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假单胞菌M18转录调节因子σ^S基因与无启动子lacz基因融合突变株的构建和鉴定

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微生物学报 2006年第5期46卷 709-713页

作者：葛宜和许煜泉上海交通大学生命科学技术学院

通过菌落原位杂交和Southern杂交,从假单胞菌M18基因组文库中克隆了rpoS基因及相邻序列。为了深入研究影响rpoS基因表达的调控因素,运用同源重组技术,将无启动子β-半乳糖苷酶基因(-′lacz)插入并融合于rpoS基因中,构建了假单胞菌M18rpo... 详细信息

通过菌落原位杂交和Southern杂交,从假单胞菌M18基因组文库中克隆了rpoS基因及相邻序列。为了深入研究影响rpoS基因表达的调控因素,运用同源重组技术,将无启动子β-半乳糖苷酶基因(-′lacz)插入并融合于rpoS基因中,构建了假单胞菌M18rpoS基因突变株M18SZ。Miller法测定显示,突变株M18SZ的β-半乳糖苷酶可高达480U,而野生株检测不到β-半乳糖苷酶活性。表明,突变株中的rpoS基因与无启动子β-半乳糖苷酶基因已融合并且表达。在KMB培养基中生长量测定(OD600)的结果表明,突变株与野生株生长存在显著差异。

关键词：假单胞菌M18 rpoS lacz 插入突变融合鉴定

dspp-lacz转基因小鼠G0代的制备和鉴定

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上海口腔医学 2005年第2期14卷 151-154页

作者：孙汉堂肖明振吴补领费俭徐国江第四军医大学口腔医学院口腔内科中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所上海南方模式生物研究中心上海201203 上海南方模式生物研究中心

目的:构建小鼠牙本质涎磷蛋白(DSPP)特异性启动子启动lacz表达的转基因小鼠G0代。方法:用PCR方法获得DSPP编码序列上游约1.6kb的启动子序列,测序确认后,通过亚克隆方法将其与lacz编码序列连接到同一个质粒中,构建转基因载体pTN-DPM-lacz... 详细信息

目的:构建小鼠牙本质涎磷蛋白(DSPP)特异性启动子启动lacz表达的转基因小鼠G0代。方法:用PCR方法获得DSPP编码序列上游约1.6kb的启动子序列,测序确认后,通过亚克隆方法将其与lacz编码序列连接到同一个质粒中,构建转基因载体pTN-DPM-lacz;将线性化的载体DNA注射到小鼠受精卵的雄原核,移植到假孕母鼠的输卵管;仔鼠出生后4周,用PCR检测阳性小鼠。结果:注射的受精卵共503个,移卵后产仔89只,阳性12只,阳性鼠分别传代开始建系。结论:通过显微注射方法获得12只G0代dspp-lacz转基因小鼠,正在建立中的转基因小鼠系将来可以用作研究DSPP确切表达谱的工具。

关键词：小鼠牙本质涎磷蛋白转基因 lacz

大肠杆菌耐热性肠毒素ST_1－lacz融合基因的构建

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中国兽医学报 1994年第4期14卷 313-319页

作者：许崇波冯书章刘子刘晓明岳军明农牧大学军事兽医研究所

利用含大肠杆菌耐热性肠毒素ＳＴ１基因的质粒ｐＢＳＴ２－６和含ＬａｃＺ基因（编码β－半乳糖苷酶）的载体ｐＵＣ１８，构建成ＳＴ１－ＬａｃＺ融合基因。将质粒ｐＢＳＴ２－６用限制性内切酶ＢａｍＨＩ和ＢｇｌⅡ消化，经３％琼脂糖... 详细信息

利用含大肠杆菌耐热性肠毒素ＳＴ１基因的质粒ｐＢＳＴ２－６和含ＬａｃＺ基因（编码β－半乳糖苷酶）的载体ｐＵＣ１８，构建成ＳＴ１－ＬａｃＺ融合基因。将质粒ｐＢＳＴ２－６用限制性内切酶ＢａｍＨＩ和ＢｇｌⅡ消化，经３％琼脂糖凝胶电泳分离、透析袋电洗脱法回收１４７ｂｐＤＮＡ片段，再将载体ｐＵＣ１８用ＢａｍＨＩ消化、碱性磷酸酶处理，最后将处理好的ｐＵＣ１８ＤＮＡ与１４７ｂｐＳＴ１ＤＮＡ通过Ｔ４ＤＮＡ连接酶进行粘性末端连接，转化至受体菌ＤＨ５ａ中。通过菌落原位杂交筛选，共筛选出５３个为ＳＴ１基因探针杂交阳性的菌落。菌落原位杂交阳性的菌株经培养和抽提纯化质粒后，经限制性内切酶（ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ和ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ）酶切分析和ＤＮＡ序列分析，证明重组质粒ｐＸＳＴ１含有ＳＴ１基因，而且ＳＴ１基因在重组ＤＮＡ中连接方向是正确的，具有正确的阅读框架。再者，ＤＨ５ａ（ｐＸＳＴ１）菌株能在含ｘ－Ｇａｌ的ＬＢ平板上长成蓝色菌落，表明该菌株能表达具有β－半乳糖苷酶活性的大肠杆菌耐热性肠毒素ＳＴ１－β－半乳糖苷酶融合蛋白。ＳＴ１－ＬａｃＺ融合基因的构建，为研究ＳＴ的免疫原性和抗ＳＴ抗体在预防产肠毒素性大肠杆菌（ＥＴＥＣ）感染中的作用?

关键词：大肠杆菌肠毒素 lacz 基因融合基因基因克隆

副溶血弧菌生物膜及lacz报告基因融合实验技术平台的建立

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副溶血弧菌生物膜及LacZ报告基因融合实验技术平台的建立

作者：杜德燕四川农业大学

学位级别：硕士

背景：副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus, VP)是一种革兰阴性嗜盐弧菌。广泛分布于海洋和其他咸水环境中,多数海产品均天然携带本菌,人们食入未煮熟或烹饪不当的产品,会引起胃肠炎或食物中毒,其流行具有季节性,一般温暖的月份(5月-10... 详细信息

背景：副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus, VP)是一种革兰阴性嗜盐弧菌。广泛分布于海洋和其他咸水环境中,多数海产品均天然携带本菌,人们食入未煮熟或烹饪不当的产品,会引起胃肠炎或食物中毒,其流行具有季节性,一般温暖的月份(5月-10月)易爆发。该菌最早是从1950年日本大阪的海产品食物中毒事件体检中筛选出来,此事件中由该菌引发上的食物中毒占40-60%。近几年由VP引起急性胃肠炎占世界之首,在我国,特别是一些沿海城市,中毒事件在数量上超过沙门氏菌,是食源性病原菌之首。其主要症状表现为：腹泻、下腹绞痛、反胃、呕吐,治疗不及时会引起败血病及组织感染,严重者甚至死亡。因此,为降低食源性疾病的风险,有必要对副溶血弧菌的致病机制进行深入研究。副溶血弧菌在生存和感染的过程中都能形成生物膜,同霍乱弧菌(Vibrio cholerae),哈氏弧菌(Vibrio harveyi)及创伤弧菌(Vibrio vulnificus)一样,生物膜在其适应环境和广泛传播过程中发挥着重要作用。生物膜的形成和消散是一个动态过程,这过程存在一系列基因表达的变化,而主要调控这些基因表达的就是密度感应(Quorum Sensing,QS)系统,VP的QS系统调控子蛋白OpaR与哈氏弧菌的LuxR在氨基酸序列上有96%的同源性,因此二者的QS系统应该具有相似的作用机制。虽然表型实验及表达谱分析表明OpaR能调控VP荚膜多糖基因、胞外多糖基因、c-di-GMP分子代谢及鞭毛基因等生物膜形成相关基因的表达,但是OpaR对这些基因的转录调控机制并未被阐明,因此有必要做进一步的研究。目的：本研究目的期望建立副溶血弧菌RIMD2210633生物膜表型分析实验方案和lacz实验的技术平台。为进一步研究转录调控子OpaR的转录调控机制,以及副溶血弧菌后其他调控子的功能奠定基础。方法：(1)生物膜表型实验方案：生物膜形成过程中可能会受很多因素的影响,包括温度、pH、盐度、营养状况、培养方式及培养基等,通过对这些因素的比较和分析,建立了3种不同的生物膜表型分析方法(菌落表面褶皱、生物膜基质的刚果红染色、生物膜的结晶紫染色)。并通过对VP突变株(ΔopaR、ΔtoxR)与野生株(J5421)的生物膜测定分析,来验证这三个生物膜表型试验各自的技术平台的稳定性。 (2)lacz报告基因融合实验技术：PCR扩增靶基因的整个启动子区序列,并将其直接克隆入pHRP309质粒中,构建重组质粒。将VPA1513重组质粒转入VP野生株(WT)和OpaR突变株(AopaR)中,而后通过比较二者β-半乳糖苷酶活性的差异,确定OpaR对VPA1513的调控关系,以检验实验平台的稳定性。结果：30℃比37℃更适合VP生长而形成生物膜,在两种温度下,200rpm振荡培养12h就到平台期了;VP在营养丰富的HI平板比营养次之的LB、M、APW#3平板的菌落褶皱更明显;盐浓度越低(为0.5%)褶皱越明显;静置培养更适合褶皱表型,100rpm摇动培养方式更适合生物膜形成的定量测定;生物膜的形成在中性和偏碱环境中的差别不大;培养时间对刚果红染色的影响没有菌落表面褶皱那么明显,但都有培养时间越长表型越明显的趋势;三种生物膜表型分析试验都证明了OpaR负调控和ToxR正调控生物膜形成。用载体pHRP309成功构建出9个与VP生物膜或毒力相关基因的的lacz(?)重组质粒;并通过测定VP突变株AopaR与野生株(J5421)β-半乳糖苷酶活性的差异,证明了OpaR对VPA1513的转录具有抑制作用。结论：成功建立了菌落表面褶皱、生物膜基质的刚果红染色、生物膜的结晶紫染色三种VP生物膜相关的表型试验和lacz报告基因融合实验的稳定的技术平台。发现了温度、盐浓度、培养时间、培养方式和营养状况对生物膜形成有影响,且偏碱环境不会影响生物膜的形成。本研究给后续生物膜表型和其他转录调控机制的研究奠定了基础。

关键词： VP 生物膜表型 lacz OpaR 调控

β-半乳糖苷酶基因(lacz)在大型经济海藻裙带菜中的瞬间表达

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高技术通讯 2002年第8期12卷 93-95页

作者：于道展秦松孙国琼曾呈奎中国科学院海洋研究所

用高压氦气式基因枪将SV4 0启动子驱动下的 β 半乳糖苷酶基因 (lacz)导入大型经济海藻裙带菜不同部位的组织切块中 ,4 8小时后染色检测 ,在假根、孢子叶和叶片中均检测到了lacz的瞬间表达。研究还发现 ,对于裙带菜组织块的基因枪法转... 详细信息

用高压氦气式基因枪将SV4 0启动子驱动下的 β 半乳糖苷酶基因 (lacz)导入大型经济海藻裙带菜不同部位的组织切块中 ,4 8小时后染色检测 ,在假根、孢子叶和叶片中均检测到了lacz的瞬间表达。研究还发现 ,对于裙带菜组织块的基因枪法转化 ,压强130 0psi优于 110 0psi。另外在裙带菜中没有发现半乳糖苷酶的染色本底。本文结果提示 :基因枪法是有效的裙带菜遗传转化方法 ;lacz可以作为裙带菜基因工程研究的报告基因 ,SV4 0启动子能有效驱动外源基因在裙带菜中表达 ,没有组织特异性。这是lacz在裙带菜中表达的首次报道。

关键词： β-半乳糖苷酶基因大型经济海藻裙带菜 lacz SV40启动子基因枪法瞬间表达培育基因工程

lacz DNA标记的腺病毒在高氧性肺损伤基因治疗中的转染和致炎作用

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新课程学习(下) 2012年第2期 10-12页

作者：王燕 Aron B.Fisher Feistein S Sheldon 张灵恩上海市徐汇区中心医院儿科 the Institute of Environmental Medicine the Center of Lung BiologyUniversity of PennsylvaniaUSA 上海复旦大学医学院儿科医院ICU

目的:laczDNA标记的腺病毒在高氧性肺损伤基因治疗中的转染和致炎作用。方法:装载laczDNA的腺病毒在小鼠高氧模型开始前2天经鼻腔送入体内,X-gal染色和β-半乳糖酶活性测定用于确定laczDNA在肺内转染的分布及其蛋白表达产物的活性;小鼠... 详细信息

目的:laczDNA标记的腺病毒在高氧性肺损伤基因治疗中的转染和致炎作用。方法:装载laczDNA的腺病毒在小鼠高氧模型开始前2天经鼻腔送入体内,X-gal染色和β-半乳糖酶活性测定用于确定laczDNA在肺内转染的分布及其蛋白表达产物的活性;小鼠肺干/湿重比和支气管肺泡盥洗液(BALF)内的蛋白浓度的测定用于鉴定腺病毒在基因治疗过程中可能存在的致炎作用。结果:X-gal染色显示laczDNA在高氧前及后均可广泛转染在肺各级支气管和肺泡上皮细胞,β-半乳糖酶活性的测定提示了laczDNA可成功地翻译成其蛋白质表达产物并表现为高表达;同时,腺病毒的致炎作用在高氧吸入48h后示小鼠肺干/湿重比和BALF蛋白浓度均较其他对照组明显升高,但其升高的程度可在24h后迅速缓解上升趋势。结论:腺病毒为载体的基因治疗可有效地转染标记基因,同时,腺病毒虽在基因治疗的过程中有一定的致炎作用,但是暂时的,其仍是有效的DNA载体。

关键词：腺病毒基因治疗 lacz 高氧性肺损伤载体

nifA基因对于Escherichia coli中受nif启动子控制的lacz表达的作用

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中国科学:化学 1982年第10期 898-906页

作者：孔秋桐,吴期隆,贾立斌,MichaelSyvanen,E.C.C.Lin,沈善炯中国科学院上海植物生理研究所中国科学院上海植物生理研究所中国科学院上海植物生理研究所中国科学院上海植物生理研究所中国科学院上海植物生理研究所中国科学院上海植物生理研究所访问教授Department of Microbiology and Molecylar Genetics Harvard Medical school Boston 访问教授Department of Microbiology and Molecylar Genetics Harvard Medical school Boston 13]Massachuserfs U.S.A. 9]Massachuserfs U.S.A.

本文作者构建了两类重组质粒:一类包含nifH启动子-lacz的融合,另一类包含了受质粒四环素抗性基因启动子控制的nifA基因。由于这两类质粒不属于同一的不亲和群,因而能够在Escherichia coli的同一细胞内各自复制。发现nifA基因产物对激活... 详细信息

本文作者构建了两类重组质粒:一类包含nifH启动子-lacz的融合,另一类包含了受质粒四环素抗性基因启动子控制的nifA基因。由于这两类质粒不属于同一的不亲和群,因而能够在Escherichia coli的同一细胞内各自复制。发现nifA基因产物对激活nif启动子的转录是必需的,并证实了nifA产物的温度敏感性,以及在nifA参与下nfi启动子控制lacz的表达受到铵和L-丝氨酸的阻遏。

关键词：启动子区 nifA Escherichia coli 子控制基因质粒基因载体 nif lacz

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Ad lacz对肿瘤感染效率的实验研究

赣南师范学院学报 2015年第3期36卷 66-68页

作者：陈慧余雳杨潮赣南师范学院生命与环境科学学院江西赣州341000 湖南大学生物学院医学工程系细胞与组织工程实验室长沙410082

基于腺病毒的靶向基因治疗是肿瘤生物治疗方式之一.为了更好的了解腺病毒靶向药物在裸鼠实体瘤中的运作效果,本研究中利用重组腺病毒报告载体Ad lacz分别转染人肿瘤细胞系和裸鼠实体瘤,结合X-gal染色和组织切片的方法观察腺病毒载体在... 详细信息

基于腺病毒的靶向基因治疗是肿瘤生物治疗方式之一.为了更好的了解腺病毒靶向药物在裸鼠实体瘤中的运作效果,本研究中利用重组腺病毒报告载体Ad lacz分别转染人肿瘤细胞系和裸鼠实体瘤,结合X-gal染色和组织切片的方法观察腺病毒载体在实体瘤原位转染后的运作模式,为实体瘤实验提供更多的经验借鉴和实验基础.

关键词：基因治疗 Ad lacz X-gal 实体瘤细胞密度

杆状病毒介导lacz基因转染体外培养的人虹膜色素上皮细胞(英文)

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眼视光学杂志 2003年第4期5卷 228-230页

作者：彭颖周翔天付小莹吕建新瞿佳温州医学院细胞与分子医学研究所浙江温州325027 温州医学院眼视光学院浙江温州325027

目的 :研究重组杆状病毒 (baculovirus)载体介导 β 半乳糖苷酶基因 (lacz)对体外培养虹膜色素上皮(IPE)细胞的转染和表达情况。方法 :将质粒pCMV β中的CMV lacz表达盒插入杆状病毒表达载体pFastBacI的EcoRI/HindⅢ位点 ,构建重组质粒p... 详细信息

目的 :研究重组杆状病毒 (baculovirus)载体介导 β 半乳糖苷酶基因 (lacz)对体外培养虹膜色素上皮(IPE)细胞的转染和表达情况。方法 :将质粒pCMV β中的CMV lacz表达盒插入杆状病毒表达载体pFastBacI的EcoRI/HindⅢ位点 ,构建重组质粒pBac β ,并利用Bac to Bac表达系统在Sf9细胞中产生出重组杆状病毒BV β。将MOI为 2 0 0的BV β感染经酶消化加显微法分离培养的IPE细胞 ,2 4h后进行X gal染色。在显微镜下观察IPE中lacz表达阳性的情况 ,记录阳性细胞所占的百分比。结果 :限制性酶切分析及测序结果表明 ,我们已成功构建表达质粒pBac β及重组杆状病毒BV β。X gal染色证实杆状病毒介导lacz在细胞中的表达呈蓝色 ,弥漫于整个胞浆。感染后 2 4h时表达阳性率达 85 %。结论 :重组杆状病毒可有效介导报告基因在体外培养的IPE细胞中表达 ,为利用杆状病毒构建可供移植的基因工程化虹膜色素上皮细胞提供了实验依据。

关键词：杆状病毒 lacz 基因转染体外培养人虹膜色素上皮细胞 β-半乳糖苷酶基因