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基于发酵优化和动力学建立levan果聚糖生产的数字化模型

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食品与发酵工业 2016年第12期42卷 20-25页

作者：于晓萌张京良孙永超姜言晖沈照鹏王鹏江晓路中国海洋大学食品科学与工程学院山东青岛266003 中国海洋大学医药学院山东青岛266003 青岛海洋生物医药研究院山东青岛266071 同济大学数学科学学院上海200092

利用自动发酵罐对巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)GJT321生产levan果聚糖的发酵培养条件进行优化,并对发酵动力学进行研究,采用Logistic方程、Luedeking-Piret方程和底物消耗的物料平衡方程分别建立菌体生长、产物合成和底物消耗动... 详细信息

利用自动发酵罐对巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)GJT321生产levan果聚糖的发酵培养条件进行优化,并对发酵动力学进行研究,采用Logistic方程、Luedeking-Piret方程和底物消耗的物料平衡方程分别建立菌体生长、产物合成和底物消耗动力学的数字化模型,应用MATLAB软件进行模型拟合,获得模型的参数、方程和曲线。模型的拟合值与发酵测定的实验值拟合良好,该模型能较好地反映Bacillus megaterium GJT321生产levan果聚糖发酵过程中菌体生长、levan果聚糖合成和蔗糖消耗的变化规律,为发酵过程的在线控制和预测提供理论基础。

关键词：动力学模型发酵优化 levan果聚糖巨大芽孢杆菌

产果聚糖蔗糖酶菌株筛选及酶的分离纯化、酶学性质研究和levan果聚糖的酶法合成

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产果聚糖蔗糖酶菌株筛选及酶的分离纯化、酶学性质研究和levan果...

作者：李润静江南大学

学位级别：硕士

levan果聚糖是一种由果聚糖蔗糖酶(levansucrase，EC2.***.1.10)催化转移果糖残基到蔗糖的碳链上，通过促进碳链延伸而形成的β-(2→6)果聚糖。levan果聚糖本身的一些理化特性使它可以应用于很多领域。levan果聚糖在植物中含量很低，目前... 详细信息

levan果聚糖是一种由果聚糖蔗糖酶(levansucrase，EC2.***.1.10)催化转移果糖残基到蔗糖的碳链上，通过促进碳链延伸而形成的β-(2→6)果聚糖。levan果聚糖本身的一些理化特性使它可以应用于很多领域。levan果聚糖在植物中含量很低，目前工业化生产主要采用微生物生物合成的方法。然而，目前发现的可以产levan果聚糖的菌株产量较低或者分离纯化levan果聚糖的步骤较复杂，这些都限制了levan果聚糖的生产及应用。因此，筛选到一株高产果聚糖蔗糖酶的菌株及研究levan果聚糖的合成及分离纯化具有重要的意义。本实验室从甜菜地土壤中筛选出一株高产果聚糖蔗糖酶的新菌株Bacillusmethylotrophicus SK21.002，并运用相对分子量测定、单糖分析、红外分析、核磁分析等技术对产物进行了分析鉴定。本文首先研究了培养基组分和发酵条件对SK21.002产果聚糖蔗糖酶的影响，通过单因素实验和正交试验确定最佳碳源、氮源、金属离子和无机盐的添加量，即蔗糖80g/L，酵母提取物10g/L，胰蛋白胨10g/L，K2HPO48g/L，MgSO40.6g/L，NaCl2g/L。最佳的发酵条件为：初始pH6.5，发酵温度30°C，装液量30%(v/v)，接种量2%(v/v)，发酵周期21h，在此条件下发酵培养，果聚糖蔗糖酶的产量可达到7.28U/mL。其次，对Bacillus methylotrophicus SK21.002所产果聚糖蔗糖酶的粗酶液进行了分离纯化，依次进行了硫酸铵分级沉淀、DEAE-FF16/10离子交换层析和Superdex75凝胶过滤层析，最终获得了电泳纯的果聚糖蔗糖酶。整个纯化过程的纯化倍数为11.78，回收率为9.28%，比酶活为135.40U/mg。凝胶过滤分析和电泳分析均表明该果聚糖蔗糖酶分子量约为60kDa。然后，研究了纯化后的果聚糖蔗糖酶的酶学性质。结果表明，该酶的水解酶活和转糖基酶活的最适温度分别为45°C和40°C，最适pH均为6.5。金属离子Cu、 Fe、Zn和Ni对水解酶活和转糖基酶活都有明显的抑制作用，而Mn只对水解酶活有明显的抑制作用;Ca和Mg对水解酶活和转糖基酶活都有明显的促进作用。当果糖浓度低于0.2mol/L时，果糖对转糖基酶活有一定促进作用，对水解酶活有一定的抑制作用。化学修饰剂NBS与PMSF对果聚糖蔗糖酶的水解酶活和转糖基酶活均有明显的抑制作用，他们分别修饰色氨酸(Trp)以及苏氨酸(Thr)或丝氨酸(Ser)的羟基基团，说明Trp与羟基基团可能是果聚糖蔗糖酶反应过程中的关键基团。另外，该酶的Km值为114mmol/L，V值为8.25μmol/(mL·min)。最后，在酶学性质研究的基础上，以levan果聚糖产量为考察指标，研究了酶催化反应条件对levan果聚糖产量的影响。实验结果表明，levan果聚糖合成的最佳条件为：蔗糖浓度300g/L，加酶量6U/g蔗糖，pH6.5，Mg50mmol/L，反应温度37°C，反应最佳时间为16h。在上述反应条件下，levan果聚糖的最终产量可达到100g/L，转化率为33%。

关键词： levan果聚糖果聚糖蔗糖酶发酵条件分离纯化酶学性质

谷氨酸棒状杆菌全细胞催化合成levan果聚糖条件优化分析

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中国畜牧兽医 2020年第11期47卷 3474-3483页

作者：吴昕雨严琳伍红西南民族大学生命科学与技术学院成都610041

试验旨在探究微生物合成levan果聚糖的新途径并优化其合成条件。利用转入果聚糖蔗糖转移酶基因的重组谷氨酸棒状杆菌进行全细胞催化合成levan果聚糖,并采用响应面法以levan果聚糖产量为响应值优化催化合成条件。首先设计Plackett-Burma... 详细信息

试验旨在探究微生物合成levan果聚糖的新途径并优化其合成条件。利用转入果聚糖蔗糖转移酶基因的重组谷氨酸棒状杆菌进行全细胞催化合成levan果聚糖,并采用响应面法以levan果聚糖产量为响应值优化催化合成条件。首先设计Plackett-Burman试验从7个相关因素(蔗糖浓度、菌体浓度、转化时间、转化pH、PBS中Ca^2+和Mg^2+浓度、levan果聚糖提取时的乙醇终浓度)中筛选出影响levan果聚糖产量的3个主要因素(蔗糖浓度、乙醇终浓度和Ca^2+浓度);再用筛选出的3个最重要因素进行最陡爬坡试验逼近最大响应值区域;最后运用BBD响应面法优化确定3个主要因素之间的交互作用和最佳合成条件。结果显示,初始试验中levan果聚糖平均产量为0.069 g/mL。经过响应面试验优化对利用重组谷氨酸棒状杆菌进行全细胞催化合成levan果聚糖产量影响最大的因素为蔗糖浓度,其次为提取时的乙醇终浓度,最后是转化液中的Ca^2+浓度。当蔗糖浓度为52.71%、乙醇终浓度为85.31%、Ca^2+浓度为0.04 g/L时,利用重组谷氨酸棒状杆菌进行全细胞催化合成的levan果聚糖产量平均值为0.238 g/mL,与模型预测最大值0.233 g/mL相近,转化率约为44%,转化率较初始试验提高了约1.9倍,产量亦较初始试验提高了约3.4倍。研究结果为levan果聚糖工业化生产提供了依据,并为其在动物医学和营养方面的研究奠定基础。

关键词：谷氨酸棒状杆菌果聚糖蔗糖转移酶 levan果聚糖全细胞催化响应面优化

Bacillus amyloliquefaciens H47果聚糖蔗糖酶基因的克隆、表达及其应用研究

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Bacillus amyloliquefaciens H47果聚糖蔗糖酶基因的克隆、表达及...

作者：徐君江南大学

学位级别：硕士

levan果聚糖是果聚糖中的一类,广泛存在于许多植物和微生物中,在化学、医疗、化妆品和食品等产业有很大的应用潜力。levan果聚糖在植物中含量偏低,提取成本较高,微生物发酵产levan果聚糖时,由于菌体生长会利用一部分底物,使levan果聚糖... 详细信息

levan果聚糖是果聚糖中的一类,广泛存在于许多植物和微生物中,在化学、医疗、化妆品和食品等产业有很大的应用潜力。levan果聚糖在植物中含量偏低,提取成本较高,微生物发酵产levan果聚糖时,由于菌体生长会利用一部分底物,使levan果聚糖的产量普遍偏低,而通过果聚糖蔗糖酶酶法合成levan果聚糖较为易行,且合成后的levan果聚糖纯化方法较为简单。因此研究果聚糖蔗糖酶酶法合成levan果聚糖,具有一定的理论意义与与潜在的应用价值。论文以实验室从蜂蜜中筛选获得的一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)为材料,克隆了其中的果聚糖蔗糖酶基因,并以大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)为宿主实现了该酶的异源表达,纯化后分析了重组酶酶学性质,并对酶法合成levan果聚糖进行了初步探索。论文主要研究结果如下:1)通过全基因组测序和序列比对分析*** H47中的果聚糖蔗糖酶基因,果聚糖蔗糖酶基因lsase长度为1422 bp,共编码473个氨基酸。经PCR扩增lsase片段,并构建重组菌*** BL21(DE3)/p ET28a-lsase。重组菌诱导表达后,SDS-PAGE显示重组果聚糖蔗糖酶分子量约为52 k Da。优化了重组酶的表达条件,确定最佳的诱导条件为:初始诱导菌浓OD600为0.6,IPTG浓度为0.4 mmol·L,温度为30℃,诱导时间12 h。在此条件下,果聚糖蔗糖酶的酶活为76.6 U·ml。2)用Ni亲和柱分离目的蛋白,纯化后的果聚糖蔗糖酶比酶活达到151.6 U·mg。酶学性质分析显示重组酶分解酶活的最适温度为45℃,转移酶活最适温度为40℃,而最适p H分别为6.5和6.0。Fe3+和Mg对该酶的分解酶活和转移酶活均有轻微的促进作用。此外,果聚糖蔗糖酶的Km和Vmax分别为150.7 mmol·L和153.6 U·mg。3)对果聚糖蔗糖酶催化合成的产物进行了单糖组分和红外光谱分析,结果表明由该重组酶催化蔗糖合成的产物为levan果聚糖。此外,蔗糖浓度是影响levan果聚糖分子量最重要的因素,在蔗糖浓度100和600 g·L时,levan果聚糖的分子量分别为8.0和2.8 k Da,而温度和加酶量对其分子量的影响较小。4)研究了蔗糖浓度,加酶量,p H,反应温度等条件对合成levan的影响。结果表明:当蔗糖浓度300 g·L,LSase加酶量10 U·m L,p H 6.0,35℃条件下催化15 h,转化率达到最高,为38.8%。

关键词：果聚糖蔗糖酶 levan果聚糖克隆表达解淀粉芽孢杆菌

产大分子levan的果糖基蔗糖转移酶的原核表达及酶学性质

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应用与环境生物学报 2016年第2期22卷 195-200页

作者：宋廷富姜腾飞李茜常斐斐黄国印付佳琪乔代蓉徐辉四川大学生命科学学院微生物与代谢工程四川省重点实验室成都610065

levan型果聚糖是由微生物通过果糖组成的一个均聚物,寻找可以产均一度高的大分子果聚糖的果糖基蔗糖转移酶对其工业应用具有十分重要的意义.本研究克隆了来自运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis,SCTCC102250)的果糖基蔗糖转移酶基因,并... 详细信息

levan型果聚糖是由微生物通过果糖组成的一个均聚物,寻找可以产均一度高的大分子果聚糖的果糖基蔗糖转移酶对其工业应用具有十分重要的意义.本研究克隆了来自运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis,SCTCC102250)的果糖基蔗糖转移酶基因,并在大肠杆菌BL21(DE3)中成功实现表达.通过His-tag柱层析对表达的果糖基蔗糖转移酶进行纯化,将纯化的酶与底物蔗糖反应,经乙醇沉淀得到多糖样品,利用凝胶色谱法确定了其分子量(Mr)的大小为2×106.多糖酸水解后的样品Rt与果糖标准品的Rt保持一致,表明该聚合物为levan果聚糖.最后,通过研究果糖基蔗糖转移酶的酶学性质,确定其最适温度为40℃,最适pH为6.0,Km值为3.95 mmol/L,Vmax为1 31.58μmol m L-1 min-1.本研究通过酶法合成得到levan果聚糖,为今后制备大分子levan果聚糖提供了理论依据.

关键词： levan果聚糖果糖基蔗糖转移酶原核表达蛋白纯化酶学性质

定点饱和突变提高β-(2,6)果聚蔗糖酶热稳定性的研究

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定点饱和突变提高β-(2,6)果聚蔗糖酶热稳定性的研究