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Efficient genome editing in grapevine using CRISPR/lbcas12a system

Molecular Horticulture 2023年第1期3卷 111-123页

作者： Chong Ren Elias Kirabi Gathunga Xue Li Huayang Li Junhua Kong Zhanwu Dai Zhenchang Liang Beijing Key Laboratory of Grape Sciences and Enology Beijing 100093PR China State Key Laboratory of Plant Diversity and Specialty Crops Beijing 100093PR China China National Botanical Garden Beijing 100093PR China University of Chinese Academy of Sciences Beijing 100049PR China Institute of Botany the Chinese Academy of SciencesHaidian DistrictNanxin Village 20XiangshanBeijing 100093China

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/Cas12a system,also known as CRISPR/Cpf1,has been successfully harnessed for genome engineering in many plants,but not in grapevine *** we developed and demonstrated the efficacy of CRISPR/Cas12a from Lachnospiraceae bacterium ND2006(lbcas12a)in inducing targeted mutagenesis by targeting the tonoplastic monosaccharide transporter1(TMT1)and dihydroflavonol-4-reductase 1(DFR1)genes in 41B *** of DFR1 gene altered flavonoid accumulation in dfr1 mutant *** treatment(34℃)improved the editing efficiencies of CRISPR/lbcas12a system,and the editing efficiencies of TMT1-crRNA1 and TMT1-crRNA2 increased from 35.3%to 44.6%and 29.9%to 37.3%after heat treatment,***,the sequences of crRNAs were found to be predominant factor affecting editing efficiencies irrespective of the positions within the crRNA array designed for multiplex genome *** addition,genome editing with truncated crRNAs(trucrRNAs)showed that trucrRNAs with 20 nt guide sequences were as effective as original crRNAs with 24 nt guides in generating targeted mutagenesis,whereas trucrRNAs with shorter regions of target complementarity≤18 nt in length may not induce detectable mutations in 41B *** these results provide evidence for further applications of CRISPR/lbcas12a system in grapevine as a powerful tool for genome engineering.

关键词： Vitis vinifera CRISPR lbcas12a Multiplex editing crRNA length Flavonoid

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利用蛋白质工程手段改造lbcas12a蛋白的PAM识别特异性

利用蛋白质工程手段改造LbCas12a蛋白的PAM识别特异性

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作者：田婧电子科技大学

学位级别：硕士

第三代基因编辑工具CRISPR-Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins)系统,以其操作简洁、成本低廉和较高的编辑效率而备受关注。不同于CRISPR-Cas系统中的其他Cas蛋白,来源于Lachnospiraceae bacterium ND2006的核酸酶Lb Cas12a具有许多优势:Lb Cas12a仅依靠一条cr RNA引导识别PAM且PAM(TTTV)富含AT序列、可在PAM远端催化切割形成粘性末端、在植物育种的低温环境中具有较高的编辑活性。但Lb Cas12a限制于狭窄的PAM识别种类,显著缩小了其在植物基因组编辑中的应用范围。前期实验室针对拓宽Lb Cas12a底物范围已有一定的研究,成功构建了两种高效率的筛选策略,但缺乏系统的筛选和验证。本文以Lb Cas12a蛋白为研究对象,利用定点突变和随机突变的方法改造蛋白,进一步拓宽Lb Cas12a核酸酶的基因组靶向范围。本文结合已报道的Lb Cas12a晶体结构,从PAM识别口袋附近寻找了与PAM及其互补链形成氢键的十个氨基酸残基作为关键氨基酸位点,分别为K121、T148、W534、D535、K595、K601、Y616、Y646、W649和G740,将其单点突变为精氨酸。由于K595位在PAM识别过程中至关重要,故构建了K595位饱和突变体,验证第595位不同氨基酸对PAM识别的影响。突变体质粒通过体内检测,在细菌系统内完成PAM偏好性检测,其结果为:G740R增强d(-2)A和d(-3)G的偏好,Y616R增强d(-2)C的偏好,D535R、W534R增强d(-2)A和d(-4)G的偏好性。有两种595位的突变体表现出PAM偏好性显著改变,分别为:K595Q增强d(-2)A和d(-3)G的偏好,K595S增强d(-2)C的偏好。为了增强对PAM单个核苷酸的识别偏好性,构建能识别更多PAM序列的Lb Cas12a突变体,将优势的单点突变体结合已报道的突变体K591R进行叠加,构建了28种组合突变体。分析组合突变体PAM识别特异性筛选结果,得到了两种类型的突变体,即Lb Cas12a-RSR(D535R/K595S/Y616R)增强了d(-2)C和d(-4)G的识别偏好,Lb Cas12a-RRR(K591R/D535R/G740R)和Lb Cas12a-RQ(D535R/K595Q)增强了d(-2)A、d(-3)G和d(-4)G的偏好性。除了结合口袋附近,本论文随机突变了与PAM及其互补链紧密结合的结构域,选用易错PCR技术构建了随机突变的蛋白质质粒文库,打破了从识别口袋附近寻找突变位点对筛选结果的局限,从距离较远的位点中寻找能识别PAM(TTN/TN/CCAN)的突变体。利用实验室前期开发的体内高通量筛选平台,筛选到6种突变体蛋白,分别为:能识别PAM(TA)的突变体YC-TA-7、YC-TA-8和YC-TA-10,能识别PAM(TTG)的突变体YC-TTG-8,能识别PAM(TC)的突变体YC-TC-12和能识别PAM(CCAT)的突变体YC-CCAT-10。

关键词： CRISPR-Cas lbcas12a PAM识别偏好基因组靶向范围

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基于理性设计策略改造lbcas12a蛋白PAM识别特异性

基于理性设计策略改造LbCas12a蛋白PAM识别特异性

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作者：周洁电子科技大学

学位级别：硕士

存在于细菌和古细菌中的获得性免疫防御机制经过人为改造后,广泛应用于科学研究工作中,于2002年正式命名为CRISPR/Cas系统。该系统经过人为改造后,仅需一条单链RNA就能引导效应因子对特定靶点进行有效切割。2类V型效应因子因其在远离PA... 详细信息

存在于细菌和古细菌中的获得性免疫防御机制经过人为改造后,广泛应用于科学研究工作中,于2002年正式命名为CRISPR/Cas系统。该系统经过人为改造后,仅需一条单链RNA就能引导效应因子对特定靶点进行有效切割。2类V型效应因子因其在远离PAM序列位置进行切割,能形成黏性末端等特点而备受关注,该类效应因子中的AsCas12a蛋白因对哺乳细胞具有良好编辑活性而研究广泛,其中不少致力于拓展其PAM识别特异性从而拓宽其靶向范围。来自毛螺旋菌属Lachnospiraceae bacterium ND2006的lbcas12a在植物基因组编辑中呈现良好编辑活性,但对于拓展该蛋白PAM识别能力的研究甚少。随着植物基因组研究工作的深入,拓展该蛋白的靶向编辑范围成为需要。因此,本文从以下三个方面开展研究。首先,进行研究工作的前提是确定蛋白质的突变范围。该蛋白的晶体结构已被解析。已有的研究工作表明,围绕PAM双链结构周围距离最近的氨基酸即为影响PAM识别能力的关键氨基酸。因此,在蛋白质数据库PBD中下载lbcas12a蛋白晶体结构后,通过Pymol软件找出关键位点,共10个,分别为T149、T152、D156、Q529、G532、K538、D541、Y542、K591、K595。其次,为了了解由空间结构信息所得氨基酸残基对lbcas12a蛋白PAM识别能力的影响,构建并利用负筛选系统对10个位点的丙氨酸突变体进行丙氨酸扫描,逐一确认10个位点影响PAM识别能力的程度,从而确定核心关键位点。结果显示,10个位点中有4个位点对蛋白野生型PAM识别能力有显著影响,据数据分析总结,其影响程度从大到小依次为K595,T149,K538/D156,其余6个位点丙氨酸突变的引入对野生型PAM的识别能力未产生影响。最后,为了更全面的考察关键位点对PAM识别特异性的影响,将10个位点分别突变为精氨酸,构建6个N随机PAM文库,再通过负筛选系统结合高通量测序及生物信息学处理确认突变体、野生型蛋白的偏好PAM。分析结果显示,野生型蛋白在本实验中展示出对TYTV的特异性偏好,十个位点单氨基酸突变的引入对PAM的特异识别产生了四种不同的影响,一是突变的引入对蛋白PAM识别偏好性不产生影响,这些突变为 T149R、T152R、D156R、Q529R、D541R、Y542R,二是突变的引入加强了对d（-3*）位T的偏好,产生该影响的突变有G532R、K538R,三是突变的引入将d（-2*）位的识别拓展为W（A/T）,即K595R突变,四是突变的引入将d（-2*）位的识别拓展为W（A/T）,同时还增强了 d（-3*）位对T的识别偏好,即K591R突变。随机选取各个类型的位点,即T152、G532、K591、K595进行随机组合突变,得到11个组合突变体,负筛选系统确认组合突变体的PAM识别偏好,得到能够识别非标准PAM的K591R/K595R突变体,其松弛的PAM均为TYWV。为了验证该结果,构建正筛选系统验证其在d（-2*）位的松弛,结果证实了突变体在d（-2*）位对A的识别能力。

关键词： CRISPR/Cas lbcas12a 理性设计 PAM识别偏好

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A field-deployable method for single and multiplex detection of DNA or RNA from pathogens using Cas12 and Cas13

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Science China(Life Sciences) 2022年第7期65卷 1456-1465页

作者： Lina Li Canxing Duan Jianfeng Weng Xiantao Qi Changlin Liu Xinhai Li Jinjie Zhu Chuanxiao Xie National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement Institute of Crop ScienceChinese Academy of Agricultural Sciences(CAAS)Beijing 100081 China Biotechnology Research Institute Chinese Academy of Agricultural Sciences(CAAS)Beijing 100081China

For some Cas nucleases,trans-cleavage activity triggered by CRISPR/Cas-mediated cis-cleavage upon target nucleic acid recognition has been explored for diagnostic *** single and multiplex nucleic acid-based detection is needed for crop pathogen management in ***,we harnessed and characterized RfxCas13d as an additional CRISPR/Cas nucleic acid detection *** systematically characterized AsCas12a,lbcas12a,LwaCas13a,and RfxCas13d combined with isothermal amplification to develop a CRISPR/Cas nucleic acid-based tool for single or multiplex pathogen *** data indicated that sufficient detection sensitivity was achieved with just a few copies of DNA/RNA targets as *** this tool,we successfully detected DNA from Fusarium graminearum and Fusarium verticillioides and RNA from rice black-streaked dwarf virus in crude extracts prepared in the *** method,from sample preparation to result readout,could be rapidly and easily deployed in the *** system could be extended to other crop pathogens,including those that currently lack a detection method and have metabolite profiles that make detection *** nucleic acid detection system could also be used for single-nucleotide polymorphism genotyping,transgene detection,and qualitative detection of gene expression in the field.

关键词： nucleic acid detection AsCas12a lbcas12a LwaCas13a RfxCas13d maize ear rot Fusarium head blight rice black-streaked dwarf virus(RBSDV)

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基于CRISPR和遗传编码的荧光探针用于生物标志物的分析检测

基于CRISPR和遗传编码的荧光探针用于生物标志物的分析检测

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作者：罗通中南大学

学位级别：硕士

生物标志物是生命活动中的某一具体物质或特征,可以充当反映生理过程的指标。因此,开发指示细胞内生物标志物活动的探针对生命医学的发展有着重要的意义。现有的生物标志物检测方法存在着诸多限制,如体外检测耗时长、操作复杂等,细胞内... 详细信息

生物标志物是生命活动中的某一具体物质或特征,可以充当反映生理过程的指标。因此,开发指示细胞内生物标志物活动的探针对生命医学的发展有着重要的意义。现有的生物标志物检测方法存在着诸多限制,如体外检测耗时长、操作复杂等,细胞内成像难以实现原位实时监测。针对这些问题,本论文选取了mi RNA21和多巴胺两种生物标志物作为研究模型,开展了以下研究:(1)基于CRISPR/Lb Cas12a系统和金纳米颗粒探针构建了在体外超快速灵敏检测mi RNA的检测平台。检测平台由金纳米信标(报告探针)和Lb Cas12a-cr RNA复合物(识别元件)组成,通过优化金纳米信标浓度、信标茎长、金纳米颗粒粒径、金纳米信标种类、识别元件浓度等,得到了最优检测条件(识别元件:30 n M、报告探针:1n M、反应时间:5 min),并对检测平台的检测限进行了考察。检测平台对mi RNA21的检测限为10 f M,检出时间5 min,具有极快的检测速度和高灵敏度。此外,该检测平台在生物环境中具有较好的稳定性和对mi RNA21具有良好的特异性,能够对实际样本进行检测。(2)基于遗传编码和点亮型荧光探针构建检测哺乳动物细胞内多巴胺的探针(D-detect)。D-detect由多巴胺RNA适配体(识别元件)和DFHBI-1T适配体(报告元件)融合而成。根据不同的融合序列,设计了8种方案,并通过搭桥法PCR合成了D-detect模板和T7体外转录获得了D-detect。然后通过电泳分析和荧光表征筛选出了三种在体外对多巴胺有响应的D-detect,信背比由高到低分别是3.6、3.2、2.2。最后,构建了携带D-detect基因的质粒并转染进Hela细胞对D-detect的细胞内响应性能进行了初步考察。图34幅,表7个,参考文献90篇

关键词：生物标志物 lbcas12a microRNA 金纳米颗粒多巴胺核酸适配体

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