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Chaihu-Shugan-San exerts an antidepressive effect by downregulating miR-124 and releasing inhibition of the mapk14 and Gria3 signaling pathways

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Neural Regeneration Research 2018年第5期13卷 837-845页

作者： Qiong Liu Ning-Ning Sun Zheng-Zhi Wu Da-Hua Fan Mei-Qun Cao Department of Cardiovascular Medicine Xiang Ya Hospital of Central South University Changsha Hunan Province China Shenzhen Institute of Geriatrics Shenzhen Second People's Hospital The First Affiliated Hospital of Shenzhen University Shenzhen Guangdong Province China The Eighth Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University Shenzhen Guangdong Province China Chinese and Wsetern Integrative Medicine Shcool of Medicine Jinan University Guangzhou Guangdong Province China.

Dysregulation of mi R-124 has been reported to be involved in the pathophysiology of depression. Chaihu-Shugan-San, a traditional Chinese medicine, has antidepressive activity; however, the underlying mechanisms remain unclear. In this study, to generate a rodent model of depression, rats were subjected to a combination of solitary confinement and chronic unpredictable mild stress for 28 days. Rats were intragastrically administered Chaihu-Shugan-San（2.835 m L/kg/d） for 4 weeks, once a day. Real-time reverse-transcription quantitative polymerase chain reaction, mi RNA microarray, western blot assay and transmission electron microscopy demonstrated that ChaihuShugan-San downregulated mi R-124 expression and upregulated the m RNA and protein levels of mitogen-activated protein kinase 14（mapk14） and glutamate receptor subunit 3（Gria3）. Chaihu-Shugan-San also promoted synapse formation in the hippocampus. The open field test, sucrose consumption test and forced swimming test were used to assess depression-like behavior. After intragastric administration of Chaihu-Shugan-San, sucrose consumption increased, while the depressive behaviors were substantially reduced. Together, these findings suggest that Chaihu-Shugan-San exerts an antidepressant-like effect by downregulating mi R-124 expression and by releasing the inhibition of the mapk14 and Gria3 signaling pathways.

关键词： nerve regeneration traditional Chinese medicine Chaihu-Shugan-San depression open-field test sucrose consumption test forced swimming test miR-124 neural plasticity mapk14 Gria3 neural regeneration

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GSNOR negatively regulates the NLRP3 inflammasome via S-nitrosation of mapk14

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Cellular & Molecular Immunology 2024年第6期21卷 561-574页

作者： Qianjin Liu Lijin Jiao Mao-Sen Ye Zhiyu Ma Jinsong Yu Ling-Yan Su Wei-Yin Zou Lu-Xiu Yang Chang Chen Yong-Gang Yao Key Laboratory of Genetic Evolution&Animal Models and Key Laboratory of Animal Models&Human Disease Mechanisms of Yunnan ProvinceKunming Institute of ZoologyChinese Academy of Sciences650201KunmingYunnanChina Kunming College of Life Science University of Chinese Academy of Sciences650204KunmingYunnanChina Key Laboratory of Biomacromolecules(CAS) National Laboratory of BiomacromoleculesCAS Center for Excellence in BiomacromoleculesInstitute of BiophysicsChinese Academy of Sciences100101BeijingChina KIZ/CUHK Joint Laboratory of Bioresources and Molecular Research in Common Diseases Kunming Institute of ZoologyChinese Academy of Sciences650201KunmingYunnanChina National Research Facility for Phenotypic&Genetic Analysis of Model Animals(Primate Facility) National Resource Center for Non-Human PrimatesKunming Institute of ZoologyChinese Academy of Sciences650201KunmingChina

Hyperactivation of the NLRP3 inflammasome has been implicated in the pathogenesis of numerous ***,the precise molecular mechanisms that modulate the transcriptional regulation of NLRP3 remain largely *** this study,we demonstrated that S-nitrosoglutathione reductase(GSNOR)deficiency in macrophages leads to significant increases in the Nlrp3 and Il-1βexpression levels and interleukin-1β(IL-1β)secretion in response to NLRP3 inflammasome ***,in vivo experiments utilizing Gsnor^(−/−)mice revealed increased disease severity in both lipopolysaccharide(LPS)-induced septic shock and dextran sodium sulfate(DSS)-induced colitis ***,we showed that both LPS-induced septic shock and DSS-induced colitis were ameliorated in Gsnor^(−/−)Nlrp3^(−/−)double-knockout(DKO)***,GSNOR deficiency increases the S-nitrosation of mitogen-activated protein kinase 14(mapk14)at the Cys211 residue and augments mapk14 kinase activity,thereby promoting Nlrp3 and Il-1βtranscription and stimulating NLRP3 inflammasome *** findings suggested that GSNOR is a regulator of the NLRP3 inflammasome and that reducing the level of S-nitrosylated mapk14 may constitute an effective strategy for alleviating diseases associated with NLRP3-mediated inflammation.

关键词： GSNOR S-nitrosation NLRP3 inflammasome mapk14 Septic shock Colitis

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mapk14与胃癌放疗抵抗机制实验研究

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中华肿瘤防治杂志 2019年第21期26卷 1599-1605页

作者：杨甜吴八路江宏强覃桂珍魏永长武汉大学中南医院放化疗科湖北武汉430071 武汉大学中南医院血液科湖北武汉430071

目的胃癌放疗抵抗是绝大多数胃癌患者在治疗过程中所面临的一大难题,探讨其关键基因靶点与潜在机制,对指导临床胃癌患者放射治疗及预后分析有着深远意义。本研究旨在分析丝裂原活化蛋白激酶14(mitogen-activated protein kinase 14,mapk... 详细信息

目的胃癌放疗抵抗是绝大多数胃癌患者在治疗过程中所面临的一大难题,探讨其关键基因靶点与潜在机制,对指导临床胃癌患者放射治疗及预后分析有着深远意义。本研究旨在分析丝裂原活化蛋白激酶14(mitogen-activated protein kinase 14,mapk14)在胃癌放疗抵抗患者及胃癌放疗抵抗细胞株中的表达,探究其在胃癌放疗抵抗中的潜在作用。方法采用the Cancer Genome Atlas(TCGA)数据库获得416例胃癌患者mapk14的mRNA表达水平,Kaplan Meier生存曲线分析mapk14表达与胃癌患者生存的关联性;建立胃癌放疗抵抗细胞株(放抗株)SGC-7901-R,通过克隆形成实验鉴定其放射线抗性,流式细胞术检测其细胞凋亡、细胞周期改变,蛋白质印迹分析放疗抵抗细胞株(放抗株)SGC-7901-R与亲本胃癌细胞株SGC-7901的mapk14蛋白表达差异;免疫组化技术验证胃癌放疗抵抗患者与胃癌放疗敏感患者的mapk14蛋白表达差异。结果 Kaplan-Meier生存曲线分析显示,mapk14低表达组患者的总生存期优于mapk14高表达组,中位生存期分别为57.39和19.32个月,两者的预后差异有统计学意义(χ2=14.96,P=0.000 1)。克隆形成实验表明,在4Gy放射线的作用下,放抗株SGC-7901-R的克隆形成能力高于亲本胃癌细胞株SGC-7901,差异有统计学意义,t=41.99,Pmapk14蛋白表达量高于亲本SGC-7901细胞(1.09±0.07 vs 0.59±0.11),差异有统计学意义,t=3.869,P=0.018。免疫组化结果显示,与胃癌放疗敏感患者相比,胃癌放疗抵抗患者肿瘤组织中mapk14蛋白表达水平上调,差异有统计学意义,t=26.27,Pmapk14异常高表达介导胃癌放疗抵抗且与胃癌患者不良预后相关,其潜在机制与mapk14影响肿瘤细胞凋亡及细胞周期再分布有关。

关键词：胃癌放疗抵抗 mapk14 预后细胞凋亡细胞周期

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PVT1通过调节miR-486-3p/mapk14轴降低食管癌细胞的化学敏感性

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中国免疫学杂志 2021年第24期37卷 2999-3004页

作者：卢万里金哲段东奎王铮裴书飞南阳市中心医院胸外科南阳473000 南阳市中心医院消化科南阳473000

目的:探讨长链非编码RNA PVT1通过调节miR-486-3p/mapk14轴降低食管癌细胞化学敏感性的相关机制。方法:qRT-PCR检测永生化人食管上皮细胞系和食管癌细胞系中PVT1、miR-486-3p、mapk14的相对表达水平;生物信息学预测PVT1、miR-486-3p的... 详细信息

目的:探讨长链非编码RNA PVT1通过调节miR-486-3p/mapk14轴降低食管癌细胞化学敏感性的相关机制。方法:qRT-PCR检测永生化人食管上皮细胞系和食管癌细胞系中PVT1、miR-486-3p、mapk14的相对表达水平;生物信息学预测PVT1、miR-486-3p的靶向关系,并以荧光素酶报告实验验证靶向关系;构建PVT1、miR-486-3p、mapk14过表达和PVT1敲除耐顺铂食管癌细胞系Eca-109/DDP,DDP处理后,比较各组Eca-109/DDP中的半抑制浓度(IC50)、细胞存活率、细胞凋亡率,并检测细胞凋亡蛋白(Bcl-2、Bax)、耐药蛋白(MRP1、P-gp)表达情况。结果:PVT1、mapk14在食管癌细胞中高表达,miR-486-3p低表达(Pmapk14表达水平显著降低(Pmapk14后能够恢复上述表型。结论:PVT1可能通过靶向抑制miR-486-3p表达,促进mapk14表达诱导耐药蛋白上调表达,降低食管癌细胞的化学敏感性。

关键词：食管鳞状细胞癌 PVT1 miR-486-3p mapk14 顺铂敏感性

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mapk14在垂体泌乳素腺瘤中的作用及麦芽总生物碱颗粒剂的研制

MAPK14在垂体泌乳素腺瘤中的作用及麦芽总生物碱颗粒剂的研制

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作者：丁巧燕湖北中医药大学

学位级别：硕士

目的:垂体泌乳素腺瘤严重危害人体身心健康,目前临床治疗药物有限且副作用明显,急需探索其发病机制和新的治疗方法。基于本课题组的前期研究结果,本研究拟探索mapk14在泌乳素腺瘤中的作用和机制。并研制麦芽总生物碱颗粒剂。方法:运用... 详细信息

目的:垂体泌乳素腺瘤严重危害人体身心健康,目前临床治疗药物有限且副作用明显,急需探索其发病机制和新的治疗方法。基于本课题组的前期研究结果,本研究拟探索mapk14在泌乳素腺瘤中的作用和机制。并研制麦芽总生物碱颗粒剂。方法:运用组织免疫荧光检测法探索mapk14在人泌乳素腺瘤中的表达和定位;运用雌激素诱导和DRD2敲除方法分别制备泌乳素腺瘤的小鼠模型。研究mapk14基因在垂体泌乳素腺瘤中的作用;使用siRNA转染GH3细胞,研究敲低mapk14基因对GH3细胞产生PRL的影响;麦芽总生物碱颗粒剂的制备工艺研究。具体方法如下:(一)收集垂体泌乳素腺瘤患者和其他垂体瘤(PRL阴性)患者的垂体标本,制备成石蜡标本,用组织免疫荧光法检测mapk14在人泌乳素腺瘤中的表达和定位。随机选取4例人垂体泌乳素腺瘤石蜡切片标本作为泌乳素腺瘤组;4例其他垂体瘤石蜡切片标本作为对照组。将其切片标本用组织免疫荧光法标记mapk14和PRL蛋白,检测其表达情况和共定位现象。(二)建立雌激素诱导泌乳素腺瘤小鼠模型,研究mapk14基因敲除对泌乳素腺瘤的影响。所有小鼠分为3组:WT组;E2组;mapk14E2组。模型的制备方法为:将苯甲酸雌二醇注射液按每次20 mg/kg的剂量注射入小鼠腹腔,每4天进行一次,持续32天。每天观察模型动物的进食及活动状况。雌二醇注射32天后,采集小鼠血浆用ELISA法检测PRL的表达,取小鼠垂体组织称重后,每组随机选取3个提取总RNA,用Real-Time PCR法检测小鼠垂体中PRL基因的表达。另外每组3个提取其总蛋白,用Western blot法检测小鼠垂体中mapk14和PRL蛋白的表达。(三)小鼠敲除DRD2后制备泌乳素腺瘤模型,研究mapk14基因敲除对泌乳素腺瘤的影响。给予规范食物和水饲养的8月龄雌性DRD2小鼠垂体增生,泌乳素腺瘤形成,即为泌乳素腺瘤模型小鼠。所有小鼠分为3组:WT组;DRD2组;DRD2mapk14组。采集小鼠血浆用ELISA法检测PRL的表达,取小鼠垂体组织称重后,每组随机选取3个提取总RNA,用Real-Time PCR法检测小鼠垂体中PRL基因的表达。另外每组3个提取其总蛋白,用Western blot法检测小鼠垂体中mapk14和PRL蛋白的表达。(四)使用siRNA转染GH3细胞,研究mapk14基因敲低对GH3细胞产生PRL的影响。分组为:Blank组,NC组,荧光标记转染对照组,mapk14 siRNA1(30 nM,50 nM,100 nM),mapk14 siRNA2(30 nM,50 nM,100 nM),mapk14 siRNA3(30 nM,50 nM,100 nM),mapk14siRNA3(100 nM,200 nM,300 nM)。用Real-Time PCR法和Western blot法检测各组细胞中mapk14和PRL的表达。(五)用湿法制粒制备麦芽总生物碱颗粒剂。通过检测颗粒的成型率、堆密度、休止角和吸湿性,来筛选出最佳辅料配方。以成型率为指标,选择麦芽总生物碱与辅料的比例。以软材达到“手握成团,轻触即散”且颗粒大小均匀的制粒要求,选择最佳湿润剂。结果:(一)组织免疫荧光检测结果显示,人垂体泌乳素腺瘤标本中PRL和mapk14出现共定位现象。与对照组比较,人垂体泌乳素腺瘤组中PRL的表达显著增加(Pmapk14的表达也显著增加(Pmapk14小鼠垂体组织/小鼠体重(mg/g)的值显著降低(Pmapk14小鼠血浆中PRL蛋白的含量显著降低(Pmapk14小鼠垂体组织中PRL基因表达显著降低(Pmapk14小鼠血浆中PRL基因表达显著降低(Pmapk14小鼠垂体组织/小鼠体重(mg/g)的值显著降低(P<0.001)。ELISA检测结果

关键词： mapk14 泌乳素 DRD2 泌乳素腺瘤麦芽总生物碱颗粒

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miR-638慢病毒载体的构建及其对mapk14的靶向调控作用

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免疫学杂志 2014年第9期30卷 782-786页

作者：邢译文刘鑫周林林白静范维宁徐广贤宁夏医科大学检验学院银川750004 宁夏医科大学检验学院总医院医学实验中心银川750004

目的构建miR-638慢病毒过表达载体,探讨其对mapk14基因的靶向调控作用。方法分别构建pSicoR-miR-638及pMIR-Report-mapk14过表达载体,应用双荧光素酶报告基因活性、Western blot及实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法验证miR-638与mapk14的靶向... 详细信息

目的构建miR-638慢病毒过表达载体,探讨其对mapk14基因的靶向调控作用。方法分别构建pSicoR-miR-638及pMIR-Report-mapk14过表达载体,应用双荧光素酶报告基因活性、Western blot及实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法验证miR-638与mapk14的靶向调控关系。结果经PCR、酶切及测序结果证明成功构建了pSicoR-miR-638及pMIR-Reportmapk14重组质粒,并通过实验证实miR-638过表达明能显抑制mapk14的蛋白及mRNA表达(Pmapk14蛋白及mRNA的表达水平明显上调(Pmapk14-3’UTR的特异序列而直接抑制mapk14基因的表达。

关键词： microRNA miR-638 mapk14

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mapk14和CDC25B在肾透明细胞癌中作用机制的研究

MAPK14和CDC25B在肾透明细胞癌中作用机制的研究

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作者：刘俊龙中国医科大学

学位级别：硕士

目的:肾细胞癌的发病率在癌症中占第九位,是全球主要的公共卫生问题。肾癌的发生和转移机制极为复杂,不仅与基因突变有关,而且与肿瘤的抑制和激活途径的失衡有关。肾透明细胞癌是肾癌中最常见和最具侵袭性的亚型,约占所有病例的70%。手... 详细信息

目的:肾细胞癌的发病率在癌症中占第九位,是全球主要的公共卫生问题。肾癌的发生和转移机制极为复杂,不仅与基因突变有关,而且与肿瘤的抑制和激活途径的失衡有关。肾透明细胞癌是肾癌中最常见和最具侵袭性的亚型,约占所有病例的70%。手术仍是局部肾透明细胞癌患者的主要治疗方法。尽管近年来转移性肾透明细胞癌的靶向治疗取得了很大进展,但无进展生存率仍有待提高。因此,有必要识别肾透明细胞癌的有效生物标志物和新的治疗靶点,以改善患者的预后。mapk14基因在许多肿瘤中高表达,其在肾透明细胞癌中的生物学功能尚未阐明。本研究探讨了mapk14基因在肾透明细胞癌中的生物学功能以及对相关蛋白的影响,为探索新的治疗方法提供依据。研究方法:1、mapk14、P-mapk14和CDC25B在肾透明细胞癌与癌旁组织中的表达及相关性分析采用TCGA(https://***/about-cancer)数据库分析mapk14和CDC25B在72对肾透明细胞癌组织中的转录水平。通过Western Blot检测66对肾透明细胞癌组织和相匹配的癌旁组织中mapk14、P-mapk14和CDC25B的蛋白表达水平。2、分析mapk14、P-mapk14与CDC25B相互作用的机制采用qRT-PCR和Western Blot检测mapk14 siRNA和CDC25B siRNA的转染效率以及下游基因mRNA和蛋白的表达水平变化。采用免疫共沉淀实验检测P-mapk14是否与CDC25B蛋白相互结合。当过表达CDC25B时,通过Western Blot技术检测mapk14以及P-mapk14蛋白水平的变化。3、检测CDC25B过表达肾透明细胞癌细胞及对照组中mapk14下调后细胞功能变化用肾透明细胞癌细胞系ACHN和CAKI-1建立CDC25B过表达的细胞系,分别在过表达CDC25B基因的细胞及对照组中采用EdU实验检测mapk14下调后细胞增殖能力变化,采用Transwell实验检测mapk14下调后细胞迁移能力变化。4、观察稳定下调mapk14以及上调CDC25B后裸鼠体内肿瘤生长的变化应用裸鼠异种移植瘤实验,观察肾透明细胞癌ACHN中下调mapk14蛋白以及高表达CDC25B蛋白对肿瘤生长的影响。5、P-mapk14相关基因分析通过疾病网络开放资源数据库(http://***/)分析TCGA数据库中72对肾透明细胞癌和癌旁组织中可能磷酸化mapk14或者抑制P-mapk14去磷酸化的基因表达水平。结果:1、TCGA数据库转录水平分析显示mapk14在肾透明细胞癌和癌旁组织的表达没有显著性差异,而CDC25B的转录水平在癌组织中明显高于癌旁组织。Western Blot检测显示在肾透明细胞癌和癌旁组织中mapk14蛋白表达水平没有显著性差异,而肾透明细胞癌中P-mapk14蛋白水平显著高于癌旁组织。同样,肾透明细胞癌中CDC25B的蛋白水平显著高于癌旁组织。相关性分析结果显示P-mapk14和CDC25B蛋白水平显著相关。2、qRT-PCR和Western Blot检测显示mapk14 siRNA和CDC25B siRNA均可降低目的基因表达。mapk14基因下调后P-mapk14和CDC25B的蛋白表达显著减少,而CDC25B的下游基因CDC2的磷酸化蛋白表达水平增高。沉默CDC25B蛋白后CDC2的磷酸化蛋白水平也增高。免疫共沉淀结果显示Pmapk14能与CDC25B结合,CDC25B过表达不影响mapk14和P-mapk14的蛋白水平。3、EdU结果显示mapk14下调后细胞的增殖能显著下降,Transwell结果证实了细胞缺少mapk14蛋白后其迁移能力降低。但是在稳定过表达CDC25B的细胞系中下调mapk14后并没有使细胞的增殖和迁移能力显著降低。4、异种移植瘤实验表明mapk14下调后肿瘤的生长减慢,而过表达CDC25B能够促进肿瘤的生长。5、疾病网络的开放资源网站分析结果显示MAP2K3和MAP2K6可能参与mapk14的翻译后修饰,PKN1、PTPN7、DUSP1、DUSP4、DUSP7、DUSP10、PTPRR,以及PPM1D可以维持mapk14的磷酸化。结论:P-mapk14与CDC25B蛋白在肾透明细胞癌组织中高表达,Pmapk14能够与CDC25B蛋白在细胞内结合,并能维持其稳定性。mapk14和P-mapk14下调可以抑制肾透明细胞癌细胞的增殖和迁移能力,与CDC25B蛋白下调有关。

关键词： CDC25B 肾透明细胞癌 DNA损伤和修复 mapk14 P-mapk14

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鹅mapk14基因部分序列克隆及填饲对其mRNA丰度的影响

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中国畜牧杂志 2012年第23期48卷 6-10页

作者：何桦王浩瀚刘贺贺潘志雄王继文四川农业大学动物遗传育种研究所四川成都611130

为研究填饲对鹅丝裂原活化蛋白激酶14(mapk14)mRNA表达水平的影响,本实验克隆了鹅mapk14部分编码区序列,并用荧光定量PCR方法检测了填饲对四川白鹅和朗德鹅肝组织mapk14基因表达量的影响。结果表明:获得鹅mapk14基因cDNA 951 bp序列,可... 详细信息

为研究填饲对鹅丝裂原活化蛋白激酶14(mapk14)mRNA表达水平的影响,本实验克隆了鹅mapk14部分编码区序列,并用荧光定量PCR方法检测了填饲对四川白鹅和朗德鹅肝组织mapk14基因表达量的影响。结果表明:获得鹅mapk14基因cDNA 951 bp序列,可编码316个氨基酸残基。经分析,鹅mapk14部分核苷酸序列与原鸡mapk14基因的同源性为94.8%,对应的氨基酸同源性为99.7%;荧光定量PCR检测发现,无论在对照组还是填饲组,四川白鹅的mapk14表达量均高于朗德鹅,填饲能显著上调mapk14 mRNA在2个鹅品种中的表达丰度。结果提示,填饲能够引起鹅肝组织中mapk14表达丰度显著增加,且该影响存在显著的品种差异。

关键词：填饲 mapk14 克隆 mRNA表达鹅

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Circ-mapk14和circ-Klc1在心肌肥大中作用机制的初步探讨

Circ-Mapk14和circ-Klc1在心肌肥大中作用机制的初步探讨

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作者：开昆仑郑州大学

学位级别：硕士

背景和目的心肌肥大是心脏对多种病理性和生理性刺激的一种重要代偿反应,早期的心肌肥大被认为是对机体有益的代偿反应,但长期的心肌肥大则会逐渐发展为心力衰竭。科学家们已经揭示了心肌肥大的部分机制,如信号通路等,但其深入的机制还... 详细信息

背景和目的心肌肥大是心脏对多种病理性和生理性刺激的一种重要代偿反应,早期的心肌肥大被认为是对机体有益的代偿反应,但长期的心肌肥大则会逐渐发展为心力衰竭。科学家们已经揭示了心肌肥大的部分机制,如信号通路等,但其深入的机制还有待阐明。本课题致力于寻找更多调节心肌肥大的靶分子,以进一步阐明心肌肥大发生和发展的分子机制,为心肌肥大的临床诊断和治疗提供理论基础。环状RNA（circular RNA,circRNA）是一类广泛存在于各种生物体中的单链闭环RNA,由前体mRNA反向剪接形成,不含5’帽子、3’polyA尾结构,以共价键连接形成环状。因此,circRNA比线性mRNA更加稳定,不易被RNase R降解,是近年来RNA领域研究的热点。CircRNA的主要功能包括:通过竞争性剪接来影响线性mRNA的转录和剪接;作为miRNA分子海绵;与蛋白相互作用;翻译出功能多肽等。研究表明,在一些心血管疾病的发生和发展中circRNA起着重要的作用,但目前的研究主要集中在circRNA作为miRNA的分子海绵以及与蛋白相互作用来调节下游靶基因,而在circRNA编码蛋白方面的研究很少,仅局限在肿瘤的侵袭和转移中。基于此,我们推测:心肌肥大相关circRNA编码的蛋白也能参与到心肌肥大的发生中,进而调控其发生和发展,因此我们展开了对本课题的研究。本研究目的是从分子水平探究心肌肥大相关circRNA编码的蛋白在心肌肥大发生和发展过程中的作用机制,以期为临床治疗心肌肥大提供新的治疗靶点,为开发出理想的治疗心肌肥大药物提供理论依据。方法1.筛选出在心肌肥大中差异表达的circRNA根据我们课题组先前circRNA高通量测序结果,挑选出21个在盐酸异丙肾上腺素（ISO）诱导的小鼠心肌肥大中差异表达的circRNA。2.对上述circRNA进行验证根据circRNA高通量测序结果,在反向剪接位点附近设计circRNA的divergent primer。通过Real-time PCR实验对circRNA进行验证,并对产物进行Sanger测序,同时对比其在ISO处理组和对照组中的表达趋势是否与circRNA高通量测序结果一致。然后通过RNase R消化实验和通过divergent、convergent primer对基因组DNA以及cDNA进行PCR扩增,进一步对circRNA进行验证。3.获取circRNA的全长通过在剪接位点附近设计两对PCR引物,其扩增片段两端相互重叠,将两次PCR产物进行Sanger测序并与母本基因序列比对,得到circRNA的全长。4.探讨circRNA对心肌肥大的影响根据circRNA的母基因与心肌肥大的关系挑选出一组circRNA进行功能验证。构建circRNA的过表达载体,并转染到大鼠原代心肌细胞中,同时用ISO处理原代心肌细胞作为阳性对照,通过F-actin染色观察心肌细胞大小的变化;通过Real-time PCR检测心肌肥大标志基因ANF、BNP的表达;通过Real-time PCR和Western-blotting检测心脏重要转录因子GATA4的表达。5.探索circRNA影响心肌肥大的分子机制利用生物信息学软件circAtlas对与circRNA相互结合的miRNA和蛋白质进行预测,通过RNA pull down或RNA结合蛋白免疫沉淀（RIP）实验来验证其是否与circRNA相互作用。6.验证circRNA的编码能力用生物信息学软件ORF Finder对circRNA全长进行分析,筛选出具有跨剪接位点开放可阅读框（ORF）的circRNA,通过构建含3×flag标签的过表达载体来验证其ORF的活性,筛选出有活性ORF的circRNA进行后续实验。7.探究circRNA编码的蛋白与心肌肥大重要调控因子GATA4的结合通过免疫共沉淀（Co-IP）实验来验证circRNA编码的蛋白是否与转录因子GATA4结合。结果1.在小鼠心室组织中挑选的21个circRNA中有13个被证实存在,与对照组相比,ISO 处理组中 circ-Atp2c1、circ-Dcun1d2、circ-14346、circ-Rmdn2、circ-Itpr2、circ-Klc1的表达上调,而circ-mapk14的表达下调,这与高通量测序结果中的趋势一致。同时以上7个circRNA均耐受RNaseR的消化;divergent primer只能在cDNA中扩增出目的产物,在基因组DNA中不能扩增出目的产物;Sanger测序显示上游外显子的5’端与下游外显子的3’端以3’,5’-磷酸二酯键共价连接形成环状。*** 测序得到了 circ-Atp2c1、circ-Dcun1d2、circ-14346、circ-Rmdn2、circ-mapk14、circ-

关键词： circRNA 心肌肥大 circRNA 编码 mapk14 GATA4

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miR-638靶向抑制mapk14表达调控BCG与巨噬细胞免疫应答反应

miR-638靶向抑制MAPK14表达调控BCG与巨噬细胞免疫应答反应

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作者：邢译文宁夏医科大学

学位级别：硕士

目的研究micro RNA-638通过调节mapk14的表达,参与BCG引起的炎症反应的调控机制。方法1.通过mi Randa、Targetscan和Pic Tar等靶基因预测软件对micro RNA-638(mi R-638)可能的靶基因进行生物信息学预测。预测结果显示,与固有免疫应答关... 详细信息

目的研究micro RNA-638通过调节mapk14的表达,参与BCG引起的炎症反应的调控机制。方法1.通过mi Randa、Targetscan和Pic Tar等靶基因预测软件对micro RNA-638(mi R-638)可能的靶基因进行生物信息学预测。预测结果显示,与固有免疫应答关系密切的mapk14是理想的研究靶基因,本课题拟将mapk14的3’UTR构建到p MIR-Report表达载体中,同时应用脂质体转染法将过表达mi R-638及抑制mi R-638表达的质粒分别与p MIR-Report-mapk14重组质粒共转染到293T细胞中,应用双荧光素酶报告基因系统,以海肾荧光素酶作为参照,进行荧光素酶检测,以此验证mi R-638与mapk14之间的靶向作用关系。2.根据最新mi RBase数据库人源mi R-638(mi RBase NO:MI0003653)的基因序列,化学合成含有mi R-638成熟序列的短发夹RNA(small hairpin RNA,sh RNA),并构建入穿梭载体p Sico R质粒中,经双酶切及测序鉴定,利用脂质体转染法将鉴定为阳性的重组质粒与p CMV-VSV-G、p CMV-d R8.91两个质粒共转染到293T细胞中,包装过表达mi R-638的慢病毒,并测定病毒滴度;另外合成mi R-638 inhibitors(23 nt 2’-甲氧修饰的RNA寡核酸,能有效抑制成熟mi R-638的表达)。3.将包装成功的LV-mi R-638慢病毒及mi R-638 inhibitors分别侵染THP-1细胞诱导分化成的巨噬细胞,24h后再应用BCG刺激细胞12h,收集细胞及细胞上清液,提取micro RNAs、m RNA和全蛋白,应用Real-Time PCR检测mi R-638表达水平及mapk14的m RNA的表达水平,应用Western Blot检测mapk14蛋白的表达水平。应用ELISA检测细胞上清液的细胞因子TNF-α、IL-6和IL-12的蛋白表达水平。结果1.通过生物信息学软件预测,最终我们选定了在p38mapk信号通路中发挥重要作用的mapk14作为研究的靶基因。通过双荧光素酶报告基因系统证实了mi R-638可以靶向结合mapk14 3’UTR的作用位点并抑制其表达;转染了p Sico R-mi R-638过表达载体组,mapk14的相对荧光素酶活性与突变体的活性相比下降约5.5倍(Pmapk14的荧光素酶活性与突变体的活性相比有所升高,与p Sico R-mi R-638过表达载体组相比升高约6.6倍(Pmapk14 m RNA Real-Time PCR结果显示:过表达mi R-638后mapk14 m RNA的表达水平较正常对照组相比下调50.1倍(pmapk14 m RNA的表达水平较正常对照组相比有所上调。Western blot分析结果显示:p Sico R-mi R-638重组质粒转染细胞后,mapk14蛋白表达量较正常组明显降低,抑制mi R-638表达后mapk14蛋白质表达量增加,而BCG刺激三组细胞后mapk14的蛋白表达量都有所增加。通过ELISA检测TNF-α、IL-6、IL-12的表达,来观察mi R-638对mapk14的下游细胞因子的影响,评价mi R-638对p38mapk信号通路炎性反应的调控。结果显示,转染p Sico R/mi R-638后巨噬细胞TNF-α、IL-6、IL-12的蛋白表达显著性降低,而转染mi R-638 inhibitors后巨噬细胞中TNF-α、IL-6、IL-12的蛋白表达显著性升高。这些结果表明mi R-638可以通过靶向作用mapk14的表达,影响下游细胞因子的表达,在p38mapk信号通路中起到负向调控作用。结论1.成功包装了高

关键词： microRNA-638 慢病毒 mapk14 巨噬细胞 Mycobacterium bovis BCG

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