad5蛋白的表达,但对Smad5mRNA影响并不明显。双荧光素酶实验显示Smad5为miR-132-3p可以结合的有效靶基因。功能研究方面结果显示,当mc3t3-e1细胞高表达miR-132-3p时,细胞增殖能力及成骨分化相关因子ALP、OCN、Runx2表达水平显著下降。结论:1.12%拉伸应力可以激活mc3t3-e1细胞中多种miRNAs的差异表达,其中miR-132-3p差异最为显著;2.MiR-132-3p可能通过靶向Smad5抑制mc3t3-e1细胞的增殖和成骨分化能力。

关键词：周期性牵引力 mc3t3-e1细胞 miR-132-3p Smad5 成骨分化

电离辐射对mc3t3-e1细胞诱导的成骨细胞增殖分化及Notch信号通路的影响

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电离辐射对MC3T3-E1细胞诱导的成骨细胞增殖分化及Notch信号通路...

作者：唐泉北京协和医学院

学位级别：硕士

目的：放射治疗是一种常用的治疗癌症的方法,但是同时放射治疗也会对骨组织产生多种副作用。骨的重建是一个持续的动态过程,其中成骨细胞负责骨的生成,而破骨细胞进行骨吸收。成骨细胞和破骨细胞在数量和功能上的平衡对维持正常的骨代... 详细信息

目的：放射治疗是一种常用的治疗癌症的方法,但是同时放射治疗也会对骨组织产生多种副作用。骨的重建是一个持续的动态过程,其中成骨细胞负责骨的生成,而破骨细胞进行骨吸收。成骨细胞和破骨细胞在数量和功能上的平衡对维持正常的骨代谢具有重要作用。目前,放射治疗对成骨细胞的分化和功能影响的分子机制尚不清楚。Notch信号通路是一种高度保守的信号通路,其对成骨细胞的增殖和分化有重要影响。研究辐射对成骨细胞中Notch信号通路的影响对于有效的预防和治疗由放射治疗引起的骨折和骨质疏松症有重要的意义。方法：本研究采用成骨细胞系mc3t3-e1为模型,在成骨细胞分化培养基(Osteoblast differentiation medium, OBDM)中培养8d后,分化为成骨细胞前体细胞;在成骨细胞分化培养基中培养18d后,分化成为成骨细胞。将mc3t3-e1细胞、其诱导形成的成骨细胞前体细胞和其诱导形成的成骨细胞经2和4Gy剂量的电离辐射后,通过Mtt方法检测2和4Gy剂量的电离辐射对上述三组细胞增殖的影响,通过实时定量PCR和Western blot方法检测2和4Gy剂量的电离辐射对Notch信号通路及成骨细胞中重要的细胞因子的mRNA水平和蛋白表达水平的影响。结果：在2和4Gy剂量的电离辐射条件下,mc3t3-e1细胞和成骨细胞前体细胞的相对存活率降低,而成骨细胞的相对存活率仅在2Gy剂量的电离辐射条件下明显降低;Notch信号通路受体Notch1、Notch2、Notch3和Notch4在不同剂量的电离辐射条件下受到的影响不同;在4Gy的电离辐射的条件下Hes1在mc3t3-e1细胞和成骨细胞中的表达水平升高,而mc3t3-e1细胞和成骨细胞的增殖分化能力降低;4Gy剂量的电离辐射引起Runx2和ALP在成骨细胞的表达降低,而2Gy的电离辐射条件下,Runx2在成骨细胞中的表达水平降低,ALP的表达水平却略有升高;成骨细胞前体细胞细胞在接受4Gy剂量的电离辐射后,RANKL和M-CSF的基因表达水平升高,在成骨细胞中,RANKL和M-CSF在成骨细胞中的表达水平升高,OPG在成骨细胞中的表达水平降低。结论：电离辐射之所以能够抑制骨的发育和愈合,有可能是通过抑制成骨细胞及其前体细胞的增殖和分化造成的。电离辐射影响下,成骨细胞前体细胞和成骨细胞中Notch1的表达与成骨细胞分化的抑制之间没有直接联系。电离辐射所导致的骨损伤可能是由于Notch1-4这四种受体共同作用的结果。4Gy剂量的电离辐射通过激活Notch信号通路,诱导Hes1在成骨细胞中的表达升高,抑制成骨细胞分化。2Gy电离辐射条件下ALP在成骨细胞中的表达与Runx2无关。成骨细胞前体细胞和成骨细胞在接受4Gy电离辐射照射后对破骨细胞的增殖和分化具有促进作用,这也可能是电离辐射所导致的骨吸收增强的原因之一。目前为止,电离辐射对成骨细胞增殖和分化的影响尚未进行全面而深入的研究。Notch信号通路对多种细胞的增殖和分化具有调节作用,需要进一步的研究。

关键词： Notch信号通路放射治疗成骨细胞 mc3t3-e1细胞分化增殖

ClC-3氯通道参与tGF-β/Smads通路调控甲状旁腺激素对mc3t3-e1细胞成骨分化的作用研究

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ClC-3氯通道参与TGF-β/Smads通路调控甲状旁腺激素对MC3T3-E1细...

作者：张瑞第四军医大学

学位级别：硕士

研究背景:骨质疏松是临床上最常见的骨代谢疾病之一,主要表现为疼痛、易骨折,严重者可致呼吸功能下降,显著影响病患的生活质量,因而骨质疏松的治疗越来越受到人们的关注。甲状旁腺的主细胞能够分泌PtH,从而来调控骨组织代谢以及来维持... 详细信息

研究背景:骨质疏松是临床上最常见的骨代谢疾病之一,主要表现为疼痛、易骨折,严重者可致呼吸功能下降,显著影响病患的生活质量,因而骨质疏松的治疗越来越受到人们的关注。甲状旁腺的主细胞能够分泌PtH,从而来调控骨组织代谢以及来维持机体的钙平衡。然而,PtH能够双向地调节骨组织的代谢。具体言之,间断PtH刺激下,小剂量时能够促进骨组织的形成;持续PtH刺激下,大剂量则可以促进骨组织的吸收。但其具体的作用机制尚未探明,因而未能应用于临床上骨质疏松患者的治疗,因此进一步阐明PtH促进骨形成的机制将为其应用于临床提供更多的理论依据。ClC-3电压门控氯通道存在于成骨谱系细胞中,在对成骨细胞的作用上与PtH有许多共同点。前期研究发现,PtH刺激能显著上调成骨细胞中ClC-3的表达。并且PtH能通过ClC-3调节下游成、破骨相关基因的表达,但其分子机制并不十分明确。有研究认为,pth与tgf-β1在膜受体水平上可相互影响,共同调节骨吸收和骨形成,但其作用机制非常复杂还不清楚。在前期研究中我们发现clc-3也参与了成骨细胞中tgf-β1信号的调控,tgf-β可以调节成骨细胞的增殖与分化,其中tgf-β1通过smad2/3信号调控核心结合蛋白因子runx2的表达,进而促进成骨作用。由此可见,clc-3不仅和pth在骨代谢的调节上有密切关系,还参与了tgf-β1信号的调控。所以,clc-3如何介导tgf-β1与pth之间的相互作用关系,还有待进一步研究。本课题旨在研究在pth间断刺激下,clc-3氯通道、tgf-β1及下游信号分子之间的相互关系,为进一步深入研究pth的促成骨分化作用机制提供新的思路。研究目的:本研究旨在通过调节clc-3氯通道基因及tgf-β1基因的不同表达水平来初步探究clc-3氯通道在pth调节成骨分化过程中的作用机制。研究内容:(1)研究在1×10-9mpth对mc3t3-e1细胞每隔6小时间断刺激下,分别下调tgf-β1和clc-3基因表达水平后,观察两者基因、蛋白表达的表达情况。(2)研究在1×10-9mpth对mc3t3-e1细胞每隔6小时间断刺激下,分别下调及共同下调tgf-β1和clc-3基因表达水平后,研究其下游成、破骨相关基因的表达情况。(3)研究在1×10-9mpth对mc3t3-e1细胞每隔6小时间断刺激下,分别下调及共同下调tgf-β1和clc-3基因表达水平后,检测成骨细胞体外矿化能力的变化。研究方法:(1)采用基因转染的方法,分别用特异性sirna下调成骨细胞mc3t3-e1中tgf-β1及clc-3基因的表达水平,同时利用real-timepcr检测mc3t3-e1细胞中tgf-β1和clc-3基因表达水平,成、破骨相关基因(runx2、alp、bsp、oc、opg及rankl)表达水平。(2)通过免疫印迹方法及细胞免疫荧光法检测pth刺激下tgf-β1和clc-3氯通道蛋白表达的影响,初步分析两者之间的关系。(3)利用茜素红染色及计算钙结节观察成骨诱导培养及pth刺激培养下各组mc3t3-e1细胞的体外矿化能力。研究结果:(1)10-9 M的PtH间断刺激时,mc3t3-e1细胞中仅下调tGF-β1基因表达后,ClC-3氯通道基因及蛋白表达水平增强;仅下调ClC-3氯通道基因后,tGF-β1基因及蛋白表达水平增强。(2)10-9 M的PtH间断刺激时,在分别下调mc3t3-e1细胞中ClC-3氯通道基因和tGF-β1基因后,成、破骨相关基因(Runx2、Alp、Bsp、Oc、Opg及Rankl)表达水平较对照组明显降低。(3)10-9 M的PtH间断刺激时,共同下调mc3t3-e1细胞中ClC-3氯通道基因和tGF-β1基因之后,成、破骨相关基因(Runx2、Alp、Bsp、Oc、Opg及Rankl)较对照组无明显差异。(4)10-9 M的PtH间断刺激时,成骨诱导液诱导成骨的能力优于PtH刺激,在分别下调ClC-3氯通道基因和tGF-β1基因表达水平后,mc3t3-e1细胞的体外矿化能力较对照组均下降。在共同下调两者之后,其体外矿化能力较对照组无明显差异。研究结论:(1)在PtH刺激促进mc3t3-e1细胞成骨分化过程中,ClC-3与tGF-β1信号可相互影响。(2)ClC-3氯通道基因和tGF-β1基因均可响应PtH的间断刺激而发生变化,进而影响下游成、破骨相关基因的表达。(3)不同表达水平的ClC-3氯通道基因和tGF-β1基因对PtH刺激促进mc3t3-e1成骨分化作用有一定影响。

关键词： ClC-3氯通道转化生长因子β1 甲状旁腺激素成骨分化特异性的siRNA mc3t3-e1细胞

牙龈卟啉单胞菌对mc3t3-e1细胞中ephB4-ephrinB2信号影响的研究

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牙龈卟啉单胞菌对MC3T3-E1细胞中EphB4-ephrinB2信号影响的研究

作者：张权锦州医科大学

学位级别：硕士

目的观察牙龈卟啉单胞菌对mc3t3-e1细胞中eph B4-ephrin B2信号的影响。方法体外培养mc3t3-e1细胞和牙龈卟啉单胞菌。将实验分为4组,一组加入rh BMP-2诱导mc3t3-e1细胞,其余三组分别加入不同MOI值的牙龈卟啉单胞菌（0、100、200）,共同... 详细信息

目的观察牙龈卟啉单胞菌对mc3t3-e1细胞中eph B4-ephrin B2信号的影响。方法体外培养mc3t3-e1细胞和牙龈卟啉单胞菌。将实验分为4组,一组加入rh BMP-2诱导mc3t3-e1细胞,其余三组分别加入不同MOI值的牙龈卟啉单胞菌（0、100、200）,共同培养24h。分别采用Western-blot、Rt-PCR等方法检测eph B4、ephrin B2、Runx2、ALP、OPN的表达情况。结果1.牙龈卟啉单胞菌可以引起mc3t3-e1细胞的凋亡。2.在牙龈卟啉单胞菌的作用下,实验组eph B4、ALP、OPN的表达都会随着P.gingivalis与mc3t3-e1细胞间MOI的增加而升高。ephrin B2、Runx2的表达先降低后升高。作为阳性对照的rh BMP-2组各蛋白的表达也明显高于阴性对照组。差异有统计学意义（P＜0.05）。结论牙龈卟啉单胞菌可能通过影响mc3t3-e1细胞中eph B4-ephrin B2信号的表达,进而影响骨平衡。

关键词：牙龈卟啉单胞菌 mc3t3-e1细胞 ephB4 ephrinB2 Runx2

ox-LDL对mc3t3-e1细胞和人牙周膜干细胞增殖和成骨能力的影响

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ox-LDL对MC3T3-E1细胞和人牙周膜干细胞增殖和成骨能力的影响

作者：王亚楠山东大学

学位级别：硕士

研究背景与目的高脂血症是一种全身性疾病,指血中总胆固醇、甘油三酯过高和(或)高密度脂蛋白胆固醇过低,现代医学称之为血脂异常。随着我国经济水平的提高和人民生活质量的改善,高脂血症的发病率呈逐年上升趋势。有研究发现高脂血症与... 详细信息

研究背景与目的高脂血症是一种全身性疾病,指血中总胆固醇、甘油三酯过高和(或)高密度脂蛋白胆固醇过低,现代医学称之为血脂异常。随着我国经济水平的提高和人民生活质量的改善,高脂血症的发病率呈逐年上升趋势。有研究发现高脂血症与骨质疏松、牙周炎、种植体骨结合等骨再生相关疾病或过程有密切的联系,其中氧化修饰后脂蛋白,如,氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoproteins,ox-LDL)逐渐引起各领域研究学者的重视。有研究证实,ox-LDL可以通过氧化应激、炎症反应、免疫调节等机制影响骨再生过程。前成骨细胞可以分化为成骨细胞,是骨再生的主要功能细胞,在骨再生过程中具有十分重要的作用。人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells,hPDLSCs)是存在于牙周膜中的一种未分化的间充质干细胞,具有自我更新及多向分化潜能,可以维持牙周组织的稳态,参与牙周组织再生,因为其来源丰富、体外增殖能力和成骨分化能力强,成为口腔颌面部组织再生工程中重要的种子细胞之一。种子细胞微环境和细胞自身的活性状态是影响骨再生的重要因素,然而目前ox-LDL对mc3t3-e1细胞和hPDLSCs增殖和成骨分化的影响及机制仍不明确,因此本文拟通过探究ox-LDL对mc3t3-e1细胞和hPDLSCs增殖和成骨能力的影响,从而进一步揭示氧化修饰脂质对骨再生的影响,从而为高脂血症患者骨缺损疾病的治疗和骨组织再生提供理论支持。材料与方法1.培养mc3t3-e1细胞,进行mc3t3-e1细胞的传代与冻存、复苏;给予mc3t3-e1 细胞 0 u g/ml、5μg/ml、15μg/ml、30μg/ml、50μg/ml、100μg/ml ox-LDL刺激,处理1d、2d、3d、4d、5d,每天同一时间点通过CCK-8测定细胞的增殖活力;给予 mc3t3-e1 细胞含有 0 μ g/ml、5 μ g/ml、15 μ g/ml、30 μ g/ml、50μg/ml、100μg/mlox-LDL的成骨诱导液进行培养,于3d、7d、14d提取总RNA,通过实时定量反转录-聚合酶链式反应(quantitative real-time reverse transcription-polymer chain reaction,qRt-PCR)技术测定成骨相关基因(Collal,Alpl,Runx2)的表达水平,探究ox-LDL对mc3t3-e1细胞成骨分化的影响;给予mc3t3-e1细胞含有0 μ g/ml、50μ g/ml ox-LDL的成骨诱导液进行培养,于7d、14d提取总蛋白,通过微量酶标法检测mc3t3-e1细胞碱性磷酸酶活力,探究ox-LDL对mc3t3-e1细胞成骨分化的影响。2.利用组织块贴壁法分离原代hPDLSCs;利用流式技术检测hPDLSCs表面标志;利用成骨、成脂诱导检验hPDLSCs多向分化潜能;进行hPDLSCs的传代与冻存、复苏。3.给予 hPDLSCs 0 μ g/ml、5 μ g/ml、15 μ g/ml、30 μ g/ml、100 μ g/ml ox-LDL刺激,处理1d、2d、3d、4d、5d,每天同一时间点通过CCK-8测定细胞的增殖活力;给予 hPDLSCs 含有 0μg/ml、5ug/ml、15μg/ml、30μg/ml、50μg/ml、100μg/ml ox-LDL的成骨诱导液进行培养,于3d、7d、14d提取总RNA,通过qRt-PCR技术测定成骨相关基因(COL1A1,ALPL,RUNX2)的表达水平,探究ox-LDL对hPDLSCs成骨分化的影响;给予hPDLSCs含有0μ g/ml、50 μ g/ml ox-LDL的成骨诱导液进行培养,于7d、14d提取总蛋白,通过微量酶标法检测hPDLSCs碱性磷酸酶活力,探究ox-LDL对hPDLSCs成骨分化的影响。实验结果1.成功进行mc3t3-e1细胞的培养、传代、冻存与复苏。CCK-8结果显示,实验组OD值与空白组OD值没有明显差别。当mc3t3-e1细胞于含有50 μ g/ml、100 μ g/ml ox-LDL 的成骨诱导液培养3d后,成骨相关mRNA(Collal,Alpl,Runx2)明显下调;成骨诱导7d后,15μg/ml、30μg/ml、50μg/ml、100μg/ml组成骨相关mRNA(Collal,Alpl,Runx2)均出现明显下调;成骨诱导14d后,15μg/ml、30μg/ml组成骨抑制作用不再明显,但是50μg/ml、l00μg/ml组的成骨相关mRNA(Collal,Alpl,Runx2)依旧呈现明显下调趋势,差异具有统计学意义。当mc3t3-e1细胞于含有50 μ g/ml ox-LDL的成骨诱导液培养14d后,碱性磷酸酶活力明显下降,差异具有统计学意义。2.成功分离培养原代hPDLSCs

关键词： ox-LDL mc3t3-e1细胞人牙周膜干细胞增殖成骨分化