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过表达非洲猪瘟病毒D1133L蛋白的ma-104细胞系建立及其初步应用

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畜牧兽医学报 2022年第6期53卷 1877-1885页

作者：张婷杨博崔卉梅袁兴国赵登率杨金柯郝雨陈学辉闫文倩申超超史喜绢张大俊杨行刘湘涛郑海学张克山中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院家畜疫病病原生物学国家重点实验室兰州730000

旨在研究非洲猪瘟病毒(African swine fever,ASFV)编码的D1133L基因功能,本文利用慢病毒表达系统构建了过表达D1133L的ma-104/D1133L细胞系,分析ASFV在ma-104/D1133L细胞系与ma-104细胞中的复制差异。利用RT-qPCR和Western blot技术分别检测了ASFV感染ma-104/D1133L细胞后p30和p72基因的转录和蛋白表达水平,同时测定病毒滴度和病毒拷贝数评价ASFV的复制能力。结果表明:ASFV p30和p72基因在ma-104/D1133L细胞系的转录和蛋白表达水平高于野生型细胞系,ASFV在ma-104/D1133L细胞系的病毒增殖能力高于野生型细胞。本研究成功构建了过表达ASFV D1133L基因的ma-104/D1133L细胞系,与野生型细胞相比,D1133L能促进ASFV增殖,ma-104/D1133L细胞系更利于ASFV的复制,本结果为进一步研究ASFV D1133L基因功能积累了生物材料。

关键词：非洲猪瘟病毒 D1133L基因 ma-104细胞基因功能过表达细胞系

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GPRV CH-1株感染ma-104细胞的蛋白组学研究

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GPRV CH-1株感染MA-104细胞的蛋白组学研究

作者：杨锐四川农业大学

学位级别：硕士

ma-104细胞(恒河猴肾细胞)是增殖轮状病毒(RV)适宜的体外培养细胞,是RV分子生物学研究重要模式细胞。GPRV(rotavirus derived from giant panda)CH-1株是第1株从大熊猫腹泻病例中分离出的轮状病毒,在ma-104细胞上能够增殖并引起典型细... 详细信息

ma-104细胞(恒河猴肾细胞)是增殖轮状病毒(RV)适宜的体外培养细胞,是RV分子生物学研究重要模式细胞。GPRV(rotavirus derived from giant panda)CH-1株是第1株从大熊猫腹泻病例中分离出的轮状病毒,在ma-104细胞上能够增殖并引起典型细胞病变效应(CPE)。为深入研究该病毒的致病机制,本研究通过i TRAQ技术结合液相色谱质谱技术(LC-MS/MS)对GPRV感染前后的ma-104细胞进行蛋白质组学分析。对GPRV(2MOI)感染ma-104细胞后的7个时间点(6,12,18,24,30,36和42 h)的CPE情况和病毒量变化情况进行分析。在12 h时,细胞开始出现轻微病变,30 h时出现80%以上的CPE,36 h后细胞基本上全部脱落;GPRV CH-1株在感染ma-104细胞后30 h病毒中VP4基因的表达水平达到峰值。一般在病毒具有较高的滴度且感染细胞没有明显的骨架或膜重排的样品是进行蛋白质组学分析的最佳样品。因此本实验确定GPRV CH-1株感染ma-104细胞后24 h为进行蛋白质组学分析的时间点。我们利用蛋白质组学技术对GPRV CH-1株感染前后24 h的ma-104细胞内的蛋白表达变化情况进行了分析。共鉴定到3985个蛋白质,筛选获得272个发生显著变化的差异蛋白,包括142个显著上调和130个显著下调的蛋白质。差异蛋白的GO功能主要富集在26个生物过程、12个细胞组分与16个分子功能中,并且这些差异蛋白中有64个参与细胞死亡过程,42个参与病毒复制过程,57个差异蛋白参与免疫应答过程。KEGG通路富集与互作网络分析发现6个参与maPK信号通路的差异蛋白,4个参与p53信号通路,6个参与PI3K-Akt信号通路,可能与GPRV在宿主细胞中复制、促进细胞死亡及致病性密切相关。通过荧光定量RT-PCR方法进一步对GPRV感染24 h后ma-104细胞中的KRT8,HSP27,14-3-3ζ/δ和Annexin2(ANXA2)基因的表达进行了检测,其表达量变化与蛋白组学分析结果一致。本课题从蛋白质组学入手比较了GPRV感染ma-104细胞前后对细胞内蛋白质表达的影响,发现了对GPRV CH-1株感染表达发生显著差异且与病毒复制、细胞死亡及免疫应答紧密相关的差异蛋白,为研究GPRV CH-1株的致病机制及该病毒感染宿主细胞诱导的天然免疫反应的分子机制提供了新思路。

关键词：大熊猫轮状病毒 ma-104细胞蛋白质组学

猪轮状病毒的细胞培养特性与FQ-PCR检测方法的建立

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中国兽医学报 2011年第3期31卷 373-377页

作者：魏锁成巩转娣宋昌军西北民族大学生命科学与工程学院甘肃兰州730030 西北民族大学医学院附属医院甘肃兰州730030

为了探讨动物轮状病毒的细胞培养特性和分离方法,建立FQ-PCR检测方法,旨在为研发诊断试剂盒和疫苗奠定基础。37℃5%CO_2下用细胞培养液C培养ELISA检测的阳性猪粪便样本,观察细胞形态的变化;用RV感染ma-104细胞,分离纯化病毒,测定VP6基... 详细信息

为了探讨动物轮状病毒的细胞培养特性和分离方法,建立FQ-PCR检测方法,旨在为研发诊断试剂盒和疫苗奠定基础。37℃5%CO_2下用细胞培养液C培养ELISA检测的阳性猪粪便样本,观察细胞形态的变化;用RV感染ma-104细胞,分离纯化病毒,测定VP6基因序列并分析其同源性,在普通PCR和实时定量PCR的基础上,建立FQ-PCR检测方法。结果,ma-104细胞培养的最佳条件为37℃5%CO_2;接毒后18 h出现细胞膜缩融合、细胞层裂开、细胞核固缩及空泡化等明显的细胞病变(CPE),CPE达到90%时可收毒;分离到1株猪轮状病毒(暂命名为GSPRV01株),得到VP6为1 200 bp,与标准株(AV-55)的同源性为88.50%。

关键词：轮状病毒 ma-104细胞实时荧光定量PCR 猪

A群轮状病毒NSP5蛋白在细胞器中定位特性

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中国预防兽医学报 2015年第2期37卷 143-145页

作者：谷凤丽石达时洪艳陈建飞张鑫袁婧徐天董慧冯力中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪消化道团队黑龙江哈尔滨150001 东北农业大学生命科学学院黑龙江哈尔滨150030 沈阳农业大学畜牧兽医学院辽宁沈阳110866

为研究A组猪轮状病毒(Po RV)非结构蛋白NSP5在ma-104细胞中的定位情况,本研究将NSP5蛋白基因克隆于表达载体p EGFP-C2中构建重组质粒p EGFP-NSP5,将其转染于ma-104细胞中进行NSP5瞬时表达,并于转染48 h后利用激光共聚焦显微镜分析NSP5... 详细信息

为研究A组猪轮状病毒(Po RV)非结构蛋白NSP5在ma-104细胞中的定位情况,本研究将NSP5蛋白基因克隆于表达载体p EGFP-C2中构建重组质粒p EGFP-NSP5,将其转染于ma-104细胞中进行NSP5瞬时表达,并于转染48 h后利用激光共聚焦显微镜分析NSP5表达蛋白在细胞中的定位情况。结果表明,表达蛋白在ma-104细胞中的线粒体、内质网、高尔基体中均有分布,主要定位于细胞质。本研究为进一步分析病毒的复制和致病机理提供依据。

关键词： A组猪轮状病毒 NSP5蛋白 ma-104细胞共定位

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仔猪轮状病毒FQ-PCR检测方法的建立

中国人兽共患病学报 2010年第6期26卷 558-561页

作者：魏锁成巩转娣宋昌军西北民族大学动物医学研究所兰州730030 西北民族大学医学院附属医院兰州730030

目的探讨动物轮状病毒分离鉴定方法 ,建立实时荧光定量PCR(FQ-PCR)快速检测法。方法用RV敏感的ma-104细胞分离病毒,测定其VP6基因序列和同源性分析,建立FQ-PCR检测方法。结果 ma-104细胞接毒并传代18h后出现明显的细胞病变(CPE),分离到... 详细信息

目的探讨动物轮状病毒分离鉴定方法 ,建立实时荧光定量PCR(FQ-PCR)快速检测法。方法用RV敏感的ma-104细胞分离病毒,测定其VP6基因序列和同源性分析,建立FQ-PCR检测方法。结果 ma-104细胞接毒并传代18h后出现明显的细胞病变(CPE),分离到1株猪轮状病毒(PRV),经RT-PCR扩增得到1200bp的VP6片段,与标准株(AV-55)的同源性达88.50%;且建立了PRV的FQ-PCR检测方法 ,其灵敏度比普通PCR高数十倍,具有较强的特异性。结论建立了PRV的FQ-PCR检测方法 ,其灵敏度和特异性比普通PCR高数十倍,PRV的VP6与参考株具有88.50%同源性,建立了PRV的FQ-PCR检测方法 ,其灵敏度和特异性普通PCR和ELISA均高。

关键词：轮状病毒 ma-104细胞实时荧光定量PCR 仔猪

儿童轮状病毒和星状病毒的感染情况及其型别分析

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儿童轮状病毒和星状病毒的感染情况及其型别分析

作者：马慧天津医科大学

学位级别：硕士

目的：本研究将逆转录聚合酶链反应技术(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)与细胞培养(cell culture)相结合,进一步了解天津地区5岁以下住院腹泻患儿A组轮状病毒和星状病毒的感染情况及其型别特点。方法： ... 详细信息

目的：本研究将逆转录聚合酶链反应技术(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)与细胞培养(cell culture)相结合,进一步了解天津地区5岁以下住院腹泻患儿A组轮状病毒和星状病毒的感染情况及其型别特点。方法：收集天津市儿童医院2008年5月到2009年4月5岁以下住院腹泻患儿的粪便标本,用胶体金免疫层析法快速检测A组轮状病毒抗原,用酶联免疫吸附试验方法(ELISA)进行星状病毒抗原检测,将抗原检测阳性的标本经过胰酶(10μg/ml)处理分别接种于ma-104细胞株和CaCo-2细胞株,产生细胞病变(CPE)后,提取病毒RNA, RT-PCR扩增并经测序确证。测序结果利用DNASTAR和BlAST软件进行比对。同时收集其临床相关资料。结果： 863例粪便标本轮状病毒抗原阳性率为28.39%(245/863);89.39%的轮状病毒腹泻发生在24月龄以下患儿;发病高峰主要集中在2008年10月份到2009年4月份;245例轮状病毒抗原阳性标本中,男166例,女79例,男女阳性检出率之比为2.10：1;轮状病毒感染的主要临床表现为腹泻、发热、呕吐,并伴有不同程度的脱水;此外,接种的208例轮状病毒抗原阳性标本中,病毒分离后用PCR鉴定阳性95例,对其中35例PCR产物阳性标本作序列分析显示除1例为轮状病毒G9型、2例为轮状病毒G3型外,其余均为轮状病毒G1型。 863例粪便标本星状病毒抗原阳性检出率为2.90%(25/863),与轮状病毒共同感染的有6例,占星状病毒抗原阳性标本的24.00%(6/25);96.00%的星状病毒腹泻发生在2岁以下患儿,其中小于6月龄的患儿占星状阳性标本的44.00%(11/25);星状病毒感染主要集中在2008年8月份至次年4月份,与轮状病毒流行季节相似;25例星状病毒抗原阳性标本中,男15例,女10例,男女阳性检出率之比为1.74：1,差异无显著性统计学意义(χ2=0.717,P=0.132);星状病毒感染的主要临床表现为腹泻、发热、呕吐,仅有一例伴有轻度脱水;此外,接种的21例星状病毒抗原阳性的标本中,病毒分离后用PCR鉴定阳性11例并经测序确证均为HAstV-1型。结论：轮状病毒是天津地区婴幼儿腹泻的重要病原,流行的基因型以G1为主。星状病毒也是天津地区2008年-2009年婴幼儿病毒性腹泻的重要病原之一,流行型别以HAstV-1型为主。

关键词：轮状病毒星状病毒 ma-104细胞 CaCo-2细胞逆转录聚合酶链反应基因型

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猪和牛轮状病毒的分离与鉴定

病毒学报 1986年第1期 36-40+98页

作者：倪亚炜中国兽药监察所

应用ma-104细胞、胰蛋白酶处理培养物和旋转培养技术,成功地从患腹泻仔猪和犊牛的粪便样品中,分离到6株猪轮状病毒和4株牛轮状病毒。经形态学、血清学和病毒RNA电泳分析等鉴定,确为典型轮状病毒。经ma-104细胞连续传代,这10株轮状病毒... 详细信息

应用ma-104细胞、胰蛋白酶处理培养物和旋转培养技术,成功地从患腹泻仔猪和犊牛的粪便样品中,分离到6株猪轮状病毒和4株牛轮状病毒。经形态学、血清学和病毒RNA电泳分析等鉴定,确为典型轮状病毒。经ma-104细胞连续传代,这10株轮状病毒均成为细胞适应毒株,并在该细胞上产生明显的细胞病变。

关键词：轮状病毒 ma-104细胞免疫荧光技术 ELISA 病毒RNA电泳分析

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轮状病毒生物学特性的研究

山西医药杂志 1992年第2期21卷 99-100页

作者：赵富玺裴润方大同医学专科学校 037000 重庆医科大学

用ma—104细胞培养常用的3个轮状病毒(RV)标准株(人Wa株、牛NCDV株、猴SA_(11)株)进行形态学、培养特性及理化性质比较观察,3株细胞培养特性基本相同,在电镜下呈RV特有的形态结构,RNA电泳图具有典型的电泳区带分布模式,表明RV的生物学... 详细信息

用ma—104细胞培养常用的3个轮状病毒(RV)标准株(人Wa株、牛NCDV株、猴SA_(11)株)进行形态学、培养特性及理化性质比较观察,3株细胞培养特性基本相同,在电镜下呈RV特有的形态结构,RNA电泳图具有典型的电泳区带分布模式,表明RV的生物学性质有较高的稳定性。

关键词： ma-104细胞轮状病毒 RNA电泳

大黄提取物和大黄素体外抗轮状病毒的实验研究

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中国病毒病杂志 2013年第2期3卷 112-116页

作者：贺凤兰刘强卫飞刘媛媛熊海蓉周显凤杨占秋南昌市疾病预防控制中心江西南昌330038 武汉大学医学病毒学研究所食品与药品评价研究中心病毒学国家重点实验室国家中医药管理局中药抗病毒与肿瘤实验室湖北武汉430071

目的研究大黄提取物、大黄素体外对轮状病毒的作用,为临床上治疗轮状病毒的感染提供理论依据。方法用人轮状病毒R709株感染恒河猴肾细胞(ma-104),通过光镜观察细胞病变效应(CPE),并结合噻唑蓝(MTT)比色法,采用治疗指数(TI)作为药物体外... 详细信息

目的研究大黄提取物、大黄素体外对轮状病毒的作用,为临床上治疗轮状病毒的感染提供理论依据。方法用人轮状病毒R709株感染恒河猴肾细胞(ma-104),通过光镜观察细胞病变效应(CPE),并结合噻唑蓝(MTT)比色法,采用治疗指数(TI)作为药物体外抗病毒效果的评价指标。以利巴韦林为阳性对照,从药物对病毒入侵细胞的阻断作用、直接灭活作用及增殖抑制作用3种方式分别检测大黄提取物、大黄素体外对轮状病毒的作用效果。结果在轮状病毒感染细胞不同阶段加入大黄提取物后,病毒诱导的CPE程度明显减轻,且有量-效关系。用MTT法检测细胞活性,计算大黄提取物对轮状病毒入侵细胞的阻断作用、直接灭活作用及对病毒增殖抑制作用的半数有效浓度(IC50)分别为:(101.08±1.57)mg/L、(111.27±4.94)mg/L、(46.88±3.50)mg/L;三种作用方式的治疗指数(TI)分别为:(3.13±0.13)、(3.45±0.06)、(7.45±0.56)。大黄素混合液对轮状病毒三种作用方式的抑制作用的IC50分别为:(35.94±6.80)mg/L、(12.25±0.93)mg/L、(13.65±1.08)mg/L;TI分别为:(0.37±0.07)、(1.07±0.08)、(0.95±0.08)。结论大黄提取物在体外具有较好抗轮状病毒作用,大黄素对轮状病毒的作用不明显。

关键词：大黄轮状病毒 ma-104细胞抗病毒作用