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猪流行性腹泻病毒中国地方流行株LJB/03m基因的克隆与序列分析

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中国兽医杂志 2005年第7期41卷 7-9页

作者：范京惠郎景华吴凌张海峰李一经东北农业大学动物医学学院黑龙江哈尔滨150030 哈尔滨市兽医卫生防疫站黑龙江哈尔滨150016 黑龙江八一农垦大学动物科技学院黑龙江密山158308

从黑龙江某猪场疑似猪流行性腹泻猪的粪便中提取总RNA,采用RT-RCR方法扩增,首次获得中国地方流行株PEDVm全基因序列,将其克隆到pmD18-T载体中进行测序,克隆的m基因核苷酸序列由681个核苷酸组成,含有一个完整的开放阅读框架,编码226个氨... 详细信息

从黑龙江某猪场疑似猪流行性腹泻猪的粪便中提取总RNA,采用RT-RCR方法扩增,首次获得中国地方流行株PEDVm全基因序列,将其克隆到pmD18-T载体中进行测序,克隆的m基因核苷酸序列由681个核苷酸组成,含有一个完整的开放阅读框架,编码226个氨基酸。与国外已发表的其他毒株进行基因进化分析,GenBank中的6株PEDV形成的基因进化树具有3个分支。其中分离株LJB/03形成一个独立的分支,说明LJB/03的m基因序列与其他毒株相比,发生了一定的变异。

关键词：流行性腹泻病毒 m基因克隆序列测定

2011年-2014年广西猪流行性腹泻病毒检测及其m基因的序列分析

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中国畜牧兽医 2015年第3期42卷 549-557页

作者：卢冰霞秦毅斌何颖李莹莹梁家幸黎珂钰李斌苏乾莲周英宁蒋冬福卢敬专闭炳芬梁保忠段群棚赵武广西兽医研究所广西畜禽疫苗新技术重点实验室南宁530001 广西大学动物科学技术学院南宁530005

本试验应用RT-PCR方法对2011年1月—2014年4月采自广西南宁、玉林等14个地区的331份仔猪腹泻粪便样品进行猪流行性腹泻病毒（PEDV）检测。结果显示331份样品中有210份为PEDV阳性,阳性率为63.44%。对其中25份阳性样品的PEDV m基因进行克... 详细信息

本试验应用RT-PCR方法对2011年1月—2014年4月采自广西南宁、玉林等14个地区的331份仔猪腹泻粪便样品进行猪流行性腹泻病毒（PEDV）检测。结果显示331份样品中有210份为PEDV阳性,阳性率为63.44%。对其中25份阳性样品的PEDV m基因进行克隆和测序,将测序结果与GenBank中PEDV参考毒株的m基因序列进行同源性比对分析并构建系统进化树。25个PEDV m基因序列与51个参考毒株m基因的核苷酸和氨基酸同源性分别为96.0%~99.9%、94.3%~99.6%。PEDV m基因遗传变异分析结果表明,广西2013年—2014年的PEDV流行毒株与北京、安徽、武汉、河北、广东等地2010年—2013年的流行毒株亲缘关系较近,而与中国早期分离株CH/S（GenBank登录号：JN547228）、疫苗株CV777（GenBank登录号：AF353511）和Attenuated DR13（GenBank登录号：JQ023162）的遗传距离较远。提示广西现流行的PEDV与早期毒株相比已发生较为明显的变异。

关键词：猪流行性腹泻病毒(PEDV) m基因遗传变异

鹅源新城疫病毒m基因的原核表达及其多克隆抗体制备

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江苏农业学报 2012年第1期28卷 125-130页

作者：段志强胡娇胡增垒王郁杨朱杰胡顺林刘秀梵扬州大学兽医学院农业部畜禽传染病学重点开放实验室江苏扬州225009

试验旨在制备原核表达鹅源新城疫病毒(NDV)JS/5/05/Go株m蛋白的多克隆抗体并进行鉴定。以鹅源NDV总RNA为模板,RT-PCR扩增m基因,亚克隆到原核表达载体pET-32a(+)获得重组质粒pET32a-m,转化*** BL21(DE3)菌株进行诱导表达,SDS-PAGE电泳检... 详细信息

试验旨在制备原核表达鹅源新城疫病毒(NDV)JS/5/05/Go株m蛋白的多克隆抗体并进行鉴定。以鹅源NDV总RNA为模板,RT-PCR扩增m基因,亚克隆到原核表达载体pET-32a(+)获得重组质粒pET32a-m,转化*** BL21(DE3)菌株进行诱导表达,SDS-PAGE电泳检测表达产物;用KCl染色切胶纯化法纯化重组蛋白;采用切胶免疫小鼠的方法制备m蛋白多克隆抗体,抗体效价用间接ELISA检测,特异性用Western blot和间接免疫荧光法鉴定。结果表明,在大肠杆菌中成功表达了分子量约为55 000的重组蛋白,用切胶纯化法获得了纯度较高的重组蛋白;ELISA法检测抗体效价可达1∶102 400,Western blot和间接免疫荧光试验结果表明制备的多克隆抗体能够特异性识别纯化的m蛋白及NDV自身表达的m蛋白。

关键词：鹅源新城疫病毒 m基因原核表达多克隆抗体

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猪传染性胃肠炎m基因的克隆及序列分析

猪传染性胃肠炎M基因的克隆及序列分析

作者：王玉洁西北农林科技大学

学位级别：硕士

猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible Gastroenteritis Virus, TGEV)属于冠状病毒科冠状病毒属，其可导致猪传染性胃肠炎。对养猪业危害性极大。抗毒素和抗生素等常规药物对本病无任何治疗作用，预防该病的有效方法是疫苗接种。本研究... 详细信息

猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible Gastroenteritis Virus, TGEV)属于冠状病毒科冠状病毒属，其可导致猪传染性胃肠炎。对养猪业危害性极大。抗毒素和抗生素等常规药物对本病无任何治疗作用，预防该病的有效方法是疫苗接种。本研究以猪传染性胃肠炎病毒感染的乳猪小肠病料为材料，自行设计两对引物，通过套式（RT-nested）PCR 及普通的RT-PCR扩增出猪传染性胃肠炎病毒m基因全序列，经测序、同源性比较后，进行深入的分析，主要研究结果如下： 1．本试验以乳猪小肠组织病料为材料，用Trizol法提取总RNA，经甲醛凝胶变性电泳，能清晰的看到28s、18srRNA两条亮带以及一条较弱的5srRNA带。结果表明，所提取的RNA完整性好，没有发生降解，完全可以用于RT-PCR反应。 2．根据GeneBank中发表的猪传染性胃肠炎病毒m基因序列，利用软件设计两对引物（外引物和内引物），在普通的RT- PCR方法基础上，建立了 RT-nested PCR体系，扩增出猪传染性胃肠炎病毒m基因的全序列，使用内外引物扩增的片段长度分别为1037bp、 1328bp 。结果表明，用双引物的RT-nested PCR较普通的RT- PCR扩增方法更具特异性，重复性好，能很好的避免病毒检测时假阳性的出现。且较传统的方法如电镜技术、免疫荧光技术、ELISA等更方便可靠，完全可以作为一种新型的、特异性强的病毒检测的方法。 3．利用 RT- PCR 方法，扩增出猪传染性胃肠炎病毒 m 基因全序列，长度为 1 328 bp，扩增产物经回收、转化,克隆在 pGEm-T Easy 载体的 T 位点上。用 EcoRⅠ酶切鉴定重组质粒 DNA，挑选出阳性克隆菌，进行序列测定后。利用 CLUSTAL（1.82）软件进行同源性分析。结果显示，扩增的猪传染性胃肠炎病毒 m 基因序列与 GeneBank 中登录号为 AY587883 和 AF302262 的猪传染性胃肠炎病毒 m 基因的核苷酸序列同源性分别为 97.2%， 97.3%。氨基酸同源性分别为 97.3%，98.0％。软件分析表明，各有 22 处和 21 处碱基发生了突变，其中一处碱基发生了缺失，7 个和 5 个氨基酸发生了转换。本研究不仅为对TGEV进行深入的分子生物学研究提供了资料，为其基因工程疫苗的研制奠定了基础，并且也为该病毒的鉴定提供了一个便捷有效的方法，对猪传染性胃肠炎的防治有重要的现实意义。

关键词：猪传染性胃肠炎病毒 m基因克隆序列分析

广西6株狂犬病分离毒株P和m基因的克隆和序列分析

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广西6株狂犬病分离毒株P和M基因的克隆和序列分析

作者：盘龙波广西大学

学位级别：硕士

为了探讨广西狂犬病病毒在分子水平上的变异规律,本试验应用RT-PCR技术,通过NSm1/NSm2引物,对6个广西毒株GXNN2、GXPL、GXPXD、GXQZD、GXYZD和GXNND的P和m基因进行扩增、克隆和测序。将克隆的P和m基因ORF的核苷酸及其推导的氨基酸序列,... 详细信息

为了探讨广西狂犬病病毒在分子水平上的变异规律,本试验应用RT-PCR技术,通过NSm1/NSm2引物,对6个广西毒株GXNN2、GXPL、GXPXD、GXQZD、GXYZD和GXNND的P和m基因进行扩增、克隆和测序。将克隆的P和m基因ORF的核苷酸及其推导的氨基酸序列,与本实验室已测定的23株及国内外公开发表的16株狂犬病病毒相应序列进行同源性和遗传进化树分析。结果显示,不管基于P基因还是m基因,进化树分析表明,广西狂犬病分离毒株都可分为3个群:Ⅰ群、Ⅱ群、Ⅲ群。Ⅰ群包括GXHX82、GXHXB、GXLC9、GXQZD、GX08、GXNND、GXHX、GX014、GX195、GXLB、GXSL、GXWXp、GX260、GX01、GX09、GX091和GXLA共17株,Ⅱ群包括GXLCC、GXPL、GXYZD、GXBm、GX219、GX304、GXLA11、GXNN2、GX074、GXPX和GXPXD共11株,Ⅲ群仅有GXN119株。本次克隆的6个毒株中,GXQZD和GXNND株属于Ⅰ群,GXPL、GXYZD、GXNN2和GXPXD属于Ⅱ群。同源性分析表明,本次克隆的6个毒株P基因编码区核苷酸及其推导的氨基酸序列同源性分别在85.8%—99.6%和91.2%—99.7%之间;m基因的分别在89.7%—100%和96%—100%之间。此6株与之前测序的23个广西毒株P基因编码区核苷酸及其推导的氨基酸序列同源性分别在85%—100%和90.2%—100%之间,m基因的分别在88.5%—100%和95.5%—100%之间。比较的P基因和m基因的氨基酸特异位点,结果发现,广西毒株P基因氨基酸第69、70、130和131位属于Ⅰ群毒株特异性位点;第134、135、140和151位为Ⅱ群毒株特异性位点;第73、162、167、174、240、253和281位为Ⅲ群特异性位点;第90位为广西Ⅰ、Ⅱ群共有的特异性位点;第57,63和241位属于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ群毒株共有的特异性位点;广西毒株m基因氨基酸第17和20位属于Ⅱ群毒株特异性位点。

关键词：狂犬病病毒 P基因 m基因多态性分析

新城疫病毒长春株NP、P、m基因的序列分析及其HN基因重组蛋白的免疫原性研究

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新城疫病毒长春株NP、P、M基因的序列分析及其HN基因重组蛋白的免...

作者：王承宇中国人民解放军军需大学

学位级别：硕士

从我国长春地区分离、鉴定了一株新城疫病毒(NDV)，命名为长春株。对NDV长春株部分生物学特性研究结果表明，长春株能凝集鸡和人(O型血)的红细胞，不能凝集猪、牛、山羊、绵羊和马的红细胞，mDT大于168h，ICPI为0.25，IVPI为0，表明长... 详细信息

从我国长春地区分离、鉴定了一株新城疫病毒(NDV)，命名为长春株。对NDV长春株部分生物学特性研究结果表明，长春株能凝集鸡和人(O型血)的红细胞，不能凝集猪、牛、山羊、绵羊和马的红细胞，mDT大于168h，ICPI为0.25，IVPI为0，表明长春株为一株弱毒株。参考新城疫病毒相关毒株基因组序列设计了3对特异性引物，通过RT-PCR一次性扩增了NDV长春株NP、P、m蛋白基因编码区(ORF)序列，序列分析结果表明，NP、P、m基因的ORF长度分别为1470、1188、1095bp，分别编码490、396和365个氨基酸，与发表的NDV La sota、B1等13株相关基因相比较，核苷酸序列同源性分别为85.7％～99.1％、82.8％～96.9％、84.3％～99.7％，推导的氨基酸序列同源性分别为92.5％～99.3％、84.3％～95.9％、88.9％～99.1％。对NP、P、m基因同源性比较和系统发育进化树分析结果表明，长春株与La sota、B1等弱毒株之间具有很近的亲缘关系，与生物学特性研究结果相一致。用Bac-to-Bac系统表达的长春株HN重组蛋白加弗氏完全和不完全佐剂制成抗原A和B，分两次免疫15日龄雏鸡，用间接ELISA和HI测定鸡体内抗体效价，结果表明，表达的NDV HN重组蛋白能诱导鸡体产生抗NDV HN蛋白抗体和HI抗体，能够抵抗NDV强毒攻击。

关键词：新城疫病毒NP基因 P基因 m基因序列分析 HN基因重组表达蛋白免疫原性

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中国狂犬病毒P和m基因分子生物学特征研究

中国狂犬病毒P和M基因分子生物学特征研究

作者：王晓光内蒙古农业大学

学位级别：硕士

本研究从国内外研究较少的狂犬病毒P、m基因出发,针对中国广西、贵州、湖南、江苏、安徽和云南六省区狂犬病人、犬阳性脑组织标本通过RT-PCR方法扩增目的基因来测定P、m基因编码区全序,利用来源于GenBank中不同国家地区代表不同基因型... 详细信息

本研究从国内外研究较少的狂犬病毒P、m基因出发,针对中国广西、贵州、湖南、江苏、安徽和云南六省区狂犬病人、犬阳性脑组织标本通过RT-PCR方法扩增目的基因来测定P、m基因编码区全序,利用来源于GenBank中不同国家地区代表不同基因型的狂犬病毒株P、m基因序列信息在分子水平进行P、m基因序列同源性分析、主要功能位点比较和种系发生分析,探讨中国狂犬病毒P、m基因分子生物学特征,为进一步研究狂犬病毒的分子结构提供基础数据。中国狂犬病毒P基因核苷酸与氨基酸序列同源性分别为81.8～100%和82.9～99.7%;m基因核苷酸与氨基酸序列同源性分别为88.7～100%和95.0～100%。PP与胞浆动力蛋白轻链(LC8)作用位点、PP与LP主要作用区域前19位氨基酸都高度保守,特定的蛋白激酶磷酸化丝氨酸位点、PP与NP相互作用主要区域第209～216位氨基酸仅个别位点发生变化,中部高变区第50～75位氨基酸位于核酸外导信号结构域内;mP调节病毒RNA转录和复制功能的第58位氨基酸、在病毒晚期芽生过程中起调节作用的PPxY结构域均高度保守,高变区第17～22位氨基酸位于N末端潜在的抗原决定簇内。P、m基因核苷酸水平的变异区存在于氨基酸水平同样的位置,核苷酸序列的变异多为同义突变。P、m基因系统进化分析显示所有中国标本P、m基因序列与其它基因1型序列形成独立的进化分支,具有中国地域特点:来源于同一省区的标本构成同一亚分支,趋向于同一进化群。对P、m基因的研究结果表明中国狂犬病毒均属于基因1型,序列同源性都比较高,具有共同的进化途径和基因结构特点,序列间差异规律明显,病毒分布具有独特的中国地域性特征,但序列的差异并不完全与病毒分离的行政地理区域相关,未严格按照行政地理分群。六省区狂犬病毒不但在同一省区内循环传播,而且在各个省区相邻地域之间相互传播,中国与东南亚国家的狂犬病毒株P、m基因具有较近的亲缘关系,中国云南省个别毒株可能和泰国毒株来源于共同的狂犬病毒。六省区所有狂犬病毒街毒株都来源于人和犬,人、犬分离株P、m基因全序列无明显差异,进化呈现由犬到人的方向,从病毒的来源角度证实了犬对人狂犬病的重要影响。

关键词：狂犬病毒 P基因 m基因分子特征

利用m基因鉴别新城疫病毒中强毒株与弱毒株RT-nPCR方法的建立

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中国动物传染病学报 2017年第5期25卷 21-25页

作者：朱小甫吴旭锦咸阳职业技术学院畜牧兽医研究所动物疫病分子生物学诊断实验室咸阳712000

根据GenBank上公开的新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)基因序列,针对m基因差异位点设计了3对引物,通过优化反应体系与条件,建立了能够区分NDV中强毒株与弱毒株的RT-nPCR检测方法。特异性试验显示,NDV中强毒株扩增出543、375 bp... 详细信息

根据GenBank上公开的新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)基因序列,针对m基因差异位点设计了3对引物,通过优化反应体系与条件,建立了能够区分NDV中强毒株与弱毒株的RT-nPCR检测方法。特异性试验显示,NDV中强毒株扩增出543、375 bp两个条带,弱毒株仅出现375 bp一个条带,其他常见禽病毒为阴性。灵敏度试验结果表明,该方法检测c DNA含量极限为6.15×10^(-4)ng/μL。临床样品检测发现鸡群NDV弱毒带毒率高,中强毒株带毒率较低。结果表明,本研究成功建立了一种基于m基因的快速鉴别诊断NDV中强毒株与弱毒株的RT-nPCR方法。

关键词：新城疫病毒中强毒株弱毒株 m基因鉴别诊断

2株PEDV贵州分离株m基因的克隆及相似性分析

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黑龙江畜牧兽医 2018年第17期 101-104页

作者：杨伟汤德元曾智勇王彬黄涛龙冬梅石远菊胡玲玲叶丽贵州大学动物科学学院

为了解贵州省猪流行性腹泻病毒（PEDV）分离株m基因的变异及分子进化情况,试验采用RT-PCR扩增、目的基因克隆与测序及生物信息学软件对贵州省分离的PEDV-GZAS株和PEDVGZHZ株m基因进行序列分析。结果表明：经RT-PCR扩增,得到的片段大小为... 详细信息

为了解贵州省猪流行性腹泻病毒（PEDV）分离株m基因的变异及分子进化情况,试验采用RT-PCR扩增、目的基因克隆与测序及生物信息学软件对贵州省分离的PEDV-GZAS株和PEDVGZHZ株m基因进行序列分析。结果表明：经RT-PCR扩增,得到的片段大小为695 bp;测序结果证实,贵州分离株m基因核苷酸序列大小为695 bp;贵州分离株PEDV-GZAS株与PEDV-GZHZ株之间同源性为84.2%;PEDV-GZHZ株与瑞士疫苗株（AF353511）之间的同源性为97.7%,与中国贵州（KF150217）、泰国（FJ158546）和美国（KF272920）分离株同源性最高为99.4%;贵州分离株PEDVGZAS株与瑞士疫苗株（AF353511）之间的同源性为97.5%,与中国贵州（KF150217）、泰国（FJ158546）和美国（KF272920）分离株同源性最高为99.3%;此次分离的2株分离株都与中国河南（EU287429）分离株同源性最低为83.1%。PEDV贵州分离株PEDV-GZAS株m基因与泰国（FJ158546）分离株遗传进化关系最近,与中国河北（JF508465）分离株亲缘关系较近;PEDV-GZHZ株与PEDV-GZAS株及参考毒株之间遗传进化关系较远。

关键词：贵州省猪流行腹泻病毒 m基因克隆相似性分析