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超级增强子调控基因mab21l2在神经母细胞瘤中的作用及机制研究

超级增强子调控基因MAB21L2在神经母细胞瘤中的作用及机制研究

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作者：潘晶晶苏州大学

学位级别：硕士

研究背景及目的:神经母细胞瘤(Neuroblastoma,NB)是婴幼儿最常见的恶性颅外实体肿瘤之一,该病起源于神经外胚层的神经嵴祖细胞,是胚胎神经内分泌肿瘤。临床上具有原发肿瘤小、不易被发现、恶性程度高、侵袭进展快、易发生转移的特点,且... 详细信息

研究背景及目的:神经母细胞瘤(Neuroblastoma,NB)是婴幼儿最常见的恶性颅外实体肿瘤之一,该病起源于神经外胚层的神经嵴祖细胞,是胚胎神经内分泌肿瘤。临床上具有原发肿瘤小、不易被发现、恶性程度高、侵袭进展快、易发生转移的特点,且治疗特别困难,预后较差。因此,我们期望借助研究神经母细胞瘤的分子机制,发现高效的治疗靶点,具有重要的临床意义。超级增强子可以驱动调控基因转录过程,以此来维持肿瘤细胞的功能。研究神经母细胞瘤中超级增强子调控基因的作用及其机制,可以为神经母细胞瘤的治疗提供新的思路,为提升神经母细胞瘤患者的预后带来希望。本次实验通过寻找神经母细胞瘤中超级增强子的调控基因,研究该基因在神经母细胞瘤中的作用,并尝试探讨其作用机制。研究方法:本研究通过收集和分析生物信息学数据库中神经母细胞瘤细胞株组蛋白H3K27ac的CHIP-Seq结果,筛选出在神经母细胞瘤中超级增强子调控中具有重要意义的基因,并进行鉴定;通过查阅Cancer Cell line Encyclopedia(CClE)生物信息学数据库,查询所筛选的mab21l2基因在不同肿瘤细胞中的表达情况;通过查阅生物信息学数据库R2:Genomics Analysis and Visualization Platform,比较在神经母细胞瘤患儿中mab21l2基因的表达水平与神经母细胞瘤患儿的临床预后之间的关系。设计并合成mab21l2基因干扰质粒,慢病毒包装、转染,将已转染mab21l2低表达慢病毒细胞株细胞培养,获得mab21l2稳定敲低细胞株。通过RT-PCR技术和Western-Blot技术分别检测mab21l2基因在基因水平及蛋白水平的敲低效率。通过CCK-8细胞增殖实验、集落形成实验及裸鼠皮下成瘤实验来检测对神经母细胞瘤细胞株增殖能力及体外成瘤能力的影响。利用流式细胞仪的周期和凋亡检测,来了解对神经母细胞瘤细胞周期分布、凋亡水平的变化情况。利用Transwell迁移实验检测神经母细胞瘤细胞迁移能力的变化情况。通过RNA-seq技术检测并筛选出与mab21l2低表达密切相关的重要基因及富集信号通路。利用蛋白质免疫共沉淀技术(IP)检测mab21l2与在神经母细胞瘤发生发展过程中的重要蛋白之间是否存在相互作用。研究结果:我们筛选出mab21l2基因,它是神经母细胞瘤中超级增强子的调控新基因之一。数据显示,在肿瘤细胞的mab21l2表达量中,mab21l2基因在神经母细胞瘤细胞株中的表达量明显高于其他肿瘤细胞株,且存在特异性高表达;mab21l2表达是儿童神经母细胞瘤患者近独立的预后因素。我们通过RNA干扰技术,成功构建mab21l2基因表达敲低的神经母细胞瘤细胞株,细胞白光、CCK-8细胞增殖实验、集落形成实验均发现,敲低组的细胞数量较对照组明显减少。mab21l2低表达对神经母细胞瘤的细胞周期产生影响,并可促进细胞凋亡。裸鼠皮下成瘤实验显示mab21l2敲低组的神经母细胞瘤所成瘤体明显小于对照组。Transwell实验结果显示,mab21l2基因敲低表达后,神经母细胞瘤细胞的迁移能力明显减弱。mab21l2低表达的RNA-seq数据显示,mab21l2低表达与其下游很多基因相关。KEGG信号通路分析显示,mab21l2基因显著富集于P13K-Akt信号通路、ECM-receptor interaction、Focal adhesion信号通路等,GO信号通路分析示,富集信号主要在细胞外基质组织、细胞外结构组织中有分布,并参与阿米样细胞迁移等生物过程的调控。IP结果显示,mab21l2蛋白与MYCN、GATA3、PHOX2B、Meis2、TlX2等蛋白在神经母细胞瘤细胞中存在相互作用。结论:mab21l2作为超级增强子调控基因与神经母细胞瘤密切相关,提示mab21l2在神经母细胞瘤的发生发展中发挥着重要作用。

关键词：超级增强子神经母细胞瘤 mab21l2

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mab21l2基因在人晶状体上皮细胞分化中的功能分析

Mab21L2基因在人晶状体上皮细胞分化中的功能分析

引用

作者：吕佳韩湖南师范大学

学位级别：硕士

以前的研究表明mab21l2在眼睛尤其是晶状体发育过程中起重要作用[1,2],但是mab21l2调控晶状体发育的分子机制目前尚不清楚.体外培养的晶状体上皮细胞,被广泛运用为研究晶状体发育和分化的模型。HlE细胞系是向体外培养的人晶状体上皮细... 详细信息

以前的研究表明mab21l2在眼睛尤其是晶状体发育过程中起重要作用[1,2],但是mab21l2调控晶状体发育的分子机制目前尚不清楚.体外培养的晶状体上皮细胞,被广泛运用为研究晶状体发育和分化的模型。HlE细胞系是向体外培养的人晶状体上皮细胞中转入SV40大T抗原而得到的转化细胞系,我们利用这一细胞系研究mab21l2在晶状体分化中的可能功能。纯化的mab21l2表达质粒和它的载体被分别转入HlE细胞中,用400μg/ml的G418筛选获得稳定的克隆,然后用RT-PCR和Western Blot鉴定高表达mab21l2的克隆。形态观察发现,高表达mab21l2的克隆与载体转染的克隆相比,细胞形态有明显变化,细胞变长,有明显纤维化表型。为了进一步探索mab21l2在晶状体分化中的功能,我们用75ng/ml和100ng/ml的FGF-basic处理mab21l2和载体转染的稳定高表达克隆,在同样的浓度处理时,高表达mab21l2的克隆大概只需2-3天,纤维化已经十分明显,但是转入了载体的对照克隆却需要5天才出现较明显纤维化,很明显过表达mab21l2可以加速FGF-basic诱导的HlE细胞分化。FGF-basic处理细胞后,提取细胞总蛋白,Western Blot检测结果表明mab21l2和载体转染的克隆中,pERK1/2的表达模式十分不同。在没有FGF-basic处理时,高表达mab21l2的克隆中pERK1/2的表达被抑制,明显低于对照克隆中pERK1/2的表达;但是当用FGF-basic处理细胞1或2天后,高表达mab21l2的克隆中pERK1/2的表达极大的增强,因而远高于对照克隆中的pERK1/2;但到处理4天后,高表达mab21l2的克隆中pERK1/2表达急剧下降,又一次低于对照克隆中pERK1/2的表达。此外,表达系和对照系中,PP2A调节亚基B56γ和MEK2的表达模式也有明显差异,并且MEK2与pERK1/2的表达水平正相关,B56γ与pERK1/2的表达水平负相关。这些结果提示mab21l2促进HlE细胞分化的分子机制是通过调节B56γ和MEK2的表达,从磷酸化和去磷酸化两方面,精确调控pERK1/2表达水平来实现的。在FGF-basic诱导HlE分化的不同阶段,mab21l2既可正性也可负性调节pERK1/2表达水平。

关键词： mab21l2 pERK1/2 分化

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