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灰毡毛忍冬花器官发育相关mads-box基因的克隆及功能分析

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灰毡毛忍冬花器官发育相关MADS-box基因的克隆及功能分析

作者：龙丽君中南林业科技大学

学位级别：硕士

灰毡毛忍冬(Lonira mceranthoides Hand.-Mazz.)属忍冬科(Caprifoliaceae)忍冬属(Lonicera)植物,是中药材“山银花”的一种基源植物,其花蕾具有重要的药用价值。普通灰毡毛忍冬花冠展开、蕾期较短,常造成丰产不丰收;近年来,研究员选育... 详细信息

灰毡毛忍冬(Lonira mceranthoides Hand.-Mazz.)属忍冬科(Caprifoliaceae)忍冬属(Lonicera)植物,是中药材“山银花”的一种基源植物,其花蕾具有重要的药用价值。普通灰毡毛忍冬花冠展开、蕾期较短,常造成丰产不丰收;近年来,研究员选育出了蕾期长、花冠不展开的花蕾型灰毡毛忍冬,对灰毡毛忍冬的开发利用具有重要意义。研究表明,在植物花器官发育过程中,mads-box基因家族发挥了重要调控作用,但在灰毡毛忍冬中如何行使功能还有待进一步研究。鉴于此,本研究以花蕾型灰毡毛忍冬品种‘龙花’为研究材料,采用同源克隆、生物信息学、实时荧光定量PCR、酵母双杂交以及转基因等技术,对灰毡毛忍冬mads-box基因家族的SVP、SOC1同源基因功能进行了全面系统的研究。旨在揭示SVP、SOC1在花蕾型灰毡毛忍冬花器官发育过程中的分子调控机制,对分子选育蕾期长、花冠不展开的灰毡毛忍冬优良新品种、提高药用忍冬植物产量和品质具有十分重要的意义。主要研究结果如下:1.从灰毡毛忍冬‘龙花’花蕾中克隆得到4个mads-box基因,分别命名为LmSVP1、LmSVP2以及LmSOC1-1、LmSOC1-2。4个基因编码蛋白均无跨膜结构、无信号肽,为亲水性的不稳定蛋白。序列结构分析表明LmSVPs和LmSOC1s基因分别隶属于Stmads11亚家族和SOC1/TM3亚家族。进化树结果显示,LmSVP1蛋白与小粒咖啡(Coffeaarabica)亲缘关系最近,LmSVP2蛋白与木樨(Osmanthusfragrans)亲缘关系最近,2个LmSOC1s蛋白聚为同一支,与菊科植物黄花蒿(Artemisiaannua)和莴苣(Lactucasativa)亲缘关系最近。2.实时荧光定量PCR检测结果显示,LmSVPs和LmSOC1s基因在花蕾品种‘龙花’和普通品种‘白云’的茎、叶、花蕾中均有表达,但在营养器官中的表达水平整体上高于生殖器官。随着花蕾发育,LmSVPs基因的表达水平总体呈下降趋势,而LmSOC1s基因表现出先升后降的变化趋势。3.将重组质粒pET28a-LmSVPs和pET28a-LmSOC1s转入大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)中进行原核表达,SDS-PAGE检测结果显示,LmSVPs基因能够表达出约为35 kDa的融合蛋白,LmSOC1s基因能够表达出约为30kDa的融合蛋白,与预测的带6个组氨酸标记的蛋白分子量一致,但表达的蛋白均为包涵体蛋白。4.通过酵母双杂交技术分析了灰毡毛忍冬LmSVPs、LmSOC1s、LmAP1和LmFLC蛋白的相互作用模式。研究结果表明,LmSVP1与LmSVP2、LmSOC1-1与LmSOC1-2之间均能够形成异源二聚体,并且LmSVP2蛋白自身也能够产生互作关系;LmSVPs与LmSOC1s之间存在蛋白体外互作;LmSVPs、LmSOC1s与LmAP1之间均能形成二聚体复合物;LmSVP1还能与LmFLC产生相互作用。5.利用农杆菌介导的花序侵染法,将4个mads-box基因分别转化至拟南芥中,对转基因拟南芥表型分析发现,LmSVP1和LmSVP2在调控植物开花方面功能存在相似性,都具有延迟开花的作用,植株的花瓣细丝状、心皮伸长和花萼叶片化。但它们的功能又存在差异,LmSVP2的过表达植株出现花蕾期延长、花瓣数量增加、花萼表皮毛增多等现象。这说明LmSVP1和LmSVP2在延迟开花的功能上存在保守性,但在花蕾期调控和花器官形态建成方面表现出不同的功能。qRT-PCR结果表明LmSVP1和LmSVP2可能通过调控FT、SOC1、FLC和AP1的表达来影响植物开花时间及参与花器官的发育。2个LmSOC1s基因都能促进植物开花,但在调控花蕾期和花器官形态发育的功能上也存在差异.LmSOC1-1过表达植株花冠不展开、花蕾期长,而LmSOC1-2过表达植株花瓣呈细丝状。qRT-PCR结果表明,过表达的LmSOC1s通过上调AGL24、LFY促使转基因植株提前开花,同时调控AP1、FUL的表达参与花器官的形态建成。本研究全面鉴定了灰毡毛忍冬转录组中LmSVPs、LmSOC1s等影响花器官发育的基因,并通过分子生物学技术验证了LmSVPs、LmSOC1s在灰毡毛忍冬花发育过程中的功能,为从分子水平上研究花蕾型灰毡毛忍冬花器官发育奠定了基础。

关键词：灰毡毛忍冬花器官发育 mads-box基因蛋白互作功能验证

mads-box基因家族基因重复及其功能的多样性

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植物学通报 2007年第1期24卷 60-70页

作者：吕山花孟征聊城大学农学院园艺工程系聊城252059 中国科学院植物研究所植物信号转导与代谢组学研究中心北京100093

基因的重复(duplication)及其功能的多样性(diversification)为生物体新的形态进化提供了原材料。mads-box基因在植物(特别是被子植物)的进化过程中发生了大规模的基因重复事件而形成一个多基因家族。mads-box基因家族的不同成员在植物... 详细信息

基因的重复(duplication)及其功能的多样性(diversification)为生物体新的形态进化提供了原材料。mads-box基因在植物(特别是被子植物)的进化过程中发生了大规模的基因重复事件而形成一个多基因家族。mads-box基因家族的不同成员在植物生长发育过程中起着非常重要的作用,在调控开花时间、决定花分生组织和花器官特征以及调控根、叶、胚珠及果实的发育中起着广泛的作用。探讨mads-box基因家族的进化历史有助于深入了解基因重复及随后其功能分化的过程和机制。本文综述了mads-box基因家族基因重复及其功能分化式样的研究进展。

关键词： mads-box基因基因重复功能分化

mads-box基因家族调控植物花器官发育研究进展

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浙江农业学报 2021年第6期33卷 1149-1158页

作者：王莹穆艳霞王锦西南林业大学园林园艺学院云南昆明650224

花器官的发生发育与形态构造是一个高度复杂的项目,涉及众多因素及其相互作用,mads-box基因作为其中的关键转录因子可以改变整个发育过程,因而成为花器官研究最广泛的基因家族。通过梳理目前mads-box基因对花器官发生、分化和形态建成... 详细信息

花器官的发生发育与形态构造是一个高度复杂的项目,涉及众多因素及其相互作用,mads-box基因作为其中的关键转录因子可以改变整个发育过程,因而成为花器官研究最广泛的基因家族。通过梳理目前mads-box基因对花器官发生、分化和形态建成方面的调控作用,为了解花发育程序和该基因家族的一般转录调控机制提供新见解,也为进一步深入挖掘该家族基因和完善花发育调控理论提供参考。

关键词：花发生发育 mads-box基因调控机制花发育模型

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mads-box基因在植物发育中的功能

植物生理学通讯 2007年第2期43卷 218-222页

作者：张则婷李学宝华中师范大学生命科学学院武汉430079

mads-box基因是一类序列特异的调节基因家族,是同源异型基因。它编码的蛋白质是一类转录因子,在植物的发育尤其在花器官的发育调控中起作用。文章介绍mads-box基因调控植物开花的作用模式、mads-box基因间的相互调控以及mads-box基因功... 详细信息

mads-box基因是一类序列特异的调节基因家族,是同源异型基因。它编码的蛋白质是一类转录因子,在植物的发育尤其在花器官的发育调控中起作用。文章介绍mads-box基因调控植物开花的作用模式、mads-box基因间的相互调控以及mads-box基因功能的研究进展。

关键词： mads-box基因 ABC模型花器官相互调控

mads-box基因cDNA片段在甜菜染色体上的定位

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黑龙江大学自然科学学报 2008年第5期25卷 648-651,655页

作者：王玉婷高庆和马春泉王冰汪立法曹洪祥杜萍张喜波李海英黑龙江大学生命科学学院分子生物学重点实验室哈尔滨150080 黑龙江省肇东市农业技术推广中心肇东151100

以甜菜mads-box基因cDNA片段为探针,采用Southern杂交证实了其在甜菜基因组中为低拷贝序列;利用荧光原位杂交技术(FISH)将其初步定位在二倍体栽培甜菜(Beta vulgar-is)A2Y的第2号染色体上。研究成功地实现了小片段低拷贝的功能基因在甜... 详细信息

以甜菜mads-box基因cDNA片段为探针,采用Southern杂交证实了其在甜菜基因组中为低拷贝序列;利用荧光原位杂交技术(FISH)将其初步定位在二倍体栽培甜菜(Beta vulgar-is)A2Y的第2号染色体上。研究成功地实现了小片段低拷贝的功能基因在甜菜染色体上的定位,为今后甜菜遗传物理图谱的构建提供了有效可行的方法。

关键词： mads-box基因甜菜荧光原位杂交(FISH) 定位

mads-box基因在水稻ah、dl花突变体及其野生型中的表达及变化的分析

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MADS-box基因在水稻ah、dl花突变体及其野生型中的表达及变化的分...

作者：郑成四川农业大学

学位级别：硕士

在植物中,mads-box基因家族最显著的特点是其编码的转录因子参与植物花的发育,分生组织的分化,果实的成熟,胚的发育,根和叶的生长等多种生长发育过程。尤其是在花器官的发育中,mads-box基因更是发挥重要作用。目前已鉴定的与花发育相关... 详细信息

在植物中,mads-box基因家族最显著的特点是其编码的转录因子参与植物花的发育,分生组织的分化,果实的成熟,胚的发育,根和叶的生长等多种生长发育过程。尤其是在花器官的发育中,mads-box基因更是发挥重要作用。目前已鉴定的与花发育相关基因大多数都属于mads-box基因家族。而在水稻为代表的单子叶植物中,mads-box基因的研究明显滞后于双子叶植物。在水稻中,mads-box基因大多数都是利用双子叶植物的同源序列筛选水稻基因组或cDNA文库获取的,然后通过反义RNA技术或转基因植物来推测其功能。本研究利用从水稻双胚苗品系中自然发生出来的两个花发育突变体ah（abnormal hull）、dl（drooping leaf）及其野生型,通过3′cDNA末端快速克隆和相对定量的方法在幼穗期对mads-box基因进行了克隆及表达分析,获得了如下结果: 从三个材料中分别获得了5个mads-box基因,序列分析表明它们分别对应mads1、mads6、mads7、mads17、mads24。其中mads7、mads17、mads24在三个材料中的同源性高达99%以上,只在少数位点发生了碱基替换但不影响编码的蛋白序列。mads1在ah、dl中,mads6在ah中分别在编码序列中发生了插入突变,使其对应的蛋白序列发生了改变。运用定量PCR,对三个材料幼穗中的mads1、mads6、mads7、mads17、mads24的表达进行分析发现这几个基因之间的表达存在差异。在野生型中,基因表达量从高到低依次为mads7、mads6、mads1、mads24、mads17;在ah中,mads1、mads6的表达量明显高于野生型,mads17与野生型相当,而mads7、mads24明显低于野生型且与dl相当;在dl中,除mads1的表达量与野生型大致相当,其余各个基因的表达量均有一定程度的下降。

关键词：水稻 mads-box基因克隆表达分析

mads-box基因在植物胚珠发育中的作用

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种子 2008年第5期27卷 14-17页

作者：张君诚宋育红陈夜江张新文张杭颖三明学院应用生物技术研究所福建三明365004

mads-box基因家族在植物花发育等许多方面承担重要作用。分析了mads-box基因的分类与其所编码的转录因子结构特征,综述了在矮牵牛和拟南芥中发现的FBP7与FBP11、AG、STK、SHP1与SHP2、SEP及其水稻中Osmads13对胚珠发育、形成的作用研究... 详细信息

mads-box基因家族在植物花发育等许多方面承担重要作用。分析了mads-box基因的分类与其所编码的转录因子结构特征,综述了在矮牵牛和拟南芥中发现的FBP7与FBP11、AG、STK、SHP1与SHP2、SEP及其水稻中Osmads13对胚珠发育、形成的作用研究。对mads-box基因研究前景进行简要展望。

关键词： mads-box基因胚珠发育

mads-box基因在豌豆花发育中的功能研究

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MADS-box基因在豌豆花发育中的功能研究

作者：宋伟杰杭州师范大学

学位级别：硕士

mads-box基因是一个大的转录因子家族,在花发育过程中起着重要作用。根据对模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)和金鱼草(Antirrhinum majus)遗传突变体的研究,提出了花发育的ABCE模型。该模型认为：A、B、C、E代表了4类功能不同的花... 详细信息

mads-box基因是一个大的转录因子家族,在花发育过程中起着重要作用。根据对模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)和金鱼草(Antirrhinum majus)遗传突变体的研究,提出了花发育的ABCE模型。该模型认为：A、B、C、E代表了4类功能不同的花器官特征基因,单独或联合控制花器官的发育。由于豌豆花发育具有特殊性,在花原基起始过程中有四个共同原基(common primordial, CP)出现,再由共同原基产生花瓣和雄蕊,参与豌豆花发育的ABCE同源基因是否也有相应的特殊性是值得探讨的问题。目前,在植物发育生物学研究中,对豌豆等很多难转化植物基因功能的研究总是因为缺乏快速有效的方法而受到限制。在本研究中,我们利用一种反向遗传学快速研究基因功能的方法—病毒诱导的基因沉默技术(Virus Induced Gene Silencing,VIGS),研究了豌豆的几个mads-box基因的功能。获得以下结果： 1.豌豆中PsPI基因沉默后,出现了类似于拟南芥pi突变体/金鱼草glo突变体的表型,导致花瓣向萼片以及雄蕊向心皮转变,表明PsPI基因具有拟南芥PI/金鱼草GLO同源基因的功能,这说明这类基因在进化和功能上是相当保守的。 2.豌豆中PsSEP1/2基因沉默后,导致花器官第四轮决定性丧失,区别于拟南芥,提示E类基因在功能进化上可能发生了岐化。 3.其余几个mads-box基因沉默后没有出现相对应的沉默表型,提示这些基因可能存在功能冗余。 ***-box基因保守区VIGS构建的结果提示豌豆中通过沉默保守区研究整个基因家族对花发育的影响应该是可行的。 5.对PsPI和PsSEP1/2基因串联构建能出现双基因沉默的叠加表型,提示利用VIGS进行多基因功能研究是可行的。 6.利用mRNA原位杂交技术对四个豌豆mads-box基因表达模式的分析,验证了mads-box同源基因在豌豆花发育中的功能。以上结果说明豌豆mads-box基因在功能上既保守又存在岐化,同时也表明VIGS是一种研究植物基因功能的快速有效的方法,特别是对于那些转化困难的非模式植物基因功能的研究具有更为重要的意义。

关键词：豌豆 VIGS mads-box基因 ABC模型同源异型转变

mads-box基因的克隆及其在香蕉果实各成熟阶段的表达分析

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MADS-box基因的克隆及其在香蕉果实各成熟阶段的表达分析

作者：胡丽芳华南热带农业大学

学位级别：硕士

香蕉是一种典型的呼吸跃变性果实,对其进行成熟的调控及机理的研究具有重要的理论和实践意义。mads-box基因是一个序列特异的基因家族,所编码的产物为转录因子,越来越多的资料表明,其在花的发育、果实的发育和成熟过程中起着重要的作用... 详细信息

香蕉是一种典型的呼吸跃变性果实,对其进行成熟的调控及机理的研究具有重要的理论和实践意义。mads-box基因是一个序列特异的基因家族,所编码的产物为转录因子,越来越多的资料表明,其在花的发育、果实的发育和成熟过程中起着重要的作用。本实验室通过构建香蕉果实的SSH文库,已经获得了mads-box基因的片段,而且通过芯片的分析表明其可能与果实的成熟相关,因此对其进行进一步的研究是非常必要的。根据已知SSH片段设计引物,采用PCR的方法从香蕉果实cDNA文库中筛选出一条命名为Mumads1长为888bp的片段和另一条命名为Mumads2长为553bp的片段,进行Blastx比对后发现两者都与其他物种的mads-box基因的同源性很高,进行保守结构域的分析发现,Mumads1含有一个非常保守的mads-box结构域和一个较保守的K-box结构域,经Genscan分析后发现,Mumads1含有一个完整的阅读框,共编码235个氨基酸。Southern杂交表明,Mumads1在香蕉基因组中的拷贝数较低。为了研究Mumads1的表达,首先测定了香蕉果实乙烯和CO的变化,结果显示两者都在采后的第15天开始发生跃变,在采后第25天,都同时达到高峰,根据其变化趋势,选取了0天、采后4天、8天、12天、18天、20天和25天的果实作为表达分析的材料,同时也将香蕉的根、茎叶和花作为表达分析的材料,然后提取各自的RNA并反转录成cDNA作为表达分析的模板。RT-PCR的结果表明其仅在香蕉的果实和花中有表达,而在根和茎叶中没有表达。为了更加准确地分析其在果实不同成熟度及花中的表达水平,以不同材料的cDNA作为模板以SYBR Green为染料进行实时荧光定量PCR,结果表明其在香蕉采后各成熟度的果实中的表达是有差异的,其变化趋势是先下降后上升。在采后的第0天-第8天内,其表达量一直下降,从采后的第8天-第20天内,除了第12天-18天有一小幅度的下降外,一直上升,在采后的第20天达到高峰。其发生跃变以及达到高峰的时间都要比乙烯提前,而其在花中的表达量较高。根据其表达量的变化,推测Mumads1可能除了花的发育起作用外,在果实发育的早期与果实的发育相关,而在果实发育的晚期与成熟相关。首次在香蕉中克隆mads-box基因并进行表达分析对于mads-box基因与乙烯的生成、果实成熟机理间的关系以及有着一定的理论指导意义,值得进一步的研究,

关键词：香蕉 mads-box基因 Southern杂交实时荧光定量PCR 表达差异果实发育果实成熟