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四逆散通过mapks/nf-κb途径保护脂多糖致Raw264.7的细胞炎症

暨南大学学报（自然科学与医学版） 2019年第1期40卷 10-18页

作者：范慧婕谭章斌赵晓山梁红峰刘彬周迎春南方医科大学中医药学院广东广州510515 阳江市人民医院中医科广东阳江529500 广州医科大学附属第二医院中医科广东广州510150

目的:观察四逆散(SNS)对脂多糖(LPS)诱导的小鼠腹腔Raw264.7巨噬细胞炎症的保护作用,并探讨其可能的作用机制.方法:体外培养Raw264.7细胞,分为空白组,模型组,SNS低、中、高质量浓度组,光学显微镜下观察各组细胞形态变化,Elisa检测各组... 详细信息

目的:观察四逆散(SNS)对脂多糖(LPS)诱导的小鼠腹腔Raw264.7巨噬细胞炎症的保护作用,并探讨其可能的作用机制.方法:体外培养Raw264.7细胞,分为空白组,模型组,SNS低、中、高质量浓度组,光学显微镜下观察各组细胞形态变化,Elisa检测各组细胞培养基上清白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(Tnf-α)的含量,Western-blot法检测各组细胞P-ERK/ERK、P-p38/p38、P-JNK/JNK,P-IKβ-α和P-p65表达量,免疫荧光法检测P65转核情况,激光共聚焦观察LPS与Raw264.7细胞膜binding的程度.结果:SNS可浓度依赖性地抑制LPS诱导的Raw264.7细胞分化,IL-6、Tnf-α炎症因子的释放,降低丝裂原活化蛋白激酶(mapks)/核因子(nf-κb)途径中磷酸化蛋白P-ERK、P-p38、P-JNK,P-IKβ-α和P-p65含量,抑制p65转录入核,及LPS与Raw264.7细胞膜结合.结论:SNS可保护LPS诱导的Raw264.7细胞炎症,该作用可能与其抑制mapks/nf-κb通路磷酸化相关.

关键词：四逆散 Raw264.7 动脉粥样硬化炎症 mapks/nf-κb

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MiR-98-5p介导异牡荆素干预HaCaT细胞凋亡及炎症的分子机制研究

MiR-98-5p介导异牡荆素干预HaCaT细胞凋亡及炎症的分子机制研究

引用

作者：吕雪纯山东农业大学

学位级别：硕士

紫外线辐射、烟雾等因素会导致皮肤细胞的氧化损伤和老化,甚至会导致皮肤角质层脱落,即角质细胞凋亡。皮肤发生细胞凋亡的主要部位是皮肤角质细胞层,而肿瘤坏死因子(Tnf-α)等炎症因子在此过程中起到重要作用。筛选出抑制角质细胞炎症... 详细信息

紫外线辐射、烟雾等因素会导致皮肤细胞的氧化损伤和老化,甚至会导致皮肤角质层脱落,即角质细胞凋亡。皮肤发生细胞凋亡的主要部位是皮肤角质细胞层,而肿瘤坏死因子(Tnf-α)等炎症因子在此过程中起到重要作用。筛选出抑制角质细胞炎症和凋亡的天然活性成分有望预防皮肤损伤和延缓皮肤老化。异牡荆素是多种食源性植物(如绿豆、酸枣仁等)中含有的黄酮类化合物,具有抗氧化、抗炎、抗凋亡等功效,但是其保护皮肤角质细胞的作用机制尚不明确。因此,本论文通过构建HO损伤的人角质形成细胞(HaCaT)模型,系统分析异牡荆素对皮肤炎症和凋亡的抑制作用,并从microRNA角度阐明异牡荆素潜在保护作用机制。主要结果如下:(1)异牡荆素对HaCaT人角质形成细胞氧化损伤的保护作用。MTT结果表明,HaCaT细胞存活率随着HO浓度升高而降低,浓度接近900μM时,达到细胞存活率的IC值;异牡荆素浓度在40μM以内时与CK组相比无显著性差异,证明40μM以下的异牡荆素对HaCaT细胞没有毒性。因此,使用5、10、20μM的异牡荆素分别处理HO损伤的人角质形成细胞,结果表明,在5-20μM浓度范围内,异牡荆素浓度越大,细胞存活率越高;10μM和20μM的异牡荆素可显著降低ROS水平和MDA含量,提高抗氧化酶SOD和GSH-Px活性;不同浓度(5、10、20μM)的异牡荆素能够显著降低HO导致的细胞凋亡。(2)异牡荆素通过bcl-xL/bcl-2/Caspase-3信号通路缓解HO诱导的细胞凋亡。为揭示异牡荆素抗凋亡作用机制,采用荧光定量PCR技术和Western blot技术检测bcl-xL/bcl-2/Caspase-3信号通路的m RNA和蛋白表达特性。结果表明,HO激活凋亡信号通路,不同浓度的异牡荆素(5、10、20μM)能够降低p53基因和蛋白的表达水平,提高其下游基因bcl-2和bcl-xL的表达水平,进而抑制bax、Caspase-9和Caspase-3的促凋亡作用。(3)MiR-98-5p介导异牡荆素对HaCaT细胞的保护作用。采用ENCORI生物信息学软件和PCR技术筛选miRNA,分别用miR-98-5p mimics和抑制剂预处理HaCaT人角质形成细胞24 h,分析miR-98-5p与bcl-xL、bcl-2的靶向关系。结果表明,miR-98-5p mimics降低bcl-2和bcl-xL的表达量,miR-98-5p抑制剂提高bcl-2和bcl-xL的表达水平。为深入分析miR-98-5p介导异牡荆素保护作用的内在机制,将miR-98-5p mimics进行预转染,结果表明miR-98-5p抑制异牡荆素对bcl-2、bcl-xL的促进作用和对Caspase-9、Caspase-3的抑制作用。此外,miR-98-5p mimics逆转异牡荆素导致的细胞存活率、ROS水平和细胞凋亡率的变化趋势。(4)异牡荆素通过mapks/nf-κb信号通路缓解HO诱导的炎症反应。通过PCR和ELISA法检验细胞炎症因子的表达水平,发现HO处理显著增加细胞炎症因子IL-6、IL-1β、Tnf-α的基因表达水平和蛋白释放量,异牡荆素处理显著恢复三者表达量,且具有剂量依赖性。因此,异牡荆素可能通过抗炎途径发挥保护作用。通过Western blot实验发现,HO处理导致MAPK p38、JNK和nf-κb磷酸化的蛋白表达上调,异牡荆素处理抑制MAPK p38、JNK和nf-κb磷酸化。结果证实,异牡荆素通过抑制mapks/nf-κb信号通路的激活进而发挥保护效果。

关键词：异牡荆素抗凋亡 MiR-98-5p mapks/nf-κb

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组蛋白去甲基化酶KDM3A通过MAPK/nf-κb信号通路介导高胰岛素诱导的血管平滑肌细胞的损伤

组蛋白去甲基化酶KDM3A通过MAPK/NF-κB信号通路介导高胰岛素诱导...

引用

作者：张博方武汉大学

学位级别：硕士

目的:以往大量的研究表明组蛋白去甲基化酶KDM3A参与了糖尿病高血糖相关的多种心血管并发症,然而,尚不清楚KDM3A是否参与了高胰岛素所引起的心血管损伤的病理生理过程。因此本次研究的目的是探究下调组蛋白去甲基化酶KDM3A的表达是否可... 详细信息

目的:以往大量的研究表明组蛋白去甲基化酶KDM3A参与了糖尿病高血糖相关的多种心血管并发症,然而,尚不清楚KDM3A是否参与了高胰岛素所引起的心血管损伤的病理生理过程。因此本次研究的目的是探究下调组蛋白去甲基化酶KDM3A的表达是否可以缓解高胰岛素诱导的血管平滑肌细胞功能紊乱并进一步探讨其潜在的机制。方法:从SD大鼠胸主动脉中分离原代血管平滑肌细胞。用含有control-siRNA或KDM3A-siRNA的慢病毒载体转染血管平滑肌细胞72小时,然后在含有浓度为100nm的胰岛素的培养基中培养5天。采用CCK-8法检测血管平滑肌细胞的增殖,transwell小室检测血管平滑肌细胞的迁移,流式细胞学检测测定血管平滑肌细胞的凋亡,DHE荧光探针检测细胞内活性氧簇(ROS)的水平。使用qRT-PCR检测细胞内白介素-6(IL-6)和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)mRNA的表达,此外,采用 western-blot 检测 KDM3A、mapks、nf-κb/p65、bax 和 bcl-2 的蛋白表达水平。结果:100nm的胰岛素可以显著促进血管平滑肌细胞的增殖、迁移、凋亡及ROS的生成,并显著上调细胞中1L-6和MCP-1 mRNA的表达。当平滑肌细胞转染含有KDM3A-siRNA的慢病毒后可以显著逆转由高胰岛素诱导的平滑肌细胞中KDM3A表达的升高,同时,抑制KDM3A的表达可以大大缓解高胰岛素诱导的平滑肌细胞的增殖和迁移,并减少细胞内ROS的产生,减少细胞的凋亡以及炎症因子的表达,更为重要的是,下调KDM3A基因的表达可以缓解高胰岛素导致的MAPK家族蛋白的磷酸化水平和nf-κb/p65表达的上调。结论:高浓度的胰岛素可以对血管平滑肌细胞造成损伤并导致其生理功能紊乱,而下调KDM3A基因的表达可以对高胰岛素培养的平滑肌细胞发挥多重保护作用,其潜在的可能机制是抑制mapks/nf-κb信号通路的激活。

关键词： KDM3A 血管平滑肌细胞胰岛素 mapks/nf-κb

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