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基于聚合酶链式反应灵敏检测5-羟甲基胞嘧啶

基于聚合酶链式反应灵敏检测5-羟甲基胞嘧啶

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作者：于智琦河北大学

学位级别：硕士

5-羟甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine,5hmC)是一种重要的DNA表观遗传修饰。因其在5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5mC)后被发现的,所以也被称为“第六种碱基”。5hmC广泛存在于哺乳动物的组织和细胞中,但在不同组织间存在差异分布... 详细信息

5-羟甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine,5hmC)是一种重要的DNA表观遗传修饰。因其在5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5mC)后被发现的,所以也被称为“第六种碱基”。5hmC广泛存在于哺乳动物的组织和细胞中,但在不同组织间存在差异分布。先前的研究表明,5hmC的异常表达通常与一些发育性疾病、神经系统疾病以及肿瘤等密切相关,因此,5hmC的灵敏检测能够对上述疾病起到评估或预测作用。然而,5hmC与5mC的结构具有高度相似性,而丰度仅约为后者的十分之一甚至百分之一,且5hmC随机分布在DNA序列中约80%的Cp G位点,开发准确、灵敏、高特异性的5-hmC分析方法是一项充满挑战且十分必要的工作。本研究基于***甲基转移酶催化5hmC氨衍生化和实时荧光定量PCR技术开发了一种快速、灵敏、无需标记的5hmC荧光传感新方法。首先***催化巯基乙胺中的巯基取代5hmC中的羟基,发生5hmC的氨衍生化(NH-5hmC-双链DNA),然后催化剂催化NH-5hmC-双链DNA与5′端羧基修饰的支链DNA通过酰胺反应发生缩合,生成5hmC-双链DNA-支链DNA的三链复合物。切胶回收之后,以三链复合物中的支链DNA为模板,在引物和聚合酶作用下实行PCR扩增,产生实时荧光定量曲线,曲线的C值与5hmC浓度的负对数呈正相关,线性范围为100 f m-10 n m,达到5个数量级,检出限为33.5 f m,灵敏度较高。该方法具有良好的选择性,能够排除C和5mC的干扰,并且能够应用于复杂基质血清中5hmC水平的检测,能够准确定量小鼠不同组织基因组中的5hmC含量,展现出临床应用潜能。

关键词： 5-羟甲基胞嘧啶 m.hhai甲基转移酶聚合酶链式反应荧光分析

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