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一种基于lvpc与VNTR的副溶血性弧菌基因分型新方法

一种基于LVPC与VNTR的副溶血性弧菌基因分型新方法

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作者：肖潇中国人民解放军军事医学科学院

学位级别：硕士

副溶血性弧菌是革兰氏阴性的嗜盐弧菌,广泛分布于港口、海水沿岸、海河交界处等,通过污染的海产品引起人类急性胃肠炎及旅行者性腹泻。其主要毒力因子包括耐热性直接溶血素(TDH)、与TDH相关溶血素(TRH)、不耐热溶血素(TLH)和Ⅲ型分泌系... 详细信息

副溶血性弧菌是革兰氏阴性的嗜盐弧菌,广泛分布于港口、海水沿岸、海河交界处等,通过污染的海产品引起人类急性胃肠炎及旅行者性腹泻。其主要毒力因子包括耐热性直接溶血素(TDH)、与TDH相关溶血素(TRH)、不耐热溶血素(TLH)和Ⅲ型分泌系统(T3SS)。这些毒力因子大多数具有细胞毒性和(或)肠毒性。根据菌体(O)抗原和荚膜(K)抗原可将副溶血性弧菌至少分为13个O血清群和71个K血清型。在1995年以前,与副溶血性弧菌相关的胃肠炎均由不同种血清型引起。然而,自从1996年2月在印度加尔各答首次爆发了由副溶血性弧菌引发的大规模食物中毒,这种血清型为O3:K6菌株(KP+,tdh+, trh-)迅速在世界各地广泛流行,尤其以沿海国家和地区为主。目前将这些1996年以后分离的血清型以O3:K6为主,包括O4:K68、O1:K25、O1:KUT,经脉冲场凝胶电泳(PFGE)、随机引物PCR(AP-PCR)及多位点序列分析(MLST)鉴定具有非常相似的指纹图谱(FPs)或序列型(STs)统称为―流行群‖。高纯度基因组DNA的提取脂多糖(LPS)是细菌外膜重要的组成部分,除此以外,某些革兰氏阴性菌还产生其它两种多糖:菌表多糖与荚膜多糖。例如,副溶血性弧菌通过表达大量的菌表多糖形成生物膜,使其有利于在环境中生存和传播。无论是哪种形式的多糖都会在一定程度上干扰基因组DNA的提取,同时也影响了DNA的特性。在本研究中,以黏液型细菌副溶血性弧菌RIMD2210633与肺炎克雷伯氏菌NTUH-K2044作为研究模型,以大肠埃希氏菌JM109作为对照,建立两种适用于提取黏性革兰氏阴性细菌基因组DNA的新方法。三种细菌基因组DNA的提取使用了三种方法,每种方法重复三次。方法Ⅰ为经典的饱和酚-氯仿抽提方法,方法Ⅱ与方法Ⅲ都在方法Ⅰ操作基础上进行了改进,分别增加了乙二醇甲醚或水饱和乙醚的步骤以去除多糖。三种方法得到的DNA产率各不相同,以方法Ⅰ最高,方法Ⅱ与方法Ⅲ由于增加了去除多糖的步骤明显降低了DNA产率。将各种方法提取的DNA经琼脂糖凝胶电泳,均有明亮的条带且无RNA污染与DNA降解。在本研究中,用A260/A280与A260/A230两个比值来评估三种方法提取的DNA纯度,三种方法在A260/A280均处于1.8～2.0,所以表明三种方法提取的DNA均无蛋白的污染。对于A260/A230≥2.0这个指标,只有方法II与方法III适合于所有实验菌株,而方法Ⅰ只适用于非黏性菌株JM109,对于副溶血性弧菌RIMD2210633与肺炎克雷伯氏菌NTUH-K2044其最高值也仅有1.4左右,因此存在严重的多糖污染。基于上述结果,本研究建立的方法II与方法III适用于黏性革兰氏阴性细菌基因组DNA的提取,这两种方法重复性高且花费少。当然,这两种方法也可以应用于革兰氏阳性细菌,只要在细胞裂解步骤(如对金黄色葡萄球菌加入溶葡萄球菌素)中加入溶菌酶即可。由于这两种方法所需成本较低,因此可大规模应用于黏性细菌基因组DNA的提取。基于差异分布的大片段基因簇(lvpc)的副溶血性弧菌基因分型本研究共使用251株副溶血性弧菌(S001-S251),其中包括193株临床分离株,58株环境分离株。基于之前的DNA芯片比较基因组学(M-GCH)研究,我们共筛选得到18个lvpc。用筛选得到的18个lvpc位点对251株副溶血弧菌进行PCR扩增,结果分别用“1”或“0”表示,其中“1”表示在该lvpc位点PCR扩增结果为阳性,“0”表示该lvpc位点PCR扩增结果为阴性。18个lvpc在一株菌中的存在或缺失可形成一个lvpc图谱,对所有菌株的lvpc图谱进行统计共有48个独特的lvpc图谱,即251株菌可分为48种lvpc型。根据获得的二元的lvpc数据通过非加权组平均法(UPGMA)对251株副溶血性弧菌进行聚类分析,得到最小扩展树(MS tree)。结合MS树与毒力分子标识的分布,将251株菌分成6个群,lvpc-C1～lvpc-C6。将基于lvpc与M-CGH数据构建的MS树进行比较,发现两者之间的拓扑结构非常相似。另外, lvpc所划分的5个群(lvpc-C1～lvpc-C5)与M-CGH生成的5个复合群(C1～C5)相对应。而对于lvpc-C6来说,该群只含有一株菌S093,经流行群特异性分子标识鉴定非流行群(GS-PCR+,tdh-;PGS+)。S093在基于lvpc所构建的MS树中为一个单独的单元型,存在于5个复合群之外,处于lvpc-C2与lvpc-C3之间,且与lvpc-C2遗传距离较近。其中,lvpc-C2所有菌株(共14株)均为1996年之前分离的旧O3:K6群。lvpc-C3中的所有菌株(63株)经流行群特异性分子标识鉴定均为流行群(GS-PCR+, tdh+, trh-;PGS+)。由于S093处于lvpc-C2与lvpc-C3之间,即

关键词：副溶血性弧菌黏性细菌基因组DNA提取多糖基因分型 lvpc VNTR

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肺炎克雷伯菌全基因组DNA芯片研制及基于lvpc分型方法研究

肺炎克雷伯菌全基因组DNA芯片研制及基于LVPC分型方法研究

引用

作者：刘梦颖重庆医科大学

学位级别：硕士

肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae，KP)为革兰阴性杆菌，在自然环境中分布广泛，主要存在于人和动物的呼吸道和肠道中。肺炎克雷伯菌是引起社区获得性感染和医院内感染的重要条件致病菌，引起的感染主要包括败血症、肺炎、泌尿道感... 详细信息

肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae，KP)为革兰阴性杆菌，在自然环境中分布广泛，主要存在于人和动物的呼吸道和肠道中。肺炎克雷伯菌是引起社区获得性感染和医院内感染的重要条件致病菌，引起的感染主要包括败血症、肺炎、泌尿道感染、脑脊膜炎。在革兰阴性菌引起的感染中，肺炎克雷伯菌已成为仅次于大肠杆菌的主要致病菌。过去的20年，在我国台湾以及日本、欧洲、北美和韩国等国家出现了社区获得性肺炎克雷伯菌化脓性肝脓肿，常常并发脑膜炎和眼内炎。近年来分子生物学技术的飞速发展，极大地促进了人们在基因水平上认识肺炎克雷伯菌。本研究利用完成测序的肺炎克雷伯菌全基因组序列，研制肺炎克雷伯菌的全基因组DNA芯片，建立基于芯片的比较基因组学技术平台;以及通过lvpc基因分型方法找出不同肺炎克雷伯菌株之间的差异;综合分析研究肺炎克雷伯菌基因组多态性，为从基因水平上探讨肺炎克雷伯菌的种群结构和基因组微进化奠定基础。肺炎克雷伯菌全基因组DNA芯片的研制根据肺炎克雷伯菌NTUH-2044全基因组序列，挑选出5075条基因，PCR扩增各基因并纯化产物，点样制备芯片。设计了3个质控杂交组合，采用双色荧光杂交策略，对芯片质量进行评价。据此成功研制了肺炎克雷伯菌全基因组DNA芯片，并建立了基于全基因组DNA芯片的肺炎克雷伯菌比较基因组学技术平台。基于差异分布的大片段基因簇（lvpc）的肺炎克雷伯菌基因分型通过比较基因组学对四株完成全基因组测序的肺炎克雷伯菌NTUH-K2044、MGH78578、HS11286、KCTC2242各自的基因集进行两两比对，如果满足coverage>80%并且identity>80%则认为两个基因同源，最终从获取的非冗余基因集中，筛选得到44个差异分布的大片段基因簇（lvpc,基因簇至少包括10个连续的基因，这些大片段基因簇在不同菌株的基因组中呈现不同的分布）。从差异分布的大片段基因簇中挑选一个有代表性的靶基因，根据靶基因设计引物，对82株强毒血清型（K1、K2、K5、K20、K54和K57）KP菌株进行PCR扩增，结果分别用“1”或“0”表示，其中“1”表示在该lvpc位点PCR扩增结果为阳性，“0”表示在该lvpc位点PCR扩增结果为阴性。根据获得的二元lvpc数据通过Cluster和Treeview软件进行聚类分析。82株KP菌株可分为30种lvpc型，聚类生成6个群，同一血清型的菌株聚类在一起，不同血清型的菌株分布在不同的大簇内，表现出各菌株的遗传多态性。基于lvpc的分型方法操作简单、费用低廉，可在短时间内对大量菌株进行分型。但是该方法的分辨率有限，可通过另外的分型方法弥补。

关键词：肺炎克雷伯菌 DNA芯片 lvpc 基因分型

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