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禽流感病毒HA2合成肽与m2e重组蛋白免疫保护作用的初步研究

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禽流感病毒HA2合成肽与M2e重组蛋白免疫保护作用的初步研究

作者：何雯雯安徽农业大学

学位级别：硕士

禽流感(Avian Influenza，AI)是由A型流感病毒(InfluenzaAvirus，AIV)引起的禽类疾病综合征，该病传播迅速，传染性极强。AIV不仅能感染禽类，也能感染人，是危害人类健康和养禽业的最重要传染病之一，给人类生活和生产造成了重大损失... 详细信息

禽流感(Avian Influenza，AI)是由A型流感病毒(InfluenzaAvirus，AIV)引起的禽类疾病综合征，该病传播迅速，传染性极强。AIV不仅能感染禽类，也能感染人，是危害人类健康和养禽业的最重要传染病之一，给人类生活和生产造成了重大损失。目前AIV根据血凝素(Hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase，NA)可分为17个HA亚型和9个NA亚型，HA和NA具有高度变异性，同时各亚型流感病毒间也缺乏有效的交叉保护，这都制约了禽流感的有效防控及其疫苗的发展。HA是流感病毒表面主要的保护性抗原之一，能诱导机体产生中和抗体，含有多个T/B细胞表位，HA2位于HA的C端，含有高度保守的融合序列，基于HA2保守区域的通用疫苗研究一直是一个热点。基质蛋白2(matrix protein2，m2)是流感病毒表面的跨膜蛋白，由97个氨基酸组成，膜蛋白m2的氨基酸序列高度保守，尤其是N端仅由23个氨基酸残基组成的胞外区(m2extracellular domain，m2e)，尽管经历了四次世界性的流感大流行，都未发现明显差异，故有可能发展成为具有交叉保护力的“通用流感疫苗”的候选抗原。为了寻找具有广谱保护作用的通用流感疫苗，本研究根据中国H5和H9亚型流感病毒的流行情况，针对流感病毒HA2基因的保守区域设计合成多肽，同时以流感病毒高度保守的m2e基因为基础，表达重组蛋白，并通过攻毒保护试验，比较和评价HA2合成肽与m2e重组蛋白对BALB/c小鼠的免疫保护作用，为广谱型流感疫苗的深入研究提供一定的基础。具体研究内容如下：1.禽流感病毒HA2合成肽免疫保护性的初步研究通过比对GenBank中国H5和H9亚型流感病毒HA基因，针对HA2亚单位的保守区域设计合成多肽并在其末端耦联载体蛋白。用合成的多肽(LAH-KLH)、LAH-KLH+CpG、KLH、PBS与弗氏佐剂混合后分别于第0周和第3周肌肉注射BALB/c小鼠，二免两周后采集小鼠血清用eLISA检测LAH特异性IgG及IgG1/IgG2a/IgG2b，同时分离脾脏细胞和肺脏细胞用eLISPOT检测LAH特异性T/B细胞的数量，并通过攻毒保护试验、攻毒后肺脏病毒滴定及肺脏病理变化的观察来衡量HA2合成肽的免疫效果。eLISA结果显示，仅LAH-KLH+CpG免疫组检测到了与PBS对照组有极显著差异(p﹤0.01)水平的LAH特异性IgG，抗体亚型分析结果表明，LAH-KLH+CpG免疫组能诱导IgG1/IgG2a/IgG2b的分泌，但以IgG1为主。eLISPOT结果显示，在LAH肽段刺激下，LAH-KLH+CpG免疫组小鼠每1×106个脾淋巴细胞分泌IFN-γ形成的斑点数约为80个，与PBS对照组差异极显(p﹤0.01)，表明CpG促进HA2合成肽既诱导产生TH1型免疫应答，也能诱导产生TH2型免疫应答，且CpG能够有效增强HA2合成肽的免疫应答水平。攻毒试验结果显示，HA2合成肽不能对CXG11(H5N1)禽流感病毒的攻击不能提供有效的保护，仅能降低病毒在肺脏中的滴度，减轻对肺脏的病理学损伤。2.禽流感病毒m2e重组蛋白免疫保护性的初步研究通过比对GenBank中H5和H9亚型流感病毒的m2基因，分别选择H5和H9的m2基因N端由23个氨基酸组成的胞外域(m2e)序列进行合成，并将四个H5m2e和H9m2e分别与三个位于HA246-260T细胞表位交叉串联，在其末端添加酵母转录因子，然后克隆到pGeX-6p-1载体中，表达重组蛋白—SH5m2e、SH9m2e。SDS-PAGe和Western-blot分析表明，重组蛋白(SH5m2e、SH9m2e)均成功表达，而后纯化获得高纯度产物。经纯化后的重组蛋白(SH5m2e、SH9m2e)与弗氏佐剂混合后肌肉注射BALB/c小鼠，二免两周采集各组小鼠血清并用eLISA检测m2e和HA特异性IgG及IgG1/IgG2a/IgG2b，同时分离脾脏细胞，用eLISPOT检测m2e和HA特异性T细胞的数量，并通过攻毒保护试验、攻毒后肺脏病毒滴定及肺脏病理变化的观察来综合评价重组蛋白(SH5m2e、SH9m2e)的免疫保护效力。eLISA结果显示，重组蛋白(SH5m2e、SH9m2e)能诱导产生m2e特异性IgG，抗体亚型结果显示，重组蛋白(SH5m2e、SH9m2e)能诱导IgG1/IgG2a/IgG2b的分泌，但以IgG1为主。而仅SH9m2e能诱导产生HA特异性IgG与IgG1。eLISPOT结果显示，在m2e肽段刺激下，各免疫组小鼠每1×106个脾淋巴细胞分泌IFN-γ形成的斑点数约为150个，在HA肽段刺激下，各免疫组小鼠每1×106个脾淋巴细胞分泌IFN-γ形

关键词：禽流感病毒 HA2合成肽 m2e 重组蛋白免疫保护效力

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m2e合成肽流感通用疫苗的研究

中国动物传染病学报 2013年第1期21卷 1-7页

作者：杨馥如于海马继红周艳君童光志中国农业科学院上海兽医研究所上海200241

m2蛋白是甲型流感病毒的跨膜蛋白,其优点为不易变异,且N端24个氨基酸组成的胞外区(m2e)十分保守,适合作为通用流感疫苗的靶标。因此本实验将4个拷贝的m2e通过赖氨酸与通用Th细胞表位偶联获得m2e分支肽(m2e-mAP),添加弗氏佐剂制备成合成... 详细信息

m2蛋白是甲型流感病毒的跨膜蛋白,其优点为不易变异,且N端24个氨基酸组成的胞外区(m2e)十分保守,适合作为通用流感疫苗的靶标。因此本实验将4个拷贝的m2e通过赖氨酸与通用Th细胞表位偶联获得m2e分支肽(m2e-mAP),添加弗氏佐剂制备成合成肽疫苗免疫小鼠,评价其免疫原性及异源攻毒保护效力。eLISA实验结果表明,该疫苗能刺激机体产生高水平的抗m2e特异性IgG抗体;细胞因子IL-4的检测进一步说明了其能诱导产生高的体液免疫应答水平,eLISPOT实验从IL-4和IFN-γ两个方面分别说明了该疫苗不仅可以诱导高的体液免疫应答,而且能刺激机体产生高水平的细胞免疫应答。对免疫小鼠攻H9N2,通过肺病毒分离滴定和肺组织病理切片等方法检测攻毒保护效果,结果均表明,m2e分支肽疫苗能对异源病毒的攻击产生较好的保护效力。上述结果为流感通用疫苗的研究提供了一种参考思路。

关键词： m2e 通用疫苗免疫交叉保护

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A型流感病毒m2e单克隆抗体的研制及鉴定

实用预防医学 2009年第3期16卷 660-662页

作者：王云龙路晓娅李智涛王国强徐桂超王真李玉林河南师范大学河南新乡453002 郑州职业技术学院河南省生物工程技术研究中心

目的制备A型流感m2e(2-24)单克隆抗体,并进行初步研究。方法以m2e-OVA免疫BALB/c小鼠,取免疫后的小鼠脾细胞和SP2/0细胞融合,经有限稀释法克隆化及筛选,获得抗m2e(2-24)的杂交瘤细胞株,制备腹水,并对其进行纯化,分析和鉴定。结果获得3... 详细信息

目的制备A型流感m2e(2-24)单克隆抗体,并进行初步研究。方法以m2e-OVA免疫BALB/c小鼠,取免疫后的小鼠脾细胞和SP2/0细胞融合,经有限稀释法克隆化及筛选,获得抗m2e(2-24)的杂交瘤细胞株,制备腹水,并对其进行纯化,分析和鉴定。结果获得3株稳定分泌m2e单克隆抗体的杂交瘤细胞株L1,L2,L3,其免疫球蛋白亚类均为IgG1,腹水效价为105以上。结论成功制备了抗m2e(2-24)的特异性单克隆抗体,为研制具有交叉保护作用的流感疫苗奠定了基础。

关键词： A型流感病毒 m2e 单克隆抗体

表达禽流感病毒m2e转基因堆型艾美耳球虫的构建

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表达禽流感病毒M2e转基因堆型艾美耳球虫的构建

Apoferritin nanoparticle based dual-antigen influenza conjugate vaccine with potential cross-protective efficacy against heterosubtypic influenza virus

中国畜牧兽医学会兽医寄生虫学分会第十三次学术研讨会

作者：张思新汤新明刘贤勇中国农业大学动物医学院

目的:禽流感严重危害畜牧业,而人类感染禽流感病例的出现使得其更加受到公众的关注。因此,作为防控禽流感的有效手段,安全有效的新型禽流感疫苗研究追在眉睫。为研究堆型艾美耳球虫作为活载体表达及运输禽流感病毒抗原的可能性,我们构... 详细信息

目的:禽流感严重危害畜牧业,而人类感染禽流感病例的出现使得其更加受到公众的关注。因此,作为防控禽流感的有效手段,安全有效的新型禽流感疫苗研究追在眉睫。为研究堆型艾美耳球虫作为活载体表达及运输禽流感病毒抗原的可能性,我们构建了表达禽流感病毒m2e抗原的转基因堆型艾美耳球虫。方法:我们构建了融合表达多拷贝m2e基因、黄色荧光蛋白(YFP)、红色荧光蛋白(RFP)和乙胺嘧啶抗性基因(DHFR-TS3m)的球虫转染载体,将其转染堆型艾美耳球虫子孢子后,经翅下静脉将转染的子孢子接到鸡体内。收取接种后5-9天的卵囊并在荧光显微镜下观察。通过流式细胞术分选出表达黄色荧光的卵囊并口服接种鸡,同时在饲料中添加100 mg/kg的乙胺嘧啶进行药物压力筛选,收集后代卵囊。此后进行连续的流式分选和药物压力传代。结果:通过静脉接种转染的艾美耳球虫子孢子,我们得到了第一代发荧光的卵囊,通过流式细胞术分选出发荧光的卵囊270个,发光率为0.3%。在1 00 mg/kg乙胺嘧啶药物筛选下,第二代卵囊发光率达到3%。结论:本研究实现了堆型艾美耳球虫的稳定转染,为后续进行基于转基因堆型艾美耳球虫的禽流感免疫保护研究提供了良好开端。

关键词：堆型艾美耳球虫转染 YFP RFP m2e

来源： cnki会议评论

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Particuology 2022年第5期20卷 56-64页

作者： Yanan Sheng Jiangxue Wei Zhengjun Li Zhiguo Su Guanghui ma Songping Zhang State Key Laboratory of Biochemical engineering Institute of Process EngineeringChinese Academy of SciencesBeijing 100190China University of Chinese Academy of Sciences Beijing 100049China

Ferritin nanoparticles with self-assembling properties have been widely explored as vaccine carrier by displaying foreign antigens through genetic fusion *** the present work,an apoferritin(AFt)nanoparticle was tested as influenza vaccine carrier by chemically conjugating a matrix protein 2 ectodomain(m2e)antigen peptide or/and the full-length hemagglutinin(HA)antigen on the outer surface of the AFt,with heterobifunctional sSmCC or Sm(PeG)_(24) containing PeG chain as *** each AFt nanoparticle,about 30-32 m2e or 1.8 HA antigen could be *** AFt-(PeG)24-m2e,in which the m2e was coupled through Sm(PeG)_(24) containing PeG chain,conferred higher protective efficacy in immunized mice than AFt-m2e did,but was less effective than AFt-(PeG)_(24)-*** both m2e and HA were coupled,the synthesized dual-antigen vaccine candidate AFt-(PeG)_(24)-m2e/HA elicited high level of m2e and HA antigen-specific antibodies and conferred 100%protection against lethal infection of homologous PR8 HI N1 virus strain and 70%protection against a heterologous A/Fm/1/47(Fm1,H1N1)strain,which was more effective than the m2e or HA single antigen vaccine *** potential cross-protective effect of the dual-antigen vaccine was further demonstrated by significant specific hemagglutination inhibition(HAI)titers in serum of the immunized mice against three other heterologous viral strains including A/Singapore/GPl908/2015(IVR-180)H1N1,A/Anhui/1/2005 H5N1,and A/Hong Kong H3N2.

关键词： Influenza vaccine Apoferritin nanoparticle Hemagglutinin m2e Conjugate vaccine

以人结核杆菌hsp70为载体的“通用型”禽流感疫苗构建及免疫效力研究

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中国生物工程杂志 2009年第12期29卷 24-29页

作者：郑其升徐公豹侯红岩张雪花侯继波江苏省农业科学院国家兽用生物制品工程技术研究中心南京210014

化学合成H5N1亚型禽流感病毒m2蛋白N端胞外域基因序列3拷贝基因(3m2e),与人结核杆菌hsp70蛋白基因融合,克隆至原核表达载体peT-32a(+),构建表达载体peT-3m2e与peT-3m2e-hsp70。重组质粒转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导重组蛋白获得表达,通... 详细信息

化学合成H5N1亚型禽流感病毒m2蛋白N端胞外域基因序列3拷贝基因(3m2e),与人结核杆菌hsp70蛋白基因融合,克隆至原核表达载体peT-32a(+),构建表达载体peT-3m2e与peT-3m2e-hsp70。重组质粒转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导重组蛋白获得表达,通过镍亲和层析获得纯化的融合蛋白,利用Western blot鉴定重组蛋白免疫原性。将纯化的重组蛋白免疫20日龄的禽流感非免鸡,以人工合成的m2e与KLH偶联后免疫鸡作为阳性对照,以peT-32a(+)载体蛋白注射组作为阴性对照,初免后2周加强免疫。通过抗m2e抗体检测、细胞病变抑制试验与间接免疫荧光试验评价重组蛋白免疫后产生的体液免疫反应;利用流式细胞分群及细胞因子产量检测评价重组蛋白免疫后产生的细胞免疫反应。加强免疫后4周用100eID50的H9N2亚型AIV攻毒,通过Real-time PCR检测攻毒后3、5、7天免疫鸡泄殖腔棉拭子中病毒的含量。结果表明,重组蛋白3m2e hsp70免疫组能够刺激免疫鸡产生较高的抗体水平及细胞免疫应答,并且攻毒后泄殖腔棉拭子中病毒含量明显降低。

关键词：禽流感病毒 m2e 结核杆菌hsp70 免疫效力

以HBc颗粒为载体甲型流感通用疫苗的初步研究

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以HBc颗粒为载体甲型流感通用疫苗的初步研究

作者：花艳红中国人民解放军军事医学科学院

学位级别：硕士

【研究背景】流感病毒(Influenza virus )是一种能够引起严重性呼吸道传播疾病的正粘科属病毒。根据其内部核蛋白(NP)和基质蛋白(m)的抗原性不同,可分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三种类型。其中,甲型流感病毒曾引起多次大范围的流行,上世纪... 详细信息

【研究背景】流感病毒(Influenza virus )是一种能够引起严重性呼吸道传播疾病的正粘科属病毒。根据其内部核蛋白(NP)和基质蛋白(m)的抗原性不同,可分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三种类型。其中,甲型流感病毒曾引起多次大范围的流行,上世纪共出现四次大流行,最为严重的是1918年的大流感,造成了全世界5千多万人死亡。2009年世界范围内暴发的猪源性甲型流感病毒流行,传染性强,波及范围广,再次突显了甲型流感病毒感染的严重性及其对人类社会造成的巨大经济负担。接种疫苗是预防流感发生与传播的最有效方式。目前市场应用的流感疫苗主要有三种:全病毒灭活疫苗、裂解疫苗、亚单位疫苗。这些疫苗对同亚型流感病毒感染预防有效,但在不同亚型病毒之间的保护效果较弱。此外,流感病毒的变异速度非常快,流感疫苗每年都要更换,给疫苗的生产制备造成了诸多不便。世界卫生组织是依据当年全世界范围流感病毒变化情况来预测并推荐下一年流感疫苗生产用组分的,预测的准确度将会直接影响疫苗的保护效率,如预测失败将造成流感爆发流行的潜在威胁。因此,研制出一种具有广泛保护作用的通用型疫苗对于应对流感病毒突变后的突然爆发,迅速建立人群免疫屏障,阻断流感大流行蔓延,降低其危害性方面具有极其重要的实际意义。甲型流感通用疫苗的研发主要基于流感病毒基质蛋白胞外功能区m2e (ectodomain of matrix protein 2),其在各种甲型流感病毒中具有极高的保守性,且可诱导特异性保护抗体产生。此外还有高度保守的流感病毒核蛋白NP(Nucleoprotein),其表面具有多个细胞毒性T淋巴细胞(CTL)识别表位,可诱导细胞免疫。但m2e和NP表位的分子量小、免疫原性低、易降解,在体内难以产生足够的免疫反应。所以,使用结构复杂病毒蛋白作为免疫原性放大载体成为表位疫苗研发的热点。其中,乙肝病毒核心蛋白HBc(Hepatitis B virus core protein , HBc)蛋白具有天然的颗粒组装能力,能特异性激发针对外源表位的体液、细胞免疫。近年来,HBc颗粒的应用方面已经有了较成熟研究结果。疫苗研究中以HBc作为载体的疫苗抗原有很多,如乙肝病毒表面抗原、人乳头瘤病毒e7蛋白、B群链球菌CPS糖蛋白等,在临床前实验研究中已观察到肯定的疗效。因此,发展以HBc颗粒为载体的流感病毒表位疫苗研究具有很好的前景和应用价值。【目的】本研究的目的是构建以乙肝病毒核心蛋白(HBc)为载体的基于m2e蛋白的甲型流感通用疫苗抗原,利用杆状病毒表达系统及大肠杆菌表达系统表达、纯化和鉴定,并进行疫苗免疫效果初步评价,为发展安全、有效、具有广泛保护作用的甲型流感通用疫苗奠定基础。【方法与结果】第一部分sf9昆虫细胞表达甲型流感m2e通用疫苗抗原的构建、表达、纯化及鉴定通过基因工程方法,构建含m2e重复片段的3m2e-HBc-pFastBacHTA重组质粒。将该重组质粒与DH10Bac中的穿梭载体Bacmid同源重组,获得3m2e-HBc-Bacmid重组杆粒。提取杆粒DNA转染sf9昆虫细胞,得到含有重组杆状病毒。继续扩增病毒,感染细胞后,免疫荧光检测成功表达出3m2e-HBc目的蛋白。Western blot检测该蛋白具有免疫活性。利用pFastBacHTA载体上带有的组氨酸标签,进行亲和层析,纯化获得3m2e-HBc重组蛋白。电镜结果显示,3m2e-HBc目的基因可以通过杆状病毒sf9昆虫细胞表达系统表达并正确装配出病毒样颗粒。第二部分大肠杆菌表达甲型流感m2e-NP通用疫苗抗原的构建、表达、纯化及鉴定通过基因工程方法,构建并鉴定获得3m2e-NP-HBc-peT 21a重组表达质粒,并转化大肠杆菌细胞,IPTG诱导表达首先获得了包涵体形式表达的重组蛋白。经变性及复性纯化处理后,包涵体蛋白形成的重组病毒颗粒的状态不理想。经进一步优化诱导表达条件获得了部分可溶性表达的重组蛋白,Western blot检测证明该蛋白具有免疫活性。采用层析方法获得纯化的3m2e-NP-HBc重组蛋白。电镜观察结果显示,大肠杆菌表达的可溶性重组蛋白能够自动装配成大小约为30nm的病毒样颗粒。第三部分甲型流感通用疫苗免疫效果初步评价通过动物免疫实验,初步评价甲型流感通用疫苗的免疫应答效果及交叉保护作用。采用间接eLISA法、流式细胞术、eLISOPT技术,对疫苗在Balb/C小鼠体内的免疫应答效果进行了评估。在对大肠杆菌表达的流感通用疫苗评价的结果中显示,疫苗以滴鼻和腹腔注射两种途径免疫小鼠,均可以诱导产生针对不同亚型流感病毒的特异性体液及细胞免疫应答,并且滴鼻免疫能够激发更高的黏膜局部免疫应答,说明采用滴鼻免疫这种更接近于流感病毒自然感染途径的方式免疫对提高流感疫苗的保护效果具有重要意义。同

关键词：流感病毒 m2e NP HBc病毒颗粒通用流感疫苗

以枯草杆菌芽孢呈递系统为基础的新型流感疫苗基础研究

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以枯草杆菌芽孢呈递系统为基础的新型流感疫苗基础研究

作者：苗雨安徽医科大学

学位级别：硕士

目的:本研究利用枯草杆菌芽孢展示外源抗原的芽孢呈递技术，制备出表面展示流感病毒保守抗原m2蛋白胞外区（m2e）的重组芽孢，并作为流感病毒新型候选疫苗开展动物实验，对其免疫原性及免疫保护效果进行分析与评价，为发展以枯草杆菌芽... 详细信息

目的:本研究利用枯草杆菌芽孢展示外源抗原的芽孢呈递技术，制备出表面展示流感病毒保守抗原m2蛋白胞外区（m2e）的重组芽孢，并作为流感病毒新型候选疫苗开展动物实验，对其免疫原性及免疫保护效果进行分析与评价，为发展以枯草杆菌芽孢呈递系统为基础的新型流感疫苗奠定研究基础。方法:（1）将枯草杆菌CotB基因构建到基因组整合质粒pDG1664中，再将3个串联的m2e分子基因连接到CotB基因的下游，构建成重组质粒pDG1664-CotB-m2e3;通过同源重组的方式，将外源基因CotB-m2e3整合到PY79枯草杆菌基因组中。利用红霉素抗性筛选重组菌并挑取重组子单菌落进行培养，提取基因组以PCR扩增和测序方式鉴定是否正确整合了m2e抗原基因;通过SDS-PAGe、Western Blot鉴定芽孢蛋白中流感病毒m2e抗原的表达情况，并采用流式细胞术和免疫荧光方法进一步确定m2e抗原在芽孢表面的表达。利用形态学观察、API CH50和API20e生化实验及16s rRNA分析等实验对重组芽孢的生长状态、生化特征等进行了分析和鉴定。（2）为了进一步分析表达流感m2e的重组芽孢的免疫原性和免疫保护性，我们应用表达流感m2e的重组芽孢进行动物免疫和动物攻毒实验。在不使用佐剂的情况下用重组芽孢直接口服免疫小鼠，首次连续口服免疫3天，待首次免疫4周后再连续免疫3天，之后于距首次免疫5周时进行末次免疫，分别在首次免疫后5、7、9、11、13、15、17周尾静脉采血并分离血清进行体液免疫反应的检测和分析;同时利用流式细胞术检测细胞免疫水平;通过攻毒保护性试验对这种新型候选疫苗进行免疫保护性评价。结果：（1）表达流感病毒m2e的重组枯草杆菌芽孢的制备及鉴定：优化条件后，采用电转化方法将pDG1664-CotB-m2e3重组质粒转化至PY79感受态菌;转化菌经PCR检测和基因测序鉴定表明，重组芽孢基因组中正确整合了m2e抗原基因。重组芽孢经SDS-PAGe和Western Blot分析证实，流感病毒m2e抗原在重组芽孢中成功表达;采用流式细胞术和免疫荧光方法检测进一步确定了m2e抗原表达呈递在重组芽孢表面，形成的重组芽孢表面蛋白（CotB-m2e融合蛋白）分子量约为37kDa。实验研究表明，我们成功制备出整合了m2e基因重组枯草芽孢菌株（命名RSm2e31）。利用电子显微镜检测技术及重组芽孢传代培养，进行重组芽孢形态学观察和分析，实验结果表明重组菌株RSm2e31能与野生株一样形成芽孢，并且外源基因能够在重组杆菌芽孢中稳定存在;对重组芽孢菌进行的生化反应（API CH50及API20e）实验及16s rRNA测序结果分析表明，重组株仍属于枯草芽孢杆菌属。重组芽孢的生长状态如菌落形成和生化反应等虽然与野生枯草芽孢杆菌有稍许变化，但重组株的基本生化特性与野生株具有较好的一致性。（2）表达流感病毒m2e的重组枯草杆菌芽孢免疫原性及免疫反应特征分析：为了进一步分析表达流感m2e的重组芽孢的免疫原性和观察其免疫反应特征，本研究采用口服免疫的方式免疫小鼠进行实验研究。小鼠免疫实验结果表明，RSm2e31重组芽孢不添加佐剂进行口服免疫能够诱导出良好的体液免疫应答，并且免疫后17周抗体水平处于较高的水平（1:11200）。抗体亚类分析表明重组芽孢诱导的IgG抗体以IgG1为主。进一步取免疫小鼠脾细胞进行的胞内细胞因子流式检测发现，RSm2e31重组芽孢免疫可以有效诱导m2e抗原特异性Th2型细胞免疫应答。小鼠肺和肠灌洗液sIgA检测发现，重组芽孢还能够诱导机体产生一定的粘膜免疫应答。（3）表达流感病毒m2e的重组枯草杆菌芽孢疫苗的攻毒保护性实验研究：采用A/PR/8/34(H1N1)流感病毒以103TCID50剂量对免疫后17周小鼠进行攻毒保护性实验。野生株芽孢免疫组、PBS对照免疫组小鼠的存活率仅为10%，而RSm2e31重组芽孢免疫小鼠全部存活。肺组织病毒滴度检测发现，RSm2e31重组芽孢免疫小鼠肺组织病毒滴度显著降低，表明体内病毒复制得到有效抑制。由此可见，RSm2e31重组芽孢具有良好的免疫保护作用。结论:本研究针对流感病毒m2e保守性抗原建立了枯草杆菌芽孢呈递技术方法，制备出在枯草杆菌芽孢表面稳定表达外源m2e蛋白的重组株。获得的重组芽孢免疫小鼠不仅诱导产生了有效地体液免疫反应和细胞免疫反应，也产生了粘膜免疫反应;表达流感病毒m2e的重组枯草芽孢疫苗免疫小鼠使其对病毒的感染产生了完全保护作用。该研究是对发展以枯草芽孢呈递系统为基础的新型口服流感疫苗的创新性探索，为其深入研究奠定了基础。

关键词：枯草杆菌芽孢流感 m2e 疫苗

噬菌体展示候选甲型流感病毒和乙型流感病毒联合疫苗的构建及免疫原性研究

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噬菌体展示候选甲型流感病毒和乙型流感病毒联合疫苗的构建及免疫...

作者：徐军中国协和医科大学

学位级别：硕士

流行性感冒是一种非常严重的全球性的呼吸道传染病。在流感流行期间，全球有10—20％的人口感染流感病毒，每年造成三百万至五百万严重病例和250，000至500，000例死亡。对流感的预防尚无非常有效的方法，接种疫苗是目前最有效的途径。... 详细信息

流行性感冒是一种非常严重的全球性的呼吸道传染病。在流感流行期间，全球有10—20％的人口感染流感病毒，每年造成三百万至五百万严重病例和250，000至500，000例死亡。对流感的预防尚无非常有效的方法，接种疫苗是目前最有效的途径。血凝素(HA)和神经氨酸(NA)是存在于病毒表面易感的大型糖蛋白，且具有强的免疫原性，是非常好的疫苗抗原。现在市场上的疫苗都将血凝素(hemagglutinin，HA)和神经氨酸(neuraminidase，NA)作为主要或唯一病毒抗原。血凝素(HA)和神经氨酸(NA)基因的改变和重排，是通过疫苗接种控制流感流行的主要障碍。因此，流感病毒能够重复感染并使得每年需要新的疫苗进行免疫接种。开发基于流感病毒不变区域，能产生广谱的交叉免疫反应的普适性流感疫苗是迫切需要的。由病毒基因编码的m2蛋白是一个四聚体离子通道，在病毒颗粒中少量表达或不表达，但却在被病毒感染的细胞表面大量表达。m2蛋白膜外区(m2e)由24个氨基酸残基组成，并且不发生基因漂移和变异。自1918年西班牙流感大流行至今，虽然其间发生了无数次的流感流行和三次全球性大流行，m2e序列基本保持不变。研究表明，不同构造形式的基于m2e的疫苗能够提供保护性免疫。乙型流感病毒的Bm2蛋白由109个氨基酸残基组成，是乙型流感病毒编码的血凝素(HA)、神经氨酸(NA)和NB糖蛋白之外的第四个膜内在蛋白。Bm2具有离子通道活性，荧光显微镜显示Bm2表达于为感染细胞表面。虽然Bm2在乙型流感病毒生活周期中有着自己特有的功能，但是Bm2还是被认为具有和m2蛋白在甲型流感病毒中相似的功能，可能能作为通用乙型流感病毒的候选表位。流感病毒研究中常用的是小鼠动物模型不能在小鼠间传播，而豚鼠不但能对未经适应性改变的流感病毒敏感，流感病毒也能在豚鼠中以飞沫传播，因此豚鼠可以作为流感病毒传染研究的新动物模型。噬菌体疫苗是以噬菌体作为疫苗载体，将特异表位展示在噬菌体颗粒表面，构建成不同表位特异的噬菌体疫苗，具有病毒样颗粒特性，能引发强的针对表位的特异性免疫应答。鼻腔免疫是近年发展起来新的粘膜免疫途径，它通过抗原在鼻粘膜的释放，诱导系统和粘膜免疫应答。研究表明，由T细胞、B细胞、树突细胞以及包括m细胞的隐窝吸收上皮细胞组成的鼻粘膜相关淋巴组织(nose associated lymphoid tissue，NALT)，是鼻腔免疫的诱导部位。壳聚糖是一个新型的缓控释疫苗呈递系统载体，能安全而有效地促进鼻腔吸收微球疫苗。本文利用基因重组将m2e&Bm2多表位基因片断与T7 10B衣壳蛋白基因融合构建噬菌体候选疫苗，PCR鉴定为阳性的噬菌体候选疫苗扩增后用甲醛灭活。用10pfu剂量的噬菌体微球联合流感候选疫苗经鼻腔免疫豚鼠，并用10pfu的H3N2、H1N1和B型流感病毒分别对经候选疫苗免疫和未经候选疫苗免疫的豚鼠进行攻击，分别检测上呼吸道(upstream respiratory tract，URT)和肺部流感病毒滴度，对比研究候选疫苗对病毒感染的保护作用。 eLISA检测血清IgG水平发现，噬菌体微球联合流感候选疫苗具有特异性免疫原性，能诱导产生针对m2e和Bm2的特异性抗体。对病毒感染的豚鼠呼吸道内的病毒滴度检测表明，噬菌体微球联合流感候选疫苗对豚鼠的全呼吸道具有抗H3N2和H1N1的保护作用;对乙型流感病毒感染的豚鼠上呼吸道候选疫苗无保护效果，肺部有一定的保护效果。因此，(1)构建的噬菌体微球联合流感候选疫苗经鼻腔免疫能有效诱导特异性体液免疫，产生特异性抗体(m2e&Bm2);(2)候选疫苗诱导的m2e抗体对感染H3N2和H1N1的豚鼠的全呼吸道有保护作用;(3)候选疫苗诱导的Bm2抗体对感染乙流感病毒的豚鼠肺部有保护作用而对上呼吸道无保护效果。

关键词：流感候选疫苗 m2e Bm2 豚鼠动物模型噬菌体疫苗