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maldi-tof/tof多电荷蛋白解离研究二硫键重构

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MALDI-TOF/TOF多电荷蛋白解离研究二硫键重构

日本电子JMS-S3000的开发——具有螺旋状离子轨道的maldi-tof/tof-MS

第三届全国质谱分析学术报告会

作者：占铃鹏刘钰熊彩桥聂宗秀中国科学院化学研究所活体分析化学院重点实验室

二硫键是一种重要的蛋白质翻译后修饰,对于蛋白结构和功能具有重要影响。目前解析二硫键连接位置的方法主要包括自下而上（bottom-up）和自上而下（top-down）两种。相比于bottom-up而言,top-down方法可有效避免二硫键位置信息的丢失,... 详细信息

二硫键是一种重要的蛋白质翻译后修饰,对于蛋白结构和功能具有重要影响。目前解析二硫键连接位置的方法主要包括自下而上（bottom-up）和自上而下（top-down）两种。相比于bottom-up而言,top-down方法可有效避免二硫键位置信息的丢失,越来越多地被应用于二硫键的研究中1,2。在本研究中,我们采用maldi-tof/tof对乳球蛋白中的二硫键重构现象进行了研究。为了实现乳球蛋白母离子的有效碎裂,我们以2-NPG为基质3,使乳球蛋白在maldi过程中产生多电荷离子（图1b）。随后我们选择其两电荷离子进行tof/tof分析,得到了二硫键断裂的特征性三重碎裂峰,分别对应y,y-S,y+S离子（图1c）。随后,我们将乳球蛋白在不同温度下加热,观察其二硫键的重排过程。发现当温度到达75oC,二硫键的特征碎片（y-S和y+S）有个陡降（图1d）。这些二硫键断裂的峰都在C121及C160之间（y25,y32,y33）,因而推断连接C160的二硫键减少了,亦即发生了二硫键的重排4。通过天然质谱（native MS）分析加热前后的乳球蛋白发现,电荷分布没有明显变化,说明二硫键的重构未明显影响该蛋白的高级结构。文中所述的方法还可用于其他较大蛋白质的top-down分析,某些含二硫键的蛋白也可以得到较好的解析。

关键词： maldi-tof/tof 多电荷蛋白离子二硫键乳球蛋白

来源： cnki会议评论

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现代科学仪器 2011年第5期28卷 178-181页

作者：李群佐藤贵弥捷欧路(北京)科贸有限公司日本电子株式会社质谱事业部

日本电子开发了一种具有螺旋状离子轨道的新型离子光学系统,它超越了现在市场上多数采用的反射式离子光学系统的基本性能;而且还开发了maldi-tof/tof-MS(型号为JMS-S3000),在第1个tof MS中采用螺旋状轨道离子光学系统,第2个tof MS中采... 详细信息

日本电子开发了一种具有螺旋状离子轨道的新型离子光学系统,它超越了现在市场上多数采用的反射式离子光学系统的基本性能;而且还开发了maldi-tof/tof-MS(型号为JMS-S3000),在第1个tof MS中采用螺旋状轨道离子光学系统,第2个tof MS中采用反射式离子光学系统,从而实现了以前的质谱仪器达不到的高质量分辨率和高母离子选择性。JMS-S3000质谱图显示:在m/z2093质量分辨率不仅超过60,000(FWHM),而且在很宽的质量范围也能达到高质量分辨率。JMS-S3000具有高母离子选择性,只选择母离子的单一同位素离子,所以各个断裂途径的峰在子离子谱图上能够清晰地被看到其对应的信号峰,使得子离子谱图的解析变的更加简单明确。

关键词：螺旋轨道型离子光学系统反射式离子光学系统母离子子离子选择性多重反射型多重盘旋型 maldi-tof/tof MS

Two-dimensional gel electrophoresis-based analysis provides global insights into the cotton ovule and fiber proteomes

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Science China(Life Sciences) 2016年第2期59卷 154-163页

作者： Xiang Jin Limin Wang Liping He Weiqiang Feng Xuchu Wang Institute of Tropical Biosciences and Biotechnology Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences The State Key Laboratory of Protein and Plant Gene Research College of Life Sciences Peking University College of Horticulture and Landscape Hainan University

Proteomic analysis of upland cotton was performed to profile the global detectable proteomes of ovules and fibers using two-dimensional electrophoresis(2DE).A total of 1,203 independent protein spots were collected from representative 2DE gels,which were digested with trypsin and identified by matrix-assisted laser desorption and ionization-time-offlight/time-of-flight(maldi-tof/tof)mass *** mass spectrometry or tandem mass spectrometry(MS or MS/MS)data were then searched against a local database constructed from Gossypium hirsutum genome sequences,resulting in successful identification of 975 protein spots(411 for ovules and 564 for fibers).Functional annotation analysis of the 975identified proteins revealed that ovule-specific proteins were mainly enriched in functions related to fatty acid elongation,sulfur amino acid metabolism and post-replication repair,while fiber-specific proteins were enriched in functions related to root hair elongation,galactose metabolism and D-xylose metabolic *** annotation analysis of the most abundant protein spots showed that 28.96%of the total proteins in the ovule were mainly located in the Golgi apparatus,endoplasmic reticulum,mitochondrion and ribosome,whereas in fibers,27.02%of the total proteins were located in the cytoskeleton,nuclear envelope and cell *** real-time polymerase chain reaction(q RT-PCR)analyses of the ovule-specific protein spots P61,P93 and P198 and fiber-specific protein spots 230,477 and 511 were performed to validate the proteomics ***-protein interaction network analyses revealed very different network cluster patterns between ovules and *** work provides the largest protein identification dataset of 2DE-detectable proteins in cotton ovules and fibers and indicates potentially important roles of tissue-specific proteins,thus providing insights into the cotton ovule and fiber proteomes on a global scale.

关键词： cotton 2DE maldi-tof/tof GO enrichment protein-protein interaction networks

Proteome Analysis in the Discovery of Serological Pregnancy Biomarkers in Damascus Goats

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Journal of Agricultural Science and Technology(A) 2013年第6期3卷 465-474页

作者： Ibrahim Noor Syaheera Taib Mohamad Aziz Shuib Adawiyah Suriza Department of Animal Science Faculty Agriculture and Biotechnology University of Sultan Zainal Abidin Kuala Terengganu21300 Malaysia Institute of Biological Sciences Faculty of Science University of Malaya Kuala Lumpur 50603 Malaysia Centre for Proteomics Research Faculty of Medicine University of Malaya Kuala Lumpur 50603 Malaysia

Early detection of pregnancy is advantageous to breeders. However, tools that were used in the early pregnancy detection are expensive, laboratory-based and not efficient and applicable enough in the field to farmers. Thus, there is a need to find a biomarker which not only can detect pregnancy but also could be applied to the livestock on the field. Proteomic approach was used in this study as to search for early pregnancy biomarker. When goat sera at day 14 of gestation were resolved by using two dimensional gel electrophoresis, five differentially expressed proteins were detected. Four of the proteins were identified as albumin precursors, immunoglobulin lambda light chain and zinc-alpha-2-glycoprotein. Pregnancy associated glycoprotein-1 was detected by using liquid chromatography mass spectrometry and the protein was validated by immunoblotting. These proteins have potential to be used as a biomarker for early pregnancy detection, however, more extensive analysis are needed to validate its possibility.

关键词： Damascus serum PAG pregnancy biomarker proteomic maldi-tof/tof LC-MS/MS.

不同饲料饲养的近暗散白蚁工蚁肠道中差异蛋白分析

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昆虫学报 2022年第8期65卷 986-998页

作者：苏丽娟赵鹏飞杜运良关宇梁郭瑞瑶阴正兴宋安东河南农业大学生命科学学院郑州450002 大坝(河南)工程技术有限公司郑州450018 河南牧业经济学院郑州450046

【目的】本研究旨在通过比较不同木质纤维素含量的饲料对近暗散白蚁Reticulitermes perilucifugus工蚁前中肠和后肠内容物蛋白的组成和表达差异,为揭示白蚁的营养消化吸收机理提供蛋白水平上的依据。【方法】用木质纤维素含量不同的3种... 详细信息

【目的】本研究旨在通过比较不同木质纤维素含量的饲料对近暗散白蚁Reticulitermes perilucifugus工蚁前中肠和后肠内容物蛋白的组成和表达差异,为揭示白蚁的营养消化吸收机理提供蛋白水平上的依据。【方法】用木质纤维素含量不同的3种饲料(松木、秸秆和滤纸)饲养近暗散白蚁工蚁,然后用双向电泳分析肠道不同部位的内容物蛋白,并对差异蛋白进行maldi-tof/MS测序及生物信息学分析。【结果】双向电泳结果发现,同一饲料饲养的近暗散白蚁工蚁前中肠可辨蛋白点数明显多于后肠;不同饲料饲喂的工蚁前中肠和后肠可辨蛋白点数依次是松木饲养的>滤纸饲养的>秸秆饲养的。通过对115个蛋白点的测序分析表明,不同饲料饲喂的工蚁前中肠和后肠中的主要差异蛋白为具有催化活性的蛋白质,包括与氨基酸代谢、丙酮酸代谢、碳代谢、氮代谢、TCA循环、糖酵解、糖异生和纤维素降解等相关的酶,以及参与细胞组成和信号传导的蛋白。【结论】木质纤维素含量不同的饲料饲养的近暗散白蚁工蚁肠道中的差异蛋白主要为具有催化活性的蛋白、细胞组成蛋白和信号传导蛋白,表明不同的饲料影响近暗散白蚁的肠道蛋白组成。这些结果为揭示白蚁对木质纤维素的降解机理提供了参考。

关键词：近暗散白蚁木质纤维素双向电泳肠道内容物 maldi-tof/tof

EGCG诱导人肝癌SMMC-7721细胞早期凋亡及其凋亡相关蛋白变化的研究

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EGCG诱导人肝癌SMMC-7721细胞早期凋亡及其凋亡相关蛋白变化的研究

作者：李刚广西医科大学

学位级别：硕士

原发性肝癌(Primary hepatic carcinoma,PHC)是世界流行最广的恶性肿瘤之一,其在所有癌症中恶性程度高,治疗最困难,恶性发展速度最快,生存时间最短。2007年全世界的肝癌死亡例数为680 000,在全球肿瘤死因中位列第三。而我国由于肝炎和... 详细信息

原发性肝癌(Primary hepatic carcinoma,PHC)是世界流行最广的恶性肿瘤之一,其在所有癌症中恶性程度高,治疗最困难,恶性发展速度最快,生存时间最短。2007年全世界的肝癌死亡例数为680 000,在全球肿瘤死因中位列第三。而我国由于肝炎和肝炎转肝硬化的病人众多,致使肝癌在我国的发病率和死亡率均高于世界平均水平。我国每年死于肝癌人数占全世界肝癌死亡人数的55%以上,目前尚缺乏有效的治疗药物。因此为降低其发病率和死亡率,诸多学者长期致力于防治肝癌的研究。细胞凋亡比例明显失调是肿瘤发生发展中的重要因素,如能诱导肿瘤细胞凋亡,使其凋亡的比例增加,则可能遏制肿瘤的发生发展。表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)是绿茶多酚提取物儿茶素(catechin)的主要成分,具有抑制肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡的作用。但是较高浓度的EGCG可直接导致细胞坏死,所以及早发现细胞的早期凋亡,控制EGCG的剂量,是减少药物对细胞损伤的最有效的方法。多数有关EGCG诱导肿瘤细胞凋亡的研究,是依据流式细胞术(FCM)的凋亡细胞峰(亚G1细胞峰)来做出评价的。然而,亚G1细胞群的出现并非是凋亡细胞的特异变化。因此,本研究建立了一种检测细胞早期凋亡的新方法—PSAB-VA∕EL法,来检测EGCG诱导人肝癌SMMC-7721细胞早期凋亡的发生。同时,运用SELDI-tof-MS和maldi-tof/tof蛋白质谱技术检测与EGCG诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡相关的关键蛋白,探讨EGCG诱导人肝癌细胞早期凋亡的可能机制。第一章PSAB-VA∕EL法检测细胞早期凋亡方法的建立目的:建立一种经济实用且特异性高的细胞早期凋亡检测新方法,并与常用的Annexin V-FITC/PI法比较。方法:1、以不同质量浓度的EGCG作用Jurkat细胞,采用Annexin V-FITC/PI法检测Jurkat细胞凋亡率,并以此作为细胞凋亡模型;2、尝试用不同的标记有荧光染料的PSAB抗体和核酸荧光染料来检测此细胞凋亡模型。结果:1、经Annexin V-FITC/PI法检测,Jurkat细胞随着EGCG浓度的增加,正常细胞比例不断下降,而晚期凋亡细胞的百分比明显升高,同时早期凋亡细胞保持在10%左右;2、对各种标记有荧光染料的PSAB抗体和核酸荧光染料比较后,发现PSAB- VA和EL搭配使用,能较好地检测细胞凋亡。结论:1、PSAB-VA∕EL法和Annexin V-FITC/PI法在检测细胞凋亡各个阶段的百分比时,其结果的变化趋势一致;2、PSAB-VA∕EL法可能是一种比较灵敏的细胞早期凋亡检测方法。第二章EGCG诱导人肝癌SMMC-7721细胞早期凋亡目的:探讨表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)诱导人肝癌SMMC-7721细胞早期凋亡的变化规律。方法:1、通过MTT法初步筛选EGCG诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡的作用浓度;2、利用PSAB-VA∕EL法(第一章所述),通过流式细胞仪检测EGCG对SMMC-7721细胞增殖的抑制作用和早期凋亡的诱导效应。结果:EGCG诱导人肝癌SMMC-7721细胞早期凋亡的最佳作用剂量是100mg/L,早期凋亡率达48.16%。随着EGCG浓度增加(125～175mg/L),早期凋亡率明显下降,而晚期凋亡细胞的百分比明显升高。结论:EGCG有明显的诱导人肝癌SMMC-7721细胞早期凋亡的作用,且呈剂量依赖性,小剂量起诱导凋亡作用,而大剂量则对细胞株具有杀伤作用,直接导致细胞坏死。第三章EGCG诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡后的相关蛋白变化及鉴定研究目的:利用蛋白质谱技术检测与EGCG诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡相关的关键蛋白,探讨EGCG诱导人肝癌细胞早期凋亡的可能机制。方法:1、运用SELDI-tof-MS技术筛选人肝癌血清和人肝癌SMMC-7721细胞裂解液中共同存在的蛋白;2、运用SELDI-tof-MS技术检测EGCG诱导SMMC-7721细胞凋亡后的细胞裂解液中存在的蛋白;3、检测在肝癌血清、SMMC-7721细胞裂解液以及EGCG作用后的SMMC-7721细胞裂解液中,共有的关键蛋白;4、运用maldi-tof/tof质谱技术平台,并结合iTRAQ蛋白质定量试剂的使用,对上述关键蛋白标志物进行鉴定。结果:1、人肝癌血清和人肝癌SMMC-7721细胞裂解液中共同存在的蛋白有23个;2、SMMC-7721细胞裂解液与EGCG诱导后的SMMC

关键词： EGCG 人肝癌SMMC-7721细胞 PSAB-VA∕EL法细胞早期凋亡 SELDI-tof-MS maldi-tof/tof

茶树雌蕊自交和杂交的差异蛋白质组学初步研究

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茶树雌蕊自交和杂交的差异蛋白质组学初步研究

作者：任燕南京农业大学

学位级别：硕士

茶树属山茶科山茶属,为多年生异花授粉植物,茶树结实率低,自花授粉基本不育,表现出自交不亲和性。本研究以茶树为研究材料,在蛋白质水平上探讨了茶树的自交不亲和性,实验内容主要包括茶树花雌蕊总蛋白双向电泳体系的建立,茶树自交和杂... 详细信息

茶树属山茶科山茶属,为多年生异花授粉植物,茶树结实率低,自花授粉基本不育,表现出自交不亲和性。本研究以茶树为研究材料,在蛋白质水平上探讨了茶树的自交不亲和性,实验内容主要包括茶树花雌蕊总蛋白双向电泳体系的建立,茶树自交和杂交后蛋白质表达差异的分析,以及茶树自交后不同时间蛋白质表达差异分析。该研究的主要结果如下：1.本实验首次建立了茶树雌蕊蛋白质双向电泳技术体系。以TCA/丙酮-clean up kit法提取总蛋白,用17 cm pH5-8的IPG胶条,使用浓度为13%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶,采用考马斯亮蓝R250染色,可以获得清晰地、分辨率高、重复性好的双向电泳图谱,能够检测到约1200个蛋白点,图谱质量最佳,这些蛋白主要分布在pH 5-7,分子量14 kD-117 kD范围内,可以满足茶树花的雌蕊的蛋白组学分析和研究。2.以授粉前雌蕊为对照,对茶树自交和杂交授粉后24 h、48 h、72 h的雌蕊蛋白质进行差异蛋白质分析。PDQuest软件分析双向电泳图谱表明：授粉后24 h自交授粉和杂交授粉之间存在30个差异蛋白质点,48 h共有19个差异蛋白质点,72 h共有14个差异蛋白点。63个差异表达蛋白质点经质谱和数据库检索成功鉴定出59个蛋白点。这些蛋白质涉及的功能包括蛋白质合成,胁迫应答,细胞骨架,代谢,能量代谢,贮藏蛋白,蛋白命运,转运,核糖体装配和未分类蛋白。自交授粉后抗氧化物酶APX,sHSP, TCTP在授粉后24 h和48 h表达量大于杂交授粉;蛋白质合成相关的蛋白表达量在48 h内表达量高于杂交授粉,在72 h时差异不显著,26S蛋白酶体调节亚基仅在72 h时被检测到表达量低于杂交授粉;细胞骨架蛋白和贮藏蛋白在自交授粉后的雌蕊中表达量均比杂交处理高;能量代谢相关蛋白在自交授粉后48 h内表达量较杂交授粉增加而在72 h后差异不显著,咖啡因合成酶和能量代谢相关的酶的表达量先增加然后大量降低。3.对茶树自交授粉前和自交后24 h、48 h、72 h的雌蕊蛋白表达变化进行了研究,成功鉴定得到17个差异表达蛋白点。这些差异表达蛋白按功能可以分为八类,分别是胁迫应答,代谢,信号转导,细胞骨架,贮藏蛋白,蛋白命运,转运和未分类蛋白。其中与胁迫应答有关的蛋白最多,有5个;其次是代谢相关蛋白点4个和蛋白命运相关蛋白点3个;肽酰脯氨酰顺反异构酶,40S核糖体蛋白S12, GTP结合蛋白Ran/TC4表达量增加最大;参与调节细胞微丝结构的抑制蛋白的表达量在72 h急剧增加。

关键词：茶树雌蕊自交不亲和双向凝胶电泳 maldi-tof/tof 蛋白质

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酿酒酵母耐受D-柠檬烯胁迫的蛋白组学分析

酿酒酵母耐受D-柠檬烯胁迫的蛋白组学分析

作者：胡菲菲江南大学

学位级别：硕士

D-柠檬烯是种常见单萜，它具有萜类典型的分子结构，而且涉及到的代谢途径简单，因此在科研领域中受到广泛研究。D-柠檬烯的芳香气味及天然抑菌性，在食品防腐、农药开发等多方面具有应用价值。然而，D-柠檬烯的抑菌性在些实际应用中却... 详细信息

D-柠檬烯是种常见单萜，它具有萜类典型的分子结构，而且涉及到的代谢途径简单，因此在科研领域中受到广泛研究。D-柠檬烯的芳香气味及天然抑菌性，在食品防腐、农药开发等多方面具有应用价值。然而，D-柠檬烯的抑菌性在些实际应用中却成为限制因素：如利用微生物生产D-柠檬烯时，D-柠檬烯对工程菌的毒害会严重影响其产量;利用柑橘废弃物发酵生产乙醇时，发酵前去除柠檬烯的前处理过程，既增加了生产成本又降低了生产效率。因此，提高微生物对D-柠檬烯耐受性的研究具有重要意义，而此研究的基础是了解微生物对D-柠檬烯的耐受机制。 Saccharomyces cerevisiae是目前研究较为透彻的真核模式菌株，作为工程菌可用于合成多种天然产物。本文以S. cerevisiae ***2为对象，研究了D-柠檬烯胁迫对***生理活动的影响，以期提高S. cerevisiae对D-柠檬烯的耐受性。 ATP结合盒转运蛋白（ATP-binding cassette transporters，ABC转运蛋白）能够对多种物质进行转运，并排除相关生物毒素，起到了保护细胞的作用。S. cerevisiae细胞膜上的ABC转运蛋白Yor1p、Set6p、Pdr12p、Pdr5p、Snq2p、Aus1p、Pdr15p、Pdr11p及Pdr10p等是细胞抵御外界毒素的第道防线，能够识别并转运多种物质，包括很多萜类及D-柠檬烯类似物。为了研究D-柠檬烯对S. cerevisiae ***2的影响机制，本文首先通过分析不同浓度D-柠檬烯对S. cerevisiae生长情况的影响，得到D-柠檬烯对S. ***2的致死浓度。同时，结合葡萄糖的消耗情况，比较了不同浓度D-柠檬烯胁迫下的细胞得率，得到最适D-柠檬烯胁迫浓度为85mg/L。利用定量PCR技术分析了*** ***2在85mg/L D-柠檬烯的胁迫下，以上9个细胞膜ABC转运蛋白基因及2个关键调控蛋白（Pdr1p、Pdr3p）基因在转录水平上的变化。定量PCR实验结果表明，只有PDR5、PDR15及YOR1经D-柠檬烯胁迫后表达量上调。将这些基因分别在*** ***2中过量表达，比较过量表达ABC转运蛋白基因对D-柠檬烯耐受性的影响。结果表明，ABC转运蛋白对提高S. cerevisiae ***2的D-柠檬烯耐受性无明显帮助。为了进步阐明S. cerevisiae耐受D-柠檬烯的生理机制，应用基于二维电泳和maldi-tof/tof的蛋白质组学技术，分析S. cerevisiae ***2在85mg/L D-柠檬烯胁迫2h前后蛋白组的变化情况。在蛋白图谱分析的基础上，利用质谱技术，鉴定得到74个差异点，对应56种不同蛋白。对这56种不同蛋白进行GO （Gene Ontology）聚类分析，得知D-柠檬烯可影响S. cerevisiae细胞胁迫响应、糖类代谢呼吸作用、氨基酸及脂类等小分子代谢、细胞结构、核酸代谢及蛋白质代谢等生物过程。对这些生物过程进步分析，得出D-柠檬烯对S. cerevisiae影响的三个重要的推论：（1） S. cerevisiae ***2在D-柠檬烯胁迫下，对能量需求增加，出现葡萄糖饥饿的假象;（2） D-柠檬烯胁迫下，S. cerevisiae细胞中具有DNA修复功能的Rpt4p及调控细胞增殖分裂功能的Cpr1p下调，从而直接导致细胞增殖受到抑制;（3） D-柠檬烯直接破坏S. cerevisiae细胞膜结构，导致细胞膜脂筏受损。其中葡萄糖饥饿的假象为S. cerevisiae为应对D-柠檬烯胁迫，自身作出的调节反映。后两者为D-柠檬烯毒害S. cerevisiae细胞的重要机制。

关键词： D-柠檬烯胁迫定量PCR 二维电泳 maldi-tof/tof

Caveolin-1基因敲除对化学诱导肝癌小鼠体内核心岩藻糖基化的影响

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Caveolin-1基因敲除对化学诱导肝癌小鼠体内核心岩藻糖基化的影响

作者：张宏硕大连医科大学

学位级别：硕士

背景:窖蛋白-1(Caveolin-1,Cav-1)是胞膜窖的主要结构和功能成分,参与调控胆固醇转运、细胞内吞、信号转导以及肿瘤转移等重要生物学过程。Caveolin-1在癌症发生发展过程中的作用具有组织特异性,发挥抑癌作用还是促癌作用也一直存在争... 详细信息

背景:窖蛋白-1(Caveolin-1,Cav-1)是胞膜窖的主要结构和功能成分,参与调控胆固醇转运、细胞内吞、信号转导以及肿瘤转移等重要生物学过程。Caveolin-1在癌症发生发展过程中的作用具有组织特异性,发挥抑癌作用还是促癌作用也一直存在争论。原发性肝癌,简称肝癌(liver cancer),是我国最常见的恶性肿瘤之一,在全球其致死率高居癌症中第三位。有文献报道,Cav-1能够促进肝癌细胞的侵袭和转移,并与其恶性程度有关。核心岩藻糖基化是重要的蛋白质翻译后修饰形式之一。核心岩藻糖基化主要由核心岩藻糖基转移酶8(α1,6-fucosyltransferase,FUT8/Fut8)催化完成,即岩藻糖通过α1-6糖苷键与N-聚糖核心的N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)相连。肝癌等恶性肿瘤发生发展过程中,核心岩藻糖基化异常高表达,但其发生和作用机制不明。经典Wnt信号通路在细胞的分化、增值、凋亡以及细胞的癌变肿瘤侵袭等病理过程中起了重要的调控作用,其核心因子β-catenin与TCF/LEF结合促进下游靶基因转录。生物信息预测表明,核心岩藻糖基转移酶(Fut8)启动子上游存在TCF/LEF结合序列,这提示:核心岩藻糖基化水平可能通过Wnt/β-catenin信号通路调控,Fut8基因可能是Wnt/β-catenin信号通路的靶基因。本实验室前期研究结果和文献报道显示,在肝癌细胞中,Cav-1过表达参与Wnt/β-catenin信号通路活化,增加细胞核内β-catenin的富集,上调Fut8基因的转录活性,促进核心岩藻糖基化水平升高。但在整体水平上Cav-1的表达及Wnt/β-catenin信号通路,对核心岩藻糖基转移酶Fut8表达、核心岩藻糖基化水平影响及机制研究,尚未见报道。目的:在整体水平上,探讨Cav-1基因敲除对小鼠体内肝癌组织及血清核心岩藻糖基转移酶Fut8基因表达和核心岩藻糖基化水平的影响及其作用机制。方法:以Cav-1基因敲除(KO)以及野生(WT)型C57BL/6J雄性小鼠为研究对象,注射化学试剂二乙基亚硝胺联合灌喂四氯化碳/乙醇至24周;组织病理分析确认诱导小鼠肝癌模型建立;通过Western-blot、Real Time PCR、Lectin-blot以及maldi-tof/tof质谱等方法,分析比较各时期小鼠肝/肝癌组织和血清Fut8等基因和蛋白表达及核心岩藻糖基化水平。结果:1)在化学诱导0周时,与WT小鼠相比,KO小鼠肝脏组织中Fut8表达、血清中核心岩藻糖基化水平均显著下降。2)在化学诱导24周时,与0周时正常相比,WT小鼠和KO小鼠的肝癌组织中β-catenin和Fut8表达、血清中核心岩藻糖基化水平均显著升高;但KO小鼠的显著降低WT小鼠的水平。3)在化学诱导0-24周期间,WT小鼠的Cav-1、β-catenin和N-cadherin表达逐渐显著上升、E-cadherin表达逐渐显著下降;但这些蛋白在KO小鼠中的水平显著低于在WT小鼠中的水平。这暗示Cav-1可能影响上皮-间充质细胞转化(Epithelial–Mesenchymal Transition,EMT)的发生,促进与E-cadherin结合的β-catenin积累。结论:在化学诱导小鼠肝癌发生过程中,敲除Cav-1基因降低小鼠Fut8的表达及血清中核心岩藻糖基化水平,其作用机制可能与影响EMT及Wnt/β-catenin通路有关。本研究提供了体内证据支持以上结论。

关键词： Caveolin-1 Fut8 β-catenin 肝癌模型 maldi-tof/tof