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杂交水稻 2017年第5期32卷 61-65页

作者：陈海龙李永聪刘雄伦刘金灵杨丰宇行璇廖花黄俊刘建丰湖南农业大学农学院湖南长沙410128 作物基因工程湖南省重点实验室湖南长沙410128 水稻油菜抗病育种湖南省重点实验室湖南长沙410128 南方粮油作物协同创新中心湖南长沙410128

根据已克隆的广谱持久抗稻瘟病基因Pi9的启动子序列设计了特异显性DNA标记MS-1,通过分子标记辅助选择(mas)技术,开展连续回交育种,定向改良籼稻恢复系R599及其杂交种的稻瘟病抗性。结果表明,Pi9基因供体亲本75-1-127与受体亲本R599对23... 详细信息

根据已克隆的广谱持久抗稻瘟病基因Pi9的启动子序列设计了特异显性DNA标记MS-1,通过分子标记辅助选择(mas)技术,开展连续回交育种,定向改良籼稻恢复系R599及其杂交种的稻瘟病抗性。结果表明,Pi9基因供体亲本75-1-127与受体亲本R599对23份供试稻瘟菌菌株的抗性表现及抗菌谱差异显著,两亲本的抗性频率分别为91.3%和30.4%。分子标记MS-1在75-1-127与R599之间呈现明显且稳定的多态性,标记基因型对抗病性表型的辅助选择效率达100%。从BC6F3株系中选育出一个与R599遗传背景相似但高抗苗瘟和穗瘟的改良恢复系R599-Pi9,并用它配制出抗稻瘟病的两系杂交种Y两优599-Pi9。

关键词：水稻稻瘟病抗性 mas育种 Pi9基因遗传改良

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InDel分子标记及其在水稻研究中的应用

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种子 2017年第9期36卷 47-52,59页

作者：刘丹孙玉友魏才强解忠李洪亮张巍巍程杜娟孙国宏徐德海黑龙江省农业科学院牡丹江分院黑龙江牡丹江157041

InDel(insertion-deletion)分子标记是指根据在近缘物种或同一物种不同个体间基因组同一位点的序列发生不同大小DNA片段的插入或缺失(insertion-deletion)而设计的多态性引物。它具有分布密度大、准确性高,重演性好的特点,已广泛应用于... 详细信息

InDel(insertion-deletion)分子标记是指根据在近缘物种或同一物种不同个体间基因组同一位点的序列发生不同大小DNA片段的插入或缺失(insertion-deletion)而设计的多态性引物。它具有分布密度大、准确性高,重演性好的特点,已广泛应用于水稻的遗传分析和分子辅助育种研究中。本研究对InDel分子标记的开发利用进行了综述,并着重总结了其在水稻的籼粳分化、遗传多样性分析、基因定位以及功能标记开发等方面的应用进展,旨在为今后更好地开展水稻mas育种研究提供参考。

关键词：水稻 InDel 分子标记应用 mas育种

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利用mas技术选育耐氟且无鳞毛家蚕新品种及AcMNPV敏感性基因的定位分析

利用MAS技术选育耐氟且无鳞毛家蚕新品种及AcMNPV敏感性基因的定...

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作者：于焕君江苏科技大学

学位级别：硕士

随着社会经济的发展,空气污染在许多领域都是一个大问题。氟化物是污染空气的重要组成部分,它不仅对人体有害,还污染树木和桑蚕,危害着蚕桑产业。经研究表明家蚕耐氟性主要由显性主效基因(Dtf)控制着,并已利用SSR标记将其定位于家蚕第1... 详细信息

随着社会经济的发展,空气污染在许多领域都是一个大问题。氟化物是污染空气的重要组成部分,它不仅对人体有害,还污染树木和桑蚕,危害着蚕桑产业。经研究表明家蚕耐氟性主要由显性主效基因(Dtf)控制着,并已利用SSR标记将其定位于家蚕第12连锁群。在我们的试验中菁松亲本是对氟敏感的,当喂食浸渍50 mg/kg NaF的桑叶时就会产生中毒症状,当喂食浸渍100 mg/kg NaF的桑叶时,幼虫全部死亡。而带有抗性基因的个体喂食浸渍200 mg/kg NaF的桑叶时几乎不产生中毒症状。家蚕是鳞翅目的代表,它的翅膀的主要特征是上面覆盖有一层鳞毛。在制种过程中会有大量的鳞毛脱落,飘散在空气中而成微尘,污染工作环境,危害制种工作人员的健康。蚕业学者通过资源考察与采集发现了它的突变体(成虫翅无鳞毛),经遗传分析,发现该性状是由隐性基因(nlw)控制的,并通过分子标记技术将其精细定位。本实验以菁松为轮回亲本,先后与U13和T6品种杂交。首先以菁松品种为母本,T6品系为父本杂交,然后以F1代为母本与U13品系杂交,后代BC1再与菁松母本回交,产生的下一代的BC2代中筛选经济性状最好的雄性个体作为父本与菁松母本回交。在每一次回交后代中,都用与家蚕耐氟性基因Dtf连锁的SSR、STS标记(S1214和S121201)以及与无鳞毛翅基因(nlw)连锁的分子标记(S1305和cash2p)来检测雄蛾子基因型。如果任一标记表现为菁松的纯合型,则该个体的后代予以淘汰,只留S1214和S121201位点表现为菁松与T6的杂合型并且在S1305和cash2p位点表现为菁松和U13杂合型的个体的后代,采用这种检测方法连续回交至BC6代。之后通过自交得到的群体喂食被200 mg/kg NaF污染的桑叶,然后存活下来个体选择无鳞毛翅且经济性状良好的家蚕被选择出来,自交产生下一代BCF。采用分子标记选出那些在Dtf和nlw位点纯合的个体。这样,具有良好性状,高耐氟性并无鳞毛的家蚕产生了。苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographed California multiple nucleopolyhedrovirus)作为杆状病毒的代表种,能够感染许多宿主。研究发现,通过注射接种的方法,重组AcMNPV可以感染部分家蚕品种,且家蚕对AcMNPV的感染性由隐性单基因(susceptible to AcMNPV,sav)控制。以家蚕不感染品种C108和感染品种P50为亲本组配正反交群体,并获得回交群体(P50×C108)×P50和P50×(P50×C108),记作BC1F和BC1M。在家蚕饲养过程中将分离群体的五龄幼虫注射含有GFP标记的重组AcMNPV病毒,并喂养浸渍有抗生素的桑叶3天后用荧光显微镜区观察。有绿色荧光的个体为感染个体,没有绿色荧光的个体为不感染个体。根据家蚕基因组信息,设计STS分子标记对sav基因进行定位分析,将sav基因定位在第3连锁群,绘制的遗传连锁图的遗传距离为48.7cM,sav基因位于37.6cM处,T0399和T03147标记与sav基因的距离最近,分别是5.1和0.4cM。

关键词：家蚕分子标记 mas育种 AcMNPV 基因定位

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利用Pi9基因与mas技术培育抗稻瘟病水稻新品系及杂交种

利用Pi9基因与MAS技术培育抗稻瘟病水稻新品系及杂交种

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作者：陈海龙湖南农业大学

学位级别：硕士

由子囊真菌(Magnaporthe oryzae)引发的稻瘟病,因其发病范围广、发病速度快、病情破坏性大,致使水稻大幅度减产,目前已成为水稻高产稳产的重要限制因素之一。实践证明,合理利用已发掘的抗病基因培育抗谱广、抗性持久的抗病品种是控制此... 详细信息

由子囊真菌(Magnaporthe oryzae)引发的稻瘟病,因其发病范围广、发病速度快、病情破坏性大,致使水稻大幅度减产,目前已成为水稻高产稳产的重要限制因素之一。实践证明,合理利用已发掘的抗病基因培育抗谱广、抗性持久的抗病品种是控制此病害最为经济、高效、安全的手段。本研究根据已克隆的广谱持久抗瘟基因Pi9的序列设计特异功能标记Ins2-1、MS-1、Clon2-1,通过分子标记辅助选择结合多年连续回交育种,定向改良43份水稻受体亲本材料的稻瘟病抗性。获得如下主要结果:1.本研究根据已克隆的广谱持久抗瘟基因Pi9的序列设计特异功能标记MS-1、Ins2-1、Clon2-1,其中Ins2-1、MS-1为显性标记,Clon2-1为共显性标记,用3个标记在43份受体亲本与供体亲本75-1-127之间进行多态分析,多态率依次为90.7%、93.02%、74.42%。经基因型表型对比分析,Ins2-1、MS-1、Clon2-1标记对3个回交群体稻瘟病抗性表型选择效率均可达到100%。2.田间病圃自然抗性鉴定结果表明,供试受体亲本稻瘟病抗性不强,均表现出不同级别的感病,有必要对其稻瘟病抗性进行改良;利用30份稻瘟菌菌株对Pi9供体亲本75-1-127、感病对照材料CO39、5份水稻受体材料进行室内接种表型鉴定得到抗谱。结果表明,受体亲本抗性频率均低于55%,且部分受体亲本抗谱与供体亲本75-1-127抗谱存在互补。3.2015年通过分子基因型鉴定、病圃表型鉴定、大田农艺性状考察,从10个R288/75-1-127BCF株系、18个E32/75-1-127BCF株系、10个R389/75-1-127BCF株系、10个R599/75-1-127BCF株系中分别筛选出1个遗传背景与受体亲本非常接近的抗病纯系,分别命名为“R288-Pi9”、“E32-Pi9”、“R599-Pi9”、“R389-Pi9”,并用这4个抗病纯系及其受体亲本与相应不育系配制杂交种8份。此外,从10个丰源B/75-1-127BCF挑选出1个抗病纯系,命名为“丰源B-Pi9”,并用之改良三系不育系丰源A的稻瘟病抗性。4.2016年,用8份杂交种进行小区栽培试验,分析杂交种稻瘟病抗性及主要农艺产量性状。经分析表明:抗稻瘟病基因Pi9在R288、E32、R599、R389的遗传背景下抗性表达完全,改良抗病恢复系纯系(R288-Pi9、E32-Pi9、R599-Pi9、R389-Pi9)相比4个受体亲本稻瘟病抗性得到显著提高;培两优288-Pi9、培两优E32-Pi9、Y两优599-Pi9、两优389-Pi9改良的抗病组合相比培两优288、培两优E32、Y两优599、两优389传统组合的主要农艺性状和配合力相近,而稻瘟病病抗性得到了显著提高。5.利用MS-1、Ins2-1、Clon2-1等分子标记连续多年开展mas回交育种,考察田间综合农艺性状,于2016年底,共获得11个回交组合的高代纯系群体,并用之与多个不育系配组,所得杂交种40余份;此外,还有3份BCF材料,以及29个回交世代不等的回交群体。为下一步定向改良受体亲本的稻瘟病抗性打下了坚实基础。

关键词：水稻稻瘟病抗性 mas育种抗病纯系及杂交种 Pi9基因

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广谱抗稻瘟病基因Pi2-2的克隆及育种应用

广谱抗稻瘟病基因Pi2-2的克隆及育种应用

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作者：李永聪湖南农业大学

学位级别：硕士

稻瘟病是一种真菌性水稻病害,严重影响水稻的产量与品质。生产上对稻瘟病的防治主要依靠喷施化学药剂,但长期使用化学试剂将导致稻瘟病菌产生耐药性而使得该化学药剂失去防治功能,更严重的是危害生态平衡、影响人类身心健康。而种植具... 详细信息

稻瘟病是一种真菌性水稻病害,严重影响水稻的产量与品质。生产上对稻瘟病的防治主要依靠喷施化学药剂,但长期使用化学试剂将导致稻瘟病菌产生耐药性而使得该化学药剂失去防治功能,更严重的是危害生态平衡、影响人类身心健康。而种植具有广谱持久抗性水稻品种,既可降低水稻的生产成本又可促进环境的可持续发展。因此,挖掘和鉴定稻瘟病抗性基因资源,分离并克隆广谱持久稻瘟病抗性基因,对于研究抗性基因的抗病机理、解析抗性基因与病原效应因子之间的互作机制以及培育广谱抗稻瘟病水稻品种都具有十分重要的意义。Jefferson是引自美国的一个籼稻血缘水稻品种,对不同来源的42份稻瘟菌生理小种产生抗性。目标基因Pi2-2被定位于水稻品种Jefferson第6号染色体上靠近短臂端着丝粒附近,被界定在标记RM19817和AP5659-3之间的0.17 cM范围内,物理距离约270 kb,与已克隆的广谱抗瘟基因Pi9、Pi2、Pi50、Pigm和Piz-t等互为等位基因。在前期BAC末端测序的基础上分析发现,获得的两个阳性克隆所构成的重叠群覆盖整个Pi2/9基因位点,暗示目的基因Pi2-2被包含在这两个克隆中。本研究以广谱抗稻瘟病水稻品种Jefferson为材料,在前期研究基础上,测序分析阳性BAC克隆,进一步克隆目的基因,分析水稻Pi2/9位点中稻瘟病功能抗性基因的分子进化特点,同时利用Pi2-2基因开展分子标记辅助选择育种实践。取得结果如下:1.分离了Pi2-2候选基因并完成了蛋白结构分析。采用同源克隆的策略分离获得了Pi2-2候选基因的完整序列。Pi2-2候选基因序列全长8601 bp,包括3个外显子和2个内含子;基因编码序列全长3099 bp,编码一个包含1032个氨基酸的CC-NBS-LRR类型亲水蛋白。蛋白分子式CHNOS,相对分子质量116721.02 Da,理论等电点PI为6.95。2.完成了Pi2-2候选基因(蛋白)的分子进化分析。分离得到的Pi2-2候选基因启动子区相对Pi9基因启动子而言,有6个InDel插入,合计插入了268个核苷酸,编码区序列与Pi9基因的编码区序列相似性与同源性同样高达99%,仅在第二个外显子区存在个别SNP突变。Pi2-2蛋白与Pi2蛋白间存在44个氨基酸的差异,与Pi9蛋白间存在12个氨基酸差异,与Piz-t蛋白间存在48个氨基酸的差异,与Pigm和Pi50两个蛋白间均存在41个氨基酸差异。进化上与Pi9聚类在一个簇中,与广谱抗瘟基因Pi9具有更近的亲缘关系和更高的同源性,氨基酸的差异也主要存在于C端的LRR区。3.对候选基因Pi2-2进行了CRISPR/Cas9编辑。采用CRISPR/Cas9基因编辑的方法,针对候选基因Pi2-2设计了2个靶位点,通过农杆菌介导的遗传转化获得Jefferson背景下转基因T代植株12株,其中编辑植株6株,有包括缺失和插入5种类型的突变,3株纯合突变和3株杂合突变,基因编辑率为50%。第一种突变类型导致基因在突变位点直接删除1个氨基酸而不引起其他氨基酸的改变;第二种突变类型、第三种突变类型以及第四种突变类型均导致基因编码序列提前终止,仅编码了1022个氨基酸;第五种突变类型是发生了非同义突变,仅该位点的氨基酸发生改变,而其他位点的氨基酸无变化。目前,获得了LRR靶点的转基因植株,将用于后续的稻瘟病抗性分析,验证候选基因功能。4.利用Pi2-2基因开展了水稻稻瘟病抗性定向改良的分子育种实践。根据Pi2-2候选基因的序列,开发获得了1对基于PCR的共显性DNA标记Pi2-2 Pro.1,标记在Jefferson基因组中扩增出一条大小为701 bp的明显而稳定的条带,在95份水稻品系基因组中扩增出一条450 bp的条带,所占比率为98.96%。通过对蜀恢527×Jefferson的BCF回交群体进行辅助选择效率分析,其对后代的选择效率为100%,表明可以利用该标记有效地开展抗瘟基因Pi2-2的分子标记辅助选择育种。同时,结合回交育种方法与分子标记辅助选择技术,以Jefferson为Pi2-2基因供体亲本,以E32、He85、CO1403、蜀恢527、桃1B等5份籼稻品系为受体亲本及轮回亲本,定向改良其稻瘟病抗性,已获得5个组合的BCF群体,为进一步培育抗病新品系奠定了基础。

关键词：水稻稻瘟病抗性 Pi2-2 CRISPR/Cas9基因编辑 mas育种

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标记辅助选择在奶牛育种上的应用

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中国奶牛 2009年第5期 32-34页

作者：李荣岭侯明海李建斌山东省农业科学院奶牛研究中心济南250100

本文简要介绍了标记辅助选择的意义和类型、mas育种体系的方法和奶牛重要经济性状QTL定位和数量性状作图的情况。通过论述国内外mas技术在奶牛遗传缺陷病的检测和种公牛早期选择上的应用,对我国在奶牛育种上应用mas技术进行了展望。

关键词：标记辅助选择 mas育种种公牛早期选择

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