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畜牧兽医学报 2020年第7期51卷 1737-1747页

作者：倪爱心李云雷葛平壮王攀林 Adamu Mani Isa 石雷范静孙研研孙鸿麻慧陈继兰中国农业科学院北京畜牧兽医研究所农业部动物遗传育种与繁殖(家禽)重点实验室北京100193 北京优帝鸽业有限公司北京101300

旨在研究鸽毛滴虫是否分泌外泌体及虫源外泌体的蛋白组成和功能,为探索外泌体在鸽毛滴虫寄生过程中的作用奠定基础。采集鸽毛滴虫感染个体口腔及咽部病灶处样本,进行分离培养及纯化,使用显微镜鉴定虫体形态,提取DNA并比对其序列,确定培... 详细信息

旨在研究鸽毛滴虫是否分泌外泌体及虫源外泌体的蛋白组成和功能,为探索外泌体在鸽毛滴虫寄生过程中的作用奠定基础。采集鸽毛滴虫感染个体口腔及咽部病灶处样本,进行分离培养及纯化,使用显微镜鉴定虫体形态,提取DNA并比对其序列,确定培养物是否为鸽毛滴虫虫株;通过对培养液上清进行超速离心,透射电子显微镜、Western blot技术和纳米颗粒追踪分析(nanoparticle tracking analysis,NTA)鉴定培养液上清中是否含有虫源外泌体;最后通过label-free技术分析虫源外泌体的蛋白质谱表达。结果显示,虫体具有明显的毛滴虫形态及特征,与鸽毛滴虫ITS1/5.8S/ITS2基因比对率达98%。从虫体培养液中提取的囊泡经透射电子显微镜观察具有明显的茶托样结构;NTA结果显示,粒径集中于125.1 nm,峰值粒径为132.3 nm,占比99.3%;CD63和TSG101等外泌体标记蛋白的条带明显,表明提取物为外泌体。质谱结果显示,烯醇酶、3-磷酸甘油醛-脱氢酶、磷酸甘油酸变位酶和延伸因子为表达量较高的蛋白质。GO功能注释显示外泌体蛋白富集到细胞内和胞浆等细胞组分,发挥GTP连接和GTP酶活性功能,参与小GTPase介导的信号转导与糖酵解等过程。KEGG通路富集表明,虫源外泌体蛋白主要富集于代谢途径、糖酵解/糖异生、抗生素的生物合成和次级代谢产物的生物合成等通路。本研究发现鸽毛滴虫可以分泌外泌体,并对虫源外泌体进行蛋白质谱分析,提示虫源外泌体中的蛋白质在寄生虫的能量代谢、信号转导及生物合成等过程中发挥重要作用。

关键词：鸽毛滴虫外泌体 label-free技术蛋白质谱分析

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盐胁迫下AM真菌对沙枣叶片光合生理和蛋白质组的影响

盐胁迫下AM真菌对沙枣叶片光合生理和蛋白质组的影响

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作者：贾婷婷黑龙江大学

学位级别：硕士

试验采用盆栽法,对接种丛枝菌根真菌(Arbuscular mycorrhizal fungi,AMF)根内球囊霉(Glomus intraradices,GI)与未接种AMF(CK处理)的沙枣幼苗进行浓度为0、100、200 mmol/L和300 mmol/L Na Cl胁迫处理,测定不同处理沙枣叶片的光合特性... 详细信息

试验采用盆栽法,对接种丛枝菌根真菌(Arbuscular mycorrhizal fungi,AMF)根内球囊霉(Glomus intraradices,GI)与未接种AMF(CK处理)的沙枣幼苗进行浓度为0、100、200 mmol/L和300 mmol/L Na Cl胁迫处理,测定不同处理沙枣叶片的光合特性、可溶性糖和可溶性蛋白等生理指标,以及应用非标记定量蛋白质组学(label-free)技术对沙枣叶片(0和300 mmol/L Na Cl处理的苗木)蛋白质组进行分析。以期揭示盐胁迫下AMF对苗木光合生理特性的影响以及沙枣幼苗对盐胁迫响应的分子机制。研究结果表明:随着盐浓度的增加,GI和CK处理的沙枣幼苗叶片Pn、Tr、Gs及Ci均显著下降,但是在同一个盐浓度下,接种GI处理的沙枣叶片这些指标显著高于CK处理组(plabel-free技术对差异表达蛋白进行鉴定和定量分析,最终确定75个差异蛋白表现出对盐胁迫的响应变化,这些蛋白主要参与代谢、信号转导、蛋白质合成/蛋白质折叠和降解、ROS清除,光合作用、能量等途径。基于差异表达蛋白的功能分类和生理上的变化,我们发现,利用菌根化植物可以缓解盐胁迫伤害可能的机制如下:(1)AMF加快植物的次生代谢及其他重要的代谢,次生代谢产物及衍生物加快积累;(2)AMF提高第二信使Ca的信号转导,提升感知和传递胁迫信号的速度,使植物做后续的防御;(3)在多种抗氧化途径中(TRX/GRX、GST/GPX、POD),AMF通过提高ROS清除加强了植物的抗氧化能力;(4)AMF保护蛋白质生物合成、折叠、运输和抑制蛋白质的降解;(5)在叶绿体中,AMF维持PSⅡ反应中心构象的稳定,加快光合电子传递;在线粒体中,AMF增强ATP的合成,为细胞活动提供能量。这项研究深入揭示了菌根化植物提高耐盐能力的机制,为利用盐生植物与AMF共生用于盐碱地的改良奠定了一定的理论基础。

关键词： AM真菌盐胁迫光合生理沙枣 label-free技术

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布鲁氏菌TCS TceSR和TcfSR的蛋白组学和转录组学分析

布鲁氏菌TCS TceSR和TcfSR的蛋白组学和转录组学分析

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作者：王红红石河子大学

学位级别：硕士

布鲁氏菌(Brucella)和人苍白杆菌(***)亲缘关系很亲密,都属于Proteobacteria类的α-2亚类。但是致病能力却相差很大,布鲁氏菌是一种可引起人兽共患的强致病菌,能够对全世界范围内的公共卫生安全造成严重的危害;而人苍白杆菌是一种条件... 详细信息

布鲁氏菌(Brucella)和人苍白杆菌(***)亲缘关系很亲密,都属于Proteobacteria类的α-2亚类。但是致病能力却相差很大,布鲁氏菌是一种可引起人兽共患的强致病菌,能够对全世界范围内的公共卫生安全造成严重的危害;而人苍白杆菌是一种条件性致病菌,对人类的危害较小。二元调控系统(Two-component systems,TCS)是广泛存在于细菌中的一类重要的毒力调控系统,可以通过感应和处理环境信号来发挥其调控作用。该系统由组氨酸蛋白激酶(histidine protein kinase,HK)和反应调控子(response-regulator protein,RR)组成。比较基因组学发现,布鲁氏菌和苍白杆菌在基因组序列上差异较小,TCS是他们的主要差异之一。在苍白杆菌中缺少布鲁氏菌染色体II上的二元调控系统TceSR和TcfSR。先前研究表明位于染色体I上的12对TCS能够调控布鲁氏菌的能量代谢和转运、生物大分子合成、细菌分裂以及细菌生存繁殖等与布鲁氏菌毒力密切相关的基因,但位于染色体II上的的二元调控系统TceSR和TcfSR毒力表型和致病机制尚不清楚。本研究以突变株16M△TceSR和16M△TcfSR为研究对象,通过对其转录组测序和比较蛋白组研究的分析,揭示由二元调控系统TceSR和TcfSR调控的布鲁氏菌的致病基因和致病性蛋白,为布鲁氏菌的致病机制的研究和开发有效的治疗药物及疫苗奠定基础。目的:本研究以羊种布鲁氏菌亲本株16M和突变株16M△TceSR和16M△TcfSR为研究对象,体外模拟巨噬细胞内的环境,找出TCS TceSR和TcfSR体外高效表达的条件,在此条件下培养亲本株株16M和突变株16M△TceSR和16M△TcfSR,通过转录组学和比较蛋白组学研究深入探讨TCS TceSR和TcfSR在布鲁氏菌中的调控网络及其与布鲁氏菌致病性的关系,以期解释TCS TceSR和TcfSR感受和处理环境信号后如何调控靶基因转录和靶蛋白的表达,从而促进布鲁氏菌的生存。通过本实验的研究为布鲁氏菌的致病机制提供重要的信息。方法:(1)体外模拟细菌在巨噬细胞内的环境,先将亲本株16M在TSB中培养至对数生长期,收菌重悬于高盐、低p H、高温、营养缺乏等环境压力下刺激0.5h,收菌提RNA,反转录成c DNA。针对Tce S、Tce R、Tcf S、Tcf R四个基因设计引物利用q RT-PCR技术确定最佳刺激条件。确定了最佳的刺激条件以后,将细菌在该条件下刺激不同的时间(0.5h、l.5h、3h、4.5h、6h),提取细菌RNA,反转录成c DNA后进行实时定量PCR检测,确定最佳刺激时间。(2)在体外表达最佳条件中培养亲本株16M和突变株16M△TceSR和16M△TcfSR,制备全菌样品样品。采用label-free技术,并结合生物信息学分析,筛选出在缺失株和亲本株中差异表达的蛋白,以期揭示TCS TceSR和TcfSR在布鲁氏菌中的调控网络与致病性的关系。(3)在体外表达最佳环境中培养亲本株16M和缺失株16M△TceSR和16M△TcfSR,培养至最佳时间点时,收集菌体,提取RNA,采用RNA-seq技术,并结合生物信息学分析,筛选出在突变株和亲本株中差异表达的基因,以期揭示TCS TceSR和TcfSR在布鲁氏菌中的调控网络与致病性的关系。结果:(1)通过体外模拟巨噬细胞内的环境,利用q RT-PCR方法确定了细胞在营养缺乏、p H值为4的情况下刺激3h时,Tce S、Tce R、Tcf S、Tcf R四个基因的表达量均是最高。因此将体外高效表达的条件确定为GEM4.0中刺激3h。(2)比较蛋白质组结果显示:在亲本株16M和突变株16M△TceSR中共有465个蛋白的表达发生了变化,差异表达倍数在2以上的有257个。在突变株16M△TceSR差异表达倍数在两倍以上的下调蛋白共有147个,上调蛋白共110个。这些发生表达变化的蛋白主要是与碳氮代谢、二元调控系统、细胞分裂、热休克蛋白、外膜蛋白、氧化磷酸化、ABC转运子和转录相关的蛋白。在亲本株16M和16M△TcfSR中共有137个蛋白的表达发生变化,在这些差异表达的蛋白中我们选取差异表达倍数两倍以上的作为差异表达蛋白的研究对象,共86个,其中在突变株16M△TcfSR中表达上调的有44个,表达下调的有42个。这些差异表达的蛋白主要与布鲁氏菌的代谢、氧化磷酸化、膜转运、IV型分泌系统、转录和蛋白质运输和RNA降解相关。(3)转录组结果显示:在16M和16M△TceSR中的每个菌株中共检测了3121个基因,与16M相比,在16M△TceSR中共有331个基因的表达发生了显著的变化,其中有137个基因在突变株中显著的下降,194个基因的表达发生了

关键词：布鲁氏菌 TCS TceSR和TcfSR 转录组测序 label-free技术

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