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巴斯德毕赤酵母HOT在mapk/hog信号通路及甲醇代谢中的调控机理

巴斯德毕赤酵母HOT在MAPK/HOG信号通路及甲醇代谢中的调控机理

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作者：王荣斌江南大学

学位级别：硕士

嗜甲醇巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris,***)是使用最为广泛的真核表达系统之一。其高效的醇氧化酶1启动子(Promoter of alcohol oxidase 1,P)可被甲醇强烈诱导但同时也被甘油等碳源强烈抑制,而甲醇作为一种化工原料,其大规模应用具有... 详细信息

嗜甲醇巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris,***)是使用最为广泛的真核表达系统之一。其高效的醇氧化酶1启动子(Promoter of alcohol oxidase 1,P)可被甲醇强烈诱导但同时也被甘油等碳源强烈抑制,而甲醇作为一种化工原料,其大规模应用具有易燃易爆、碳源利用率低等缺陷。与甲醇相比,甘油等碳源具有易于代谢,还原力强等明显优势,因此构建甘油去阻遏型***表达系统具有很高的应用价值,但需要从分子层面理解甘油抑制P机制。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae,***)中,HOT1是mapk/hog信号通路中重要的转录因子,直接参与对多种甘油相关基因的调控,因此推测其在毕赤酵母中参与调控甲醇代谢。然而毕赤酵母mapk/hog信号通路的调控机制尚不清楚,HOT蛋白在mapk/hog信号通路及甲醇代谢中的调控机理需要深入研究。基于此,本文鉴定了***中高渗诱导转录因子HOT1和HOT2,并对其发挥作用的分子机制以及对甲醇代谢的调控进行了研究,有以下研究成果:(1)首先鉴定了***中HOT蛋白。以***数据库为基础,寻找到了两个与*** HOT1序列同源性较高的序列,并命名为HOT1和HOT2;实验证明,HOT1和HOT2缺失都会降低细胞在高渗下的生长能力,它们在*** mapk/hog信号通路中起到重要作用。(2)检测了上游转录因子hog1对HOT1、HOT2的调控。qPCR实验表明,***中hog1参与对HOT1基因转录水平的调控,同时酵母双杂实验结果表明hog1与HOT1可在蛋白水平发生相互作用;而HOT2无论在转录水平还是蛋白水平均不受hog1的调控。(3)HOT1和HOT2均定位于细胞核。推测HOT1和HOT2可能是通过改变其亚细胞定位从而发挥调控作用,因此将HOT1、HOT2与EGFP基因融合,通过细胞含有荧光的区域判断其不同条件下在细胞中的定位,结果表明:HOT1和HOT2在正常渗透压和高渗条件下均定位于细胞核中,同时hog1基因的缺失不会改变HOT1和HOT2的亚细胞定位,HOT1和HOT2功能的发挥并不依赖于其在细胞内的定位。(4)之后研究了HOT1和HOT2对下游基因的调控。与***不同,***中GT1和GPD1的表达不受HOT1、HOT2的调控;将***的P、P导入***,发现HOT1、HOT2也不能诱导它们的表达,说明***中HOT1和HOT2的功能已经发生变化。同时,HOT1不再参与对下游高渗响应基因DOG2、DAK1、HXT1、CTT1和HSP12基因转录水平的调控;HOT2参与对HXT1的调控,但不参与对其他上述基因的调控。(5)最后研究了HOT1和HOT2基因的缺失对甲醇代谢的影响。结果表明,HOT1和HOT2的缺失均可促进甲醇代谢,其中HOT2的缺失提高了菌株甘油中去阻遏的能力。

关键词：巴斯德毕赤酵母甲醇代谢调控 mapk/hog信号通路 HOT1/HOT2 高渗

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