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m6A去甲基化酶FTO调控lag-3的表达机制研究

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m6A去甲基化酶FTO调控LAG-3的表达机制研究

作者：甘林川福建师范大学

学位级别：硕士

以PD-1抗体为代表的免疫检查点抑制剂可以逆转T细胞的耗竭状态,激活T细胞的杀伤能力,抑制肿瘤的生长。虽然PD-1等免疫检查点抑制剂在临床上表现出强大的抗肿瘤效果,但由于个体肿瘤微环境的差异,导致PD-1/PD-L1抗体的反应率仅为20%左右... 详细信息

以PD-1抗体为代表的免疫检查点抑制剂可以逆转T细胞的耗竭状态,激活T细胞的杀伤能力,抑制肿瘤的生长。虽然PD-1等免疫检查点抑制剂在临床上表现出强大的抗肿瘤效果,但由于个体肿瘤微环境的差异,导致PD-1/PD-L1抗体的反应率仅为20%左右。肿瘤组织中失活T细胞常表达各种免疫检查点继而抑制免疫应答,暗示肿瘤细胞可利用各种免疫检查点摆脱免疫监视。因此,开发其他免疫检查点抑制剂的抗体是一个趋势性的需求,并且这些抗体对肿瘤的协同治疗可能为癌症免疫治疗提供有前景的策略。肿瘤细胞常常利用免疫检查点来参与免疫逃逸,而免疫检查点的表达受多种方式调控。在调控免疫检查点表达过程中,表观遗传特别是m6A甲基化修饰发挥着重要作用。m6A甲基化修饰作为m RNA转录后最常见的修饰方式,对免疫细胞的抗肿瘤功能具有调节作用。有研究发现m6A甲基化修饰可以调控免疫检查点的表达,并且抑制m6A调控蛋白还可以协同PD-1/PD-L1抗体治疗肿瘤,这暗示m6A甲基化修饰对免疫检查点的调控具有重要的作用。lag-3是继PD-1和CTLA-4之后重要的免疫抑制性受体或免疫检查点。随着PD-1抗体联合lag-3抗体疗法成功的在临床上应用,极大的促使我们进一步深入研究lag-3的表达调控机制以及开发出协同lag-3抗体治疗的新方法。因此,探究m6A甲基化修饰与lag-3的表达关系以及m6A抑制剂联合lag-3抗体治疗肿瘤具有重要意义。本课题主要研究结果如下:1.抑制或敲除FTO可以促进lag-3的表达使用FTO抑制剂FB23-2、Dac51处理L929细胞和NB4细胞,经过q-PCR和免疫印迹等分析方法检测细胞lag-3的表达。结果表明lag-3的表达量随着药物浓度的增加而显著升高。同时在L929细胞上敲除FTO后,lag-3的m RNA水平和蛋白水平都显著增加。过表达FTO后,lag-3的m RNA水平和蛋白水平与FTO敲除完全相反,都显著降低。我们然后使用FTO抑制剂FB23-2处理CD4T和CD8T细胞,流式细胞仪检测lag-3的平均荧光强度变化。结果表明FB23-2可以显著促进CD8T细胞lag-3的表达,并随着浓度的增加而升高。FB23-2只能轻微的促进CD4T细胞lag-3的表达。2.抑制METTL3对lag-3的表达无影响使用METTL3抑制剂STM2457处理L929细胞和NB4细胞,经过q-PCR和免疫印迹等分析方法检测细胞lag-3的表达。结果发现lag-3的表达量不会随着药物浓度的增加而变化。我们然后使用METTL3抑制剂STM2457处理CD4T和CD8T细胞,流式检测细胞lag-3的平均荧光强度变化。结果发现STM2457几乎对CD4T和CD8T细胞lag-3的表达没有影响。***抑制剂可以抑制肿瘤生长和延长荷瘤小鼠的生存时间通过构建小鼠肿瘤模型,给予FTO抑制剂FB23-2和Dac51治疗。药物治疗后记录小鼠肿瘤大小和存活时间,流式细胞仪分析肿瘤浸润淋巴细胞的变化。结果表明FB23-2和Dac51可以显著抑制肿瘤生长和延长小鼠生存时间,并且FB23-2治疗后提高了CD8T和NK细胞的浸润水平,这个过程依赖于小鼠的免疫系统。***抑制剂联合lag-3抗体协同抑制肿瘤生长通过构建小鼠肿瘤模型,进行FTO抑制剂FB23-2、lag-3抗体单独以及联合治疗。药物治疗后记录小鼠肿瘤大小和死亡时间,流式细胞仪分析肿瘤浸润淋巴细胞的变化。结果表明FB23-2和lag-3抗体联合治疗的效果最好,可以显著抑制肿瘤生长和延长小鼠死亡时间,并且联合治疗可以提高CD8T以及NK细胞的浸润。***通过m6A甲基化修饰来调控lag-3的表达通过对敲除或抑制FTO后进行整体m6A含量测定,检测细胞整体的m6A表达水平。结果发现敲除或抑制FTO后细胞整体的m6A表达水平升高。通过m6A在线预测网站预测lag-3 m RNA的m6A甲基化修饰位点,设计并合成不同位点的特异性引物。然后对敲除或抑制FTO后的m RNA进行Me RIP-q PCR。结果表明FTO通过调控lag-3 m RNA site 3和site 4这两个位点的m6A修饰来调节lag-3的表达。

关键词： m6A甲基化修饰 FTO lag-3 免疫疗法协同治疗

TILs和lag-3与贲门腺癌术后患者预后的相关性研究

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TILs和LAG-3与贲门腺癌术后患者预后的相关性研究

作者：贾慧雨新乡医学院

学位级别：硕士

背景贲门腺癌(gastric cardia adenocarcinoma,GCA)发病率在全球范围内逐渐上升,确诊时患者大多处于中晚期,对放、化疗常不敏感,预后较差。如何更可靠地评估GCA患者预后并选择合适的治疗策略至关重要。肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrat... 详细信息

背景贲门腺癌(gastric cardia adenocarcinoma,GCA)发病率在全球范围内逐渐上升,确诊时患者大多处于中晚期,对放、化疗常不敏感,预后较差。如何更可靠地评估GCA患者预后并选择合适的治疗策略至关重要。肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocytes,TILs)是肿瘤免疫的关键参与者之一,被证实与乳腺癌、结直肠癌等癌症的预后相关。此外,TILs表达的免疫检查点参与维持抑制肿瘤免疫,淋巴细胞激活基因3(lymphocyte activation gene-3,lag-3)是目前备受关注的新型免疫检查点之一,其表达通常被认为是免疫抑制和肿瘤侵袭进展的标志物,与低生存率有关,目前已有多种针对lag-3的免疫治疗策略陆续进入临床试验。目的评估GCA癌组织中TILs浸润情况;探讨TILs浸润与GCA术后患者临床病理特征及生存期的关系;进一步分析TILs中lag-3的表达情况及其与GCA术后患者生存期的关系;寻找有价值的GCA预后指标;为GCA患者治疗方案的优化提供实验依据。方法收集2010年1月至2020年12月濮阳市人民医院GCA术后患者的临床病理资料及相对应癌组织的HE染色切片,最终入组210例;以电话、微信或入户等方式获取随访数据,显微镜下评估癌组织中TILs浸润情况:以肿瘤间质内TILs与间质的面积之比50%为界限,分为低比例组和高比例组。使用SPSS软件分析数据,采用X2检验分析TILs与GCA术后患者临床病理特征之间的关系,采用Kaplan-Meier法分析GCA术后患者的临床病理特征及TILs与预后的关系;对GCA术后患者临床病理特征(性别、年龄、大体类型、肿瘤最长直径、分化程度、浸润深度、淋巴结转移情况、TNM分期)及TILs行单因素分析,筛选出GCA术后患者可疑预后因素并纳入Cox比例风险模型进行多因素分析,最终得到GCA术后患者预后的独立影响因素。寻找2015年01月至2020年12月GCA术后患者的病理组织蜡块,最终可用于免疫组化研究的病理组织蜡块共101例,应用免疫组化染色检测癌组织中lag-3的表达:以肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocytes,TILs)细胞膜和(或)细胞质出现黄色或棕黄色颗粒为lag-3阳性,lag-3阳性淋巴细胞占TILs的百分比≥5%判定为阳性表达。使用SPSS软件进行数据分析,以X2检验分析lag-3与GCA患者临床病理特征之间的关系,采用Kaplan-Meier法分析lag-3与GCA术后患者预后的关系。结果1.一般资料及随访结果:11年中临床病理资料完整且切片可利用的210例患者入组,获取到208例患者的随访数据,失访2人,失访数据作截尾数据处理,生存时间的计算为病理确诊为GCA至死亡时间(因GCA死亡时间)或末次随访时间。其中男180例,女30例,年龄40岁～85岁,中位年龄64岁;低分化114例,中-高分化96例;TNM分期:Ⅰ～Ⅱ期44例,Ⅲ期166例。本组病例的平均生存时间为69.6个月,中位生存时间为58.0个月,1、3和5年累积生存率为83.8%、62.0%和 47.5%***浸润与GCA术后患者临床病理特征及预后的关系:(1)210例GCA组织中TILs高比例浸润患者百分比为40.5%(85/210)。(2)TILs浸润与肿瘤最大直径、淋巴结转移情况、TNM分期有关(P值均0.05)。(3)TILs高比例浸润患者生存期明显高于TILs低比例患者(P3.单因素分析:年龄≥60岁、肿瘤直径长、分化程度低、浸润程度深、有淋巴结转移、TNM分期晚、TILs低比例浸润与GCA术后患者预后不良有关(P值均0.05)。***比例风险模型多因素分析:年龄≥60岁(P=0.026,HR=1.653,95%CI=1.061～2.576)、分化程度低(P=0.012,HR=1.578,95%CI=1.105～2.252)、TILs低比例浸润(P=0.002,HR=1.358,95%CI=1.120～1.645)是GCA术后患者预后的独立危险因素。***-3表达与GCA术后患者临床病理特征及预后的关系:(1)一般资料:101例GCA患者的年龄在43～85岁之间,中位年龄65.5岁;其中男86例,女15例;中-高分化41例,低分化60例;有淋巴结转移74例,无淋巴结转移27例;TNM分期:Ⅰ期13例,Ⅱ期8例,Ⅲ期80例。(2)101例GCA患者中lag-3的阳性表达率为5

关键词：贲门腺癌 TILs lag-3 临床病理预后

免疫检查点Tim-3和lag-3在肺癌中的研究进展

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现代肿瘤医学 2021年第18期29卷 3279-3282页

作者：于悦孔英君刘航刘海洋李萌张敏哈尔滨医科大学附属第一医院呼吸内科黑龙江哈尔滨150001

近年来肺癌的免疫治疗取得了重大突破,随着免疫检查点抑制剂的出现,阻断体内抑制性分子可以使免疫系统重新激活以抵抗肿瘤,改善了一线和二线治疗中的总生存率。目前细胞程序死亡受体1(PD-1)及其配体(PD-L1)抑制剂为肺癌患者提供了新的... 详细信息

近年来肺癌的免疫治疗取得了重大突破,随着免疫检查点抑制剂的出现,阻断体内抑制性分子可以使免疫系统重新激活以抵抗肿瘤,改善了一线和二线治疗中的总生存率。目前细胞程序死亡受体1(PD-1)及其配体(PD-L1)抑制剂为肺癌患者提供了新的治疗方法。尽管检查点阻断改善了肺癌患者的治疗前景,但单药治疗方法仅对一部分患者有效且可能产生耐药性,仍需我们不断探索新的抑制途径。本文主要对免疫检查点T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3(Tim-3)和淋巴细胞活化基因-3(lag-3)在肺癌中的研究进展作一综述。

关键词：肺癌免疫检查点免疫治疗 Tim-3 lag-3

CD8+T细胞lag-3表达上调促使HCV持续性感染

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CD8+T细胞LAG-3表达上调促使HCV持续性感染

作者：郭风繁南华大学

学位级别：硕士

背景:丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)是能导致严重肝脏疾病的公共卫生问题之一。HCV感染后极易发展为慢性感染,近80-85%可发展为慢性丙型肝炎(Chronic Hepatitis C,CHC)。近年很多研究发现HCV感染后慢性化主要是由于T细胞耗竭,其... 详细信息

背景:丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)是能导致严重肝脏疾病的公共卫生问题之一。HCV感染后极易发展为慢性感染,近80-85%可发展为慢性丙型肝炎(Chronic Hepatitis C,CHC)。近年很多研究发现HCV感染后慢性化主要是由于T细胞耗竭,其主要特征之一是抑制性受体表达上调。淋巴细胞活化因子-3(Lymphocytes Activation Gene-3,lag-3)是新近发现的T细胞免疫抑制性受体,负调控T细胞增殖、分泌和杀伤等功能,导致T细胞功能耗竭,但其机制尚未阐明。目的:本研究旨在探讨HCV感染形成的炎性微环境对lag-3的影响,以及lag-3在CD8+T免疫调控的作用以及初步机制。方法:1.收集郴州市具有静脉吸毒史的自愿者血液样本,根据抗-HCV抗体(HCV Ig G)、HCV RNA结果将纳入病例分为:慢性丙型肝炎组和健康对照组;***检测血浆中白介素-12p70(Interleukin-12p70,IL-12p70)、白介素-10(IL-10)和转化生长因子-β(Transforming Growth factor-β,TGF-β)的浓度;3.流式细胞分析仪检测lag-3、T-bet(T-box expressed in T cell,T-bet)和HLA-DR(Human Leukocyte Antigen-DR,HLA-DR)等表达水平以及胞内IL-10、IFN-γ(Interferon-γ,IFN-γ)的分泌水平;4.体外实验:取健康对照组外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells,PBMCs)1×106/孔接种于96孔平底板,用不同的细胞因子(IL-10、IL-12和TGF-β)刺激72h后收集细胞,流式细胞分析仪检测不同刺激因素对CD8+T细胞表达lag-3的影响。结果:1.与健康对照组相比,慢性丙型肝炎患者CD8+T细胞lag-3表达水平增高(p=0.012),且与病毒滴度呈正相关(p=0.036,r=0.484);2.与健康对照组相比,慢性丙型肝炎患者CD8+T细胞胞内IFN-γ水平显著下降(p=0.04),IL-10水平没有显著性差异(p=0.33);3.慢性丙型肝炎组,CD8+T细胞中lag-3阳性群IFN-γ的表达水平明显低于lag-3阴性群(p=0.02);健康对照组无明显差异;4.与健康对照组相比,慢性丙型肝炎患者血浆IL-10(p=0.001)和IL-12(p=0.019)水平显著上升,TGF-β水平显著下降(p=0.01);体外实验证实:r IL-12上调CD8+T细胞表达lag-3是依赖T细胞抗原受体(T Cell Receptor,TCR)活化的方式(p=0.002),r TGF-β下调CD8+T细胞表达lag-3也是依赖TCR活化的方式(p=0.002);5.慢性丙型肝炎组,CD8+T细胞中lag-3阳性群HLA-DR表达水平高于lag-3阴性群(plag-3阳性群T-bet表达水平低于lag-3阴性群(p=0.037);在活化的CD8+T细胞中lag-3阳性群T-bet表达水平低于lag-3阴性群(p=0.005);6.慢性丙型肝炎组,活化的CD8+T细胞lag-3表达水平与T-bet表达水平呈负相关(p=0.005,r=-0.943)。结论:1.慢性丙型肝炎患者血浆中IL-10和IL-12水平升高,TGF-β水平降低。2.慢性丙型肝炎患者CD8+T细胞lag-3表达上调。3.在慢性丙型肝炎患者,CD8+T细胞lag-3表达水平与病毒载量呈正相关。4.由于HCV抗原持续刺激,免疫细胞快速启动免疫反应分泌多种细胞因子,这种炎性微环境促使CD8+T细胞上调免疫抑制性受体lag-3表达,lag-3通过影响T-bet表达,从而影响CD8+T细胞IFN-γ表达,这可能是T细胞耗竭的原因之一。5.阐释了lag-3在CD8+T细胞免疫调控的作用以及初步机制。为HCV感染后慢性化机制和治疗提供了新的视角。

关键词：丙型肝炎病毒 lag-3 T细胞耗竭炎性环境

肺腺癌中lag-3、FGL1、PD-L1和CD8+ T细胞表达的相关性研究

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肺腺癌中LAG-3、FGL1、PD-L1和CD8+ T细胞表达的相关性研究

作者：朱菊明新疆医科大学

学位级别：硕士

目的:lag-3/FGL1通路在肿瘤的免疫逃逸中发挥了重要作用,是非小细胞肺癌免疫治疗研究热点,其在组织中的表达与PD-1/PD-L1的表达可能存在相关性,本研究旨在探索肺腺癌组织中lag-3及其配体FGL1和PD-L1以及CD8T细胞之间的相关性,并探讨它... 详细信息

目的:lag-3/FGL1通路在肿瘤的免疫逃逸中发挥了重要作用,是非小细胞肺癌免疫治疗研究热点,其在组织中的表达与PD-1/PD-L1的表达可能存在相关性,本研究旨在探索肺腺癌组织中lag-3及其配体FGL1和PD-L1以及CD8T细胞之间的相关性,并探讨它们与肺腺癌临床病理特征及生存预后之间的关系。方法:收集2018年1月至2018年12月期间在新疆医科大学附属肿瘤医院接受肺癌根治术患者的组织标本及其临床病理资料。采用免疫组织化学法分别检测肿瘤组织中lag-3、FGL1、PD-L1的表达,同时检测CD8T细胞的表达,并分析其相关性。结果:Spearman等级相关分析显示lag-3与PD-L1呈正相关(r=0.543,Plag-3与FGL1呈正相关(r=0.311,P=0.004);FGL1与PD-L1呈正相关(r=0.291,P=0.008);FGL1与CD8T细胞表达呈正相关(r=0.227,P=0.040)。单因素分析表明,DFS与分期以及脉管癌栓、lag-3表达、FGL1表达、CD8T细胞表达有关联(P3.648,95%CI为1.301～10.226,P=0.014)和CD8(HR=0.143,95%CI为0.052～0.395,Plag-3、FGL1表达阳性和CD8T细胞水平降低与疾病转归不良相关。结论:肺腺癌组织中lag-3、FGL1、PD-L1蛋白之间的表达互相呈正相关,FGL1表达与CD8T细胞表达亦呈正相关。高水平的FGL1和CD8分别与肺腺癌预后不良和良好相关,可作为肺腺癌预后不利和有利的潜在生物标志物。lag-3和(或)FGL1均表达阳性与术后疾病进展相关。

关键词：肺腺癌 lag-3 FGL1 PD-L1 CD8+T细胞相关性

原发性肝细胞肝癌中lag-3、MVD的表达及其对患者预后的影响

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原发性肝细胞肝癌中LAG-3、MVD的表达及其对患者预后的影响

作者：田金青岛大学

学位级别：硕士

研究目的:为探索研究lag-3(淋巴细胞活化基因3,又称CD223)与微血管密度(MVD)在原发性肝细胞肝癌(Primary hepatocellular liver cancer HCC)中两者的关联,以此为依据理清MVD、lag-3与原发性肝细胞肝癌患者的预后相关性。研究方法:选在... 详细信息

研究目的:为探索研究lag-3(淋巴细胞活化基因3,又称CD223)与微血管密度(MVD)在原发性肝细胞肝癌(Primary hepatocellular liver cancer HCC)中两者的关联,以此为依据理清MVD、lag-3与原发性肝细胞肝癌患者的预后相关性。研究方法:选在青岛市市立医院东院区肝胆外科2014年6月至2016年6月行肝癌根治术的127例原发性肝细胞肝癌患者,术前均未实施过任何放化疗、消融、靶向免疫以及中药等抗肿瘤疗法,均已通过术后石蜡病理检查确诊为原发性肝细胞肝癌,且术后标本保护情况良好。随访日期截止至二零二零年六月。此研究的伦理审核已经被该医院的医学伦理委员会审查并通过,该研究的患者与其家属清楚本次研究的相关内容以及注意事项,并且签署有关的知情同意书。此研究中应用的是免疫组织化学染色法,能够从中获得病理学的统计结果,同时对癌组织内的CD34和CD223表达密度进行计算。研究用到的抗体是小鼠抗人单克隆抗体lag-3(1:200,ab40465,Abcam)、鼠抗人单克隆抗体CD34(1:100,ab8158,Abcam)。lag-3的表达情况由二名职务均为副主任以上的资深病理学专家,通过双盲法独立评估所有的病理染色切片获得。当两名医生的评价结果不相符时,由第三位病理医生进行计数及分类。以在肿瘤的浸润区T淋巴细胞膜上产生黄色或棕褐色的颗粒为阳性,并在低倍镜下观察切片的全部视野,而后再随机选择十个高倍镜视野(400倍)进行观察。由阳性细胞染色的强度和阳性细胞的分布情况来定义表达水平。染色强度定义如下:0分表示没有染色,1分表示浅黄色,2分表示棕黄色,3分表示棕褐色;阳性细胞的分布定义为0分代表3分代表51%-75%,4分代表>75%,将两个结果相乘得到的分数作为免疫组化评分,0-1为阴性,2-4为弱阳性,5-8为中度阳性,9-12为强阳性。为了确定lag-3表达是否与临床病理特征相关,将lag-3在T细胞表面表达水平为阴性与弱阳性定义为lag-3低表达组,表达水平是中阳性及强阳性定义为lag-3高表达组。CD34表达情况的结果判读参照Weidner法:相对于邻近区域,CD34阳性细胞和细胞簇密度较高的区域被归类为“热点”,低倍镜(100倍)下确定5个具有最高数量微血管或血管热点的视野,中倍镜(200倍)下人工计算每个视野“热点”数量,取平均值作为MVD的数值,并以此为界限划分为高值区和低值区。研究结果:癌组织中lag-3的表达水平与性别、年龄、有无长期饮酒史(饮酒时间≥5年)、术前谷丙转氨酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)水平、有无肝硬化、肿瘤数目、Child-Pugh分级、组织分化程度等因素没有相关性,差异无统计学意义(P>0.05),与术前甲胎蛋白(AFP)水平、肿瘤直径、N分期、有无乙型肝炎病毒(HBV)感染有相关性,差异具有统计学意义(Plag-3高表达与CD34表达增高显著相关(Plag-3高表达患者较lag-3低表达患者OS更短(Plag-3、MVD、年龄、肿瘤数量、术前AFP水平、组织分化、Child-Pugh分级和淋巴结转移情况是总生存期(OS)的独立影响因素。研究结论:***-3可能成为HCC患者临床诊疗过程中新的观察指标及治疗靶点。***-3可能促进肝细胞肝癌血管生成3.免疫检查点阻断疗法可能能有效治疗HBV感染性肝炎。4.肿瘤较大、AFP水平较高、有淋巴结转移、有HBV感染史的患者可能是应用抗lag-3免疫治疗治疗的合适人群。

关键词：原发性肝细胞肝癌 lag-3 MVD 预后

PD-1、TIM-3、lag-3在急性白血病异基因造血干细胞移植后T淋巴细胞的表达及意义初探

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PD-1、TIM-3、LAG-3在急性白血病异基因造血干细胞移植后T淋巴细...

作者：刘建宁河北医科大学

学位级别：硕士

目的:PD-1(Programmed death receptor-1)、TIM-3(T cell imm-unoglobulin mucin 3)、lag-3(Lymphocyte activating gene-3)作为免疫负性协同刺激分子,参与肿瘤细胞的免疫逃逸机制,本研究分析PD-1、TIM-3、lag-3在急性白血病患者异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)后外周血T淋巴细胞的表达特征,进而探讨其临床意义。方法:采集23例健康志愿者(健康对照组),36例急性白血病患者异基因造血干细胞移植(移植患者组)后1个月、2个月、3个月、4.5个月、6个月的外周血标本,采用流式细胞术对CD4、CD8、CD3T淋巴细胞PD-1、TIM-3、lag-3表达水平进行动态监测,统计分析移植患者组和健康对照组的PD-1、TIM-3、lag-3表达水平差异。并收集移植患者组临床资料,分析移植后MRD(Minimal residual disease)阳性与MRD阴性组、DLI(Donor lymphocyte infusions)与非DLI组、GVHD(Graft-versus-host disease)阳性与阴性组、激素使用与否、病毒(CMV、EBV、BKV和/或JCV)感染与否情况下,外周血T淋巴细胞PD-1、TIM-3、lag-3表达水平的差异,总结其表达特征及临床意义。结果:1. 急性白血病患者allo-HSCT后早期PD-1、TIM-3在T淋巴细胞的表达较正常水平升高且随时间呈现下降趋势。各检测时间点移植患者组lag-3在CD8T细胞表达水平均低于健康对照组(P均3个月PD-1在T淋巴细胞表达水平升高,可能提示疾病复发。3. 移植后早期GVHD组与n GVHD组PD-1在CD4、CD8T细胞及TIM-3、lag-3在T细胞的表达水平与n GVHD组未见明显差异。4.2 例急性白血病移植后患者DLI治疗后较回输前PD-1、TIM-3、lag-3在T淋巴细胞表达水平呈下降趋势,1例患者DLI治疗后3个月PD-1在T淋巴细胞、TIM-3在CD3CD4T淋巴细胞表达水平下降。5. 移植后患者病毒阳性组PD-1在CD3CD4T细胞与TIM-3在CD4、CD8、CD3T细胞表达水平均高于病毒阴性组(P均3T细胞表达水平高于非激素组(P均3在T淋巴细胞的表达较正常水平升高且随时间呈现下降趋势。各检测时间点移植患者组lag-3在CD8T细胞表达水平均低于健康对照组。***对allo-HSCT后T细胞上PD-1、TIM-3、lag-3表达未见明显影响。***可降低患者移植后T淋巴细胞的PD-1、TIM-3阳性比率。4.移植后患者病毒感染期间,T淋巴细胞PD-1表达升高。

关键词： PD-1 TIM-3 lag-3 急性白血病异基因造血干细胞移植

靶向PD-1/lag-3的双功能抗体设计及功能研究

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靶向PD-1/LAG-3的双功能抗体设计及功能研究

作者：时宁中南大学

学位级别：硕士

研究背景:近年来,以PD-1/PD-L1(程序性死亡受体1/程序性死亡配体1)为靶点的抗体药物在临床上取得了巨大的突破,被誉为有史以来最成功的“广谱抗癌”药物靶点。但是,PD-1抗体单药治疗效果有限,原发性耐药和继发性耐药的人群仍然占有非常... 详细信息

研究背景:近年来,以PD-1/PD-L1(程序性死亡受体1/程序性死亡配体1)为靶点的抗体药物在临床上取得了巨大的突破,被誉为有史以来最成功的“广谱抗癌”药物靶点。但是,PD-1抗体单药治疗效果有限,原发性耐药和继发性耐药的人群仍然占有非常大的比例。可以预测,未来以研制PD-1抗体为主的双靶标、多靶标联合治疗或者双功能抗体药物将成为肿瘤治疗的发展方向。临床研究表明,在一些PD-1抑制剂耐药的肿瘤患者中,还存在其它免疫检查点的过表达。其中,lag-3(淋巴细胞活化基因3)是重要的免疫检查点分子之一,在临床上已经证实lag-3抗体与PD-1抗体联合使用具有协同的抗肿瘤作用。因此,我们利用我室自主研发的PD-1、lag-3单克隆抗体开展“杵臼结构”的PD-1、lag-3双功能抗体YG-003D3的设计及其抗肿瘤活性研究。研究目的:深入研究双功能抗体YG-003D3与亲本单克隆抗体单药以及联合治疗相比的优势和药理学特性,为YG-003D3(抗PD-1、lag-3双功能抗体)的临床应用提供实验基础。研究方法:(1)YG-003D3双功能抗体制备及稳定性分析。利用中国仓鼠卵巢细胞(CHO)真核表达系统表达双功能的“Knob”(杵)和“Hole”(臼)蛋白,经过Protein A亲和层析柱纯化,在还原型谷胱甘肽的作用下进行体外组装,利用尺寸排阻色谱(SEC)及疏水色谱(HIC)分析组装后双抗轻重链正确配对的比例和蛋白纯度,使用Uncle高通量多参数蛋白稳定性分析仪分析YG-003D3的稳定性。均相时间分辨荧光技术(HTRF)检测YG-003D3 Fc相关的生物学活性。(2)体外检测YG-003D3与其配体PD-1/lag-3结合活性。利用双抗原夹心酶联免疫吸附实验(ELISA)检测YG-003D3同时与PD-1/lag-3双靶标结合情况。生物膜层干涉技术(BLI)/流式细胞术分析双功能抗体YG-003D3在分子/细胞水平上与其配体PD-1/lag-3的亲和力,利用BLI方法检测YG-003D3同时与PD-1/lag-3两个分子结合是否存在位阻效应。利用流式细胞数检测YG-003D3与h PBMCs(人外周血单个核细胞)的结合能力。(3)体外检测YG-003D3是否可以阻断PD-1/PD-L1、PD-1/PD-L2、lag-3/MHC-II结合。利用竞争ELISA检测YG-003D3对PD-1/PD-L1、PD-1/PD-L2结合的阻断效应,流式细胞术检测YG-003D3在细胞水平上对PD-1/PD-L1、lag-3/MHC-II的阻断效应。(4)YG-003D3的体内抗肿瘤机制研究。流式细胞术检测YG-003D3是否能够桥连分别表达PD-1和lag-3的细胞。h PBMCs激活实验及混合淋巴细胞反应(MLR)实验分析YG-003D3对h PBMCs细胞/CD4T细胞的激活效果。乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检测试剂盒测定YG-003D3诱导h PBMCs对肿瘤细胞的体外杀伤能力。(5)利用PD-1/lag-3双敲入转基因小鼠皮下接种MC38-h PD-L1肿瘤细胞,建立PD-1/lag-3双人源化MC38-h PD-L1移植瘤模型,研究YG-003D3的抗肿瘤效果和分子机制。研究结果:在本研究中,我们成功构建了一种Fc失活的新型PD-1/lag-3双功能抗体YG-003D3,其Fc不能与CD16a结合,但能与新生儿受体(Fc Rn)有效结合。研究证实,YG-003D3与亲本抗体保持相似的亲和力和热稳定性,并且双功能抗体Fv区在双靶标识别过程中相互独立,无空间位阻。YG-003D3不仅可以同时靶向单细胞上的PD-1/lag-3,还可以桥连表达PD-1和lag-3的两种细胞。特别是在h PBMCs活化实验中,与亲本PD-1抗体、lag-3抗体甚至亲本抗体联合相比,YG-003D3能诱导更强的IFN-γ、IL-6和TNF-a分泌。同样,MLR实验也证实了YG-003D3相对抗PD-1、抗lag-3抗体及亲本抗体联合具有更强的T细胞激活能力。在h PBMCs体外肿瘤杀伤实验中,YG-003D3激活h PBMCs杀伤肿瘤细胞的能力也优于抗PD-1或抗lag-3抗体甚至亲本抗体联合组,杀伤率高达20%,抗PD-1、抗lag-3抗体及其亲本抗体联合组杀伤率分别为7.8%、6.2%及12.8%。在人源化PD-1/lag-3转基因小鼠皮下荷瘤模型中,YG-003D3表现出优于亲本抗体及其联合组的抗肿瘤活性。进一步研究表明,YG-003D3能够显著改善肿瘤微环境中免疫细胞的比例(特别是肿瘤组织中CD4T、CD3T、CD8T细胞比例以及外周血中CD3T、CD8T、CD4T细胞比例)。上述结果表明,YG-003D3可以更有效地激活机体抗肿瘤免疫反应发挥强大的抗肿瘤作

关键词： PD-1 lag-3 双功能抗体肿瘤

PD-l、TIM-3、lag-3、BTLA的表达水平对弥漫大B细胞淋巴瘤预后的影响

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PD-l、TIM-3、LAG-3、BTLA的表达水平对弥漫大B细胞淋巴瘤预后的...

作者：刘笑吟郑州大学

学位级别：硕士

目的探讨程序性死亡受体-1(Programmed cell death-1,PD-1)、T细胞免疫球蛋白粘蛋白分子-3(T cell immunoglobulin domain and mucin domain-3,TIM-3)、淋巴细胞活化基因-3(Lymphocyte activation gene-3,lag-3)、B和T淋巴细胞衰减因子(B-and T-lymphocyte attenuator,BTLA)在弥漫大B细胞淋巴瘤,非特指型(Diffuse large B-cell lymphoma,not otherwise specified,DLBCL,NOS)和坏死性淋巴结炎组织中的表达水平,并探讨PD-1、TIM-3、lag-3、BTLA单个表达或其中几个分子共表达对DLBCL患者的完全缓解(CR)率、无进展生存期(Progression-free survival,PFS)和总生存期(Overall survival,OS)的影响。方法1.分别选取2013年04月～2016年05月在河南省人民医院初次确诊的30例DLBCL,NOS患者为实验组,2018年1月～2019年12月确诊的18例坏死性淋巴结炎患者为对照组,并收集每个病例的临床资料。2.调取上述48例患者的石蜡标本,制成4μm的薄片,通过免疫组织化学染色的方法检测PD-1、TIM-3、lag-3、BTLA的表达水平,并采用H评分的数值来表示,所得到的H评分均为0～9之间的整数。运用统计学方法分析对照组与实验组中上述蛋白表达水平的差异及实验组中上述蛋白单独阳性表达或其中几个蛋白共表达对疾病的临床生物学特点、CR率、PFS和OS的影响。结果1.坏死性淋巴结炎组织和DLBCL,NOS组织中PD-1的H评分的中位数分别是4和1(Z=—5.285,P3蛋白的H评分的中位数分别是5和2(Z=-3.620,Plag-3、BTLA表达水平无统计学差异(P>0.05)。2.研究PD-1、TIM-3、lag-3、BTLA表达水平与DLBCL,NOS的临床生物学特征之间的关系发现:PD-1、TIM-3、lag-3共表达组和非共表达组ECOG评分为2～4分的患者分别占75.0%和31.8%(P=0.049);两组间IPI评分为3～5 分的患者分别占 100.0%和 36.4%(P=0.003);此外,PD-1、TIM-3、lag-3、BTLA共表达组和非共表达组IPI评分为3～5分的患者分别占100.0%和39.1%(P=0.007)。3.探讨PD-1、TIM-3、lag-3、BTLA表达水平对CR率和死亡率的影响发现:PD-1、TIM-3、lag-3共表达组具有更高的死亡率(75.0%VS 31.8%;P=0.049);此外,PD-1、TIM-3、lag-3、BTLA 共表达组具有更低的 CR率(28.6%VS 78.2%;P=0.026)。4.探讨PD-1、TIM-3、lag-3、BTLA表达水平对PFS率和OS的影响发现虽然PD-1、TIM-3、lag-3、BTLA单个阳性表达对PFS和OS均无影响,但是PD-1、TIM-3共表达组和非共表达组的中位PFS分别是26个月和54个月(P=0.021),TIM-3、BTLA共表达组和非共表达组的中位PFS分别是24个月和47个月(P=0.037);PD-1、TIM-3、lag-3共表达组和非共表达组的中位PFS分别为17个月和41个月,3年PFS%分别是12.5%和50.0%(χ2=5.076,P=0.024);两组间中位OS时间分别为25个月和60个月,3年OS%分别是25.0%和 76.6%(χ2=5.929,P=0.015)。此外,PD-1、TIM-3、lag-3、BTLA 共表达组和非共表达组的中位PFS时间分别为18个月和40个月,3年PFS%分别是14.3%和47.8%(χ2=4.302,P=0.038);两组间中位OS时间分别为27个月,和58个月,3 年 OS%分别是 28.6%和 73.0%(χ2=4.168,P=0.041)。***回归分析发现,仅PD-1、TIM-3共表达是DLBCL,NOS患者PFS的独立影响因素(P=0.040,HR=5.394,HR95%CI:1.079～26.958)。结论***-1、TIM-3、lag-3共表达与较高的ECOG评分、较高的IPI评分有关而PD-1、TIM-3、lag-3、BTLA共表达与较高的IPI评分有关。2.生存分析发现,PD-1、TIM-3共表达组和TIM-3、BTLA共表达组仅具有较差的 PFS;PD-1、TIM-3、lag-3 共表达组和 PD-1、TIM-3、lag-3、BTLA共表达组不仅具有

关键词：弥漫大B细胞淋巴瘤 PD-1 TIM-3 lag-3 BTLA 预后