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猪大肠杆菌不耐热肠毒素ltb基因的克隆及原核表达

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中国兽医科学 2011年第2期41卷 163-166页

作者：刘媛左玉柱范京惠河北农业大学动物科技学院河北保定071001

从河北省部分地区病猪中分离大肠杆菌,根据GenBank中登录的大肠杆菌不耐热肠毒素B亚基(ltb)基因序列,设计了1对引物,采用PCR技术扩增ltb的编码基因,得到一条375bp的片段。将其连入Simple-T载体中,经酶切、PCR及序列测定法进行鉴定。测... 详细信息

从河北省部分地区病猪中分离大肠杆菌,根据GenBank中登录的大肠杆菌不耐热肠毒素B亚基(ltb)基因序列,设计了1对引物,采用PCR技术扩增ltb的编码基因,得到一条375bp的片段。将其连入Simple-T载体中,经酶切、PCR及序列测定法进行鉴定。测序正确后,将该基因插入到pET-28a(+)载体中构建原核表达载体,将此重组质粒转化到Rosetta(DE3)感受态细胞中,并用IPTG诱导,将诱导产物用SDS-PAGE和Western-blot进行分析。结果显示,ltb基因可以在大肠杆菌中获得表达,表达产物分子质量约为14ku,与预计的蛋白分子质量大小一致。Western-blot分析表明,该蛋白可以与大肠杆菌免疫血清产生特异性结合反应,具有良好的抗原性,为大肠杆菌亚单位疫苗的研究奠定了基础。

关键词：不耐热肠毒素 ltb基因原核表达

空肠弯曲菌peb1A与大肠埃希菌ltb基因融合基因的构建、表达及鉴定

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中国病原生物学杂志 2015年第12期10卷 1100-1103页

作者：杜联峰夏墙余妍杨瑞宋明英孙万邦遵义医学院珠海校区贵州省免疫学研究生教育创新基地广东珠海519041

目的采用重叠PCR方法将大肠埃希菌不耐热肠毒素B亚单位ltb基因和空肠弯曲菌外膜蛋白peb1A基因进行连接,构建ltb-peb1A融合基因原核表达系统,对其进行诱导表达与鉴定。方法利用PCR技术扩增ltb与peb1A基因,用重叠PCR法将ltb与peb1A基因进... 详细信息

目的采用重叠PCR方法将大肠埃希菌不耐热肠毒素B亚单位ltb基因和空肠弯曲菌外膜蛋白peb1A基因进行连接,构建ltb-peb1A融合基因原核表达系统,对其进行诱导表达与鉴定。方法利用PCR技术扩增ltb与peb1A基因,用重叠PCR法将ltb与peb1A基因进行融合,然后插入pET-28a(+)中,构建原核表达载体pET28a(+)-ltb-peb1A。用重组体转化*** BL21(DE3),IPTG诱导表达重组蛋白ltb-PEB1,SDS-PAGE分析重组蛋白表达情况,ELISA法鉴定其与牛Gm1活性,Western blot鉴定重组蛋白的反应原性。结果 PCR及测序证实ltb-peb1A融合基因原核表达载体pET28a(+)-ltb-peb1A构建成功,SDS-PAGE分析目的蛋白最高表达量占全菌总蛋白的28%左右,其分子质量单位为40.7ku。ELISA法鉴定纯化的重组蛋白与牛Gm1有结合活性,Western blot分析重组蛋白能被兔抗空肠弯曲菌识别。结论成功构建了ltb-peb1A融合基因原核表达载体,并获得高效表达的目的蛋白,为空肠弯曲菌黏膜免疫疫苗的研制奠定了基础。

关键词： Peb1A基因 ltb基因大肠埃希菌不耐热肠毒素B亚单位原核表达黏膜佐剂基因融合

猪传染性胃肠炎病毒S蛋白A、D基因与猪大肠杆菌ltb基因的重组、克隆及原核表达

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猪传染性胃肠炎病毒S蛋白A、D基因与猪大肠杆菌LTB基因的重组、克...

作者：刘媛河北农业大学

学位级别：硕士

猪传染性胃肠炎（Transmissible gastroenteritis of swine,TGE）是由冠状病毒科冠状病毒属的猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV）引起的一种以呕吐、脱水、严重腹泻为主要特征的急性、高度接触... 详细信息

猪传染性胃肠炎（Transmissible gastroenteritis of swine,TGE）是由冠状病毒科冠状病毒属的猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV）引起的一种以呕吐、脱水、严重腹泻为主要特征的急性、高度接触性传染病。产肠毒素型大肠杆菌（Enterotoxigenic ***,ETEC）是引起仔猪腹泻的一种重要的肠道病原菌,能够引起仔猪黄痢和仔猪白痢等。根据GenBank中公布的TGEV的S蛋白A、D基因序列和大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位（ltb）基因序列,分别设计1对引物,采用RT-PCR技术扩增含A、D位点的S基因和ltb基因,各自将其插入pET-28a（+）载体中构建原核表达质粒,并进行PCR、酶切鉴定及序列测定。重组菌经诱导表达后,表达产物用SDS-PAGE和Western-blot进行检测。RT-PCR扩增得到了S基因片段,该基因全长980 bp,编码262个氨基酸,序列分析显示S基因与GenBank中公布的S基因序列同源性达97%以上,氨基酸序列同源性达95%以上,表明不同毒株S基因高度保守性。表达获得的S蛋白约33.7 ku,并且表达产物主要以包涵体的形式存在;Western-blot分析表明,表达的S蛋白可以被TGEV阳性血清所识别,具有反应原性。同样,PCR扩增得到的ltb基因全长375 bp,编码124个氨基酸,序列分析显示ltb基因与GenBank中公布的ltb基因序列同源性达99%以上,氨基酸序列同源性达98%以上。表达获得的ltb蛋白约14 ku。Western-blot分析表明,ltb蛋白能被ETEC阳性血清所识别,具有反应原性。重新设计1个引物,使ltb基因的终止密码子TAG突变为TAC,且在其下游添加EcoRI酶切位点。另设计1个引物,在S基因上游引入EcoRI酶切位点,并以上述试验扩增的S基因和ltb基因为模板,再次进行PCR扩增,扩增产物经酶切和连接等技术重组成ltb-S基因,该基因全长1371 bp,编码461个氨基酸。将ltb-S插入pET-28a（+）中构建重组原核表达质粒。诱导表达获得约45 ku的融合蛋白,并且主要以包涵体的形式存在。Western-blot分析表明,表达的目的蛋白能被TGEV阳性血清或ETEC阳性血清所识别,表达的蛋白为特异的蛋白。本试验为开发和生产同时抗TGEV与ETEC的基因工程亚单位疫苗提供了物质基础。

关键词： TGEV S1基因 ETEC ltb基因克隆原核表达

含ltb基因的狂犬病病毒口服疫苗株的构建与小鼠免疫研究

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含LTB基因的狂犬病病毒口服疫苗株的构建与小鼠免疫研究

作者：曾小玲华南农业大学

学位级别：硕士

狂犬病(rabies)是由狂犬病病毒(rabies virus,RABV)引起的具有高度神经嗜性的烈性人兽共患传染病,致死率达100%,已成为一个重大的公共卫生问题。该病目前无特效疗法,而通过暴露前预防(PrEP)或及时暴露后预防(PEP)可以完全预防感染。因此... 详细信息

狂犬病(rabies)是由狂犬病病毒(rabies virus,RABV)引起的具有高度神经嗜性的烈性人兽共患传染病,致死率达100%,已成为一个重大的公共卫生问题。该病目前无特效疗法,而通过暴露前预防(PrEP)或及时暴露后预防(PEP)可以完全预防感染。因此,探究狂犬病病毒的免疫防控机理,开发廉价高效的疫苗尤为重要。黏膜免疫是疫苗开发的一个重要方向,其中口服免疫可有效诱导机体产生免疫应答,操作简便快捷,是一种理想的免疫方式。单独口服抗原蛋白并不能产生良好的免疫反应,通常要与一定的佐剂或载体联合运用才能产生预期理想的免疫效果。大肠杆菌热敏肠毒素B亚基(heat-labile enterotoxin,ltb)已被证明是良好的黏膜免疫佐剂分子。本研究基于RABV弱毒株rHEP-Flury株的反向遗传操作平台上,成功构建了含狂犬病病毒糖蛋白胞外区(glycoprotein ectodomain,Get)和ltb基因的重组狂犬病病毒全长cDNA质粒pHEP-Get-ltb并成功拯救出重组病毒HEP-Get-ltb。对重组病毒HEP-Get-ltb的生物学特性进行研究,结果显示,重组病毒HEP-Get-ltb可以在NA细胞上稳定增殖,病毒滴度与亲本株rHEP-Flury无显著差异,均可达到较高水平。生长曲线表明,HEP-Get-ltb与rHEP-Flury有着相似的生长特性,当MOI=0.01和MOI=3时,两者均在72 h达到高峰。动物实验表明,重组病毒HEP-Get-ltb对乳鼠的LD较rHEP-Flury稍低,为10/0.03 mL,颅内接种5周龄成鼠,对其无致死性。通过口服或滴鼻方式接种小鼠,HEP-Get-ltb会造成成鼠体重在一定程度上降低,之后会回复正常。通过肌肉注射及颅内注射方式则无明显差异。在免疫效果评价上,口服或滴鼻免疫HEP-Get-ltb能够诱导小鼠产生中和抗体的水平显著高于rHEP-Flury,且其对小鼠免疫后的攻毒保护率更高;肌注免疫HEP-Get-ltb及rHEP-Flury均可诱导小鼠产生高于0.5 IU/mL的中和抗体,且免疫后对小鼠的保护率均达到80%以上。说明HEP-Get-ltb在注射免疫方式下与rHEP-Flury相似,均可诱导小鼠产生具有有效保护力水平的中和抗体,而在口服免疫方式下,其较亲本株rHEP-Flury株具有更好的免疫效力。在低剂量二次口服免疫小鼠后,HEP-Get-ltb比rHEP-Flury具有更好的免疫效果,但从产生的抗体水平和保护率上看免疫效果不如单次高剂量的免疫方式。因此可推测,口服免疫RABV活病毒要想获得较好的免疫效果对免疫的剂量有较大的依赖性。综上所述,本研究拯救得到的重组病毒HEP-Get-ltb复制能力良好,致病性弱,其口服免疫效果较rHEP-Flury有明显优势。下一步应在降低HEP-Get-ltb口服免疫对动物的影响以及优化其免疫剂量和免疫程序上进行研究。

关键词：狂犬病病毒口服免疫 ltb基因反向遗传生物学特性免疫原性

幽门螺杆菌HspA与大肠杆菌ltb基因融合及表达

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世界华人消化杂志 2003年第10期11卷 1475-1479页

作者：郭红邹全明赵哓晏吴超中国人民解放军第三军医大学附属新桥医院消化内科重庆市400037 中国人民解放军第三军医大学检验系临床微生物教研室重庆市400037

目的:构建和表达人幽门螺杆菌(Hpylori)热休克蛋白A亚单位(HspA)与E. coli不耐热肠毒素B亚单位(ltb)的重组融合蛋白,并对其基本的生物学及免疫学特性进行研究.方法:采用PCR技术从人H pylori染色体DNA中扩增出354 bp的HspA基因,并克隆至p... 详细信息

目的:构建和表达人幽门螺杆菌(Hpylori)热休克蛋白A亚单位(HspA)与E. coli不耐热肠毒素B亚单位(ltb)的重组融合蛋白,并对其基本的生物学及免疫学特性进行研究.方法:采用PCR技术从人H pylori染色体DNA中扩增出354 bp的HspA基因,并克隆至pPltb载体中与1tB基因融合,形成含有1tB-H spA融合基因的原核表达载体pPLH,并在工程菌*** JM109中诱导表达.结果:经序列分析,1tB-HspA融合基因由684个碱基组成,为编码228个氨基酸残基的多肽.SDS-PAGE和Westernblotting检测发现,融合蛋白的Mr 25×103,并与Hpylori感染的阳性血清发生抗原抗体反应,ELISA检测显示融合蛋白中存在ltb组分,并保持与LT受体-神经节苷脂GM1结合的活性.结论:ltb-HspA融合蛋白有可能用于Hpylori基因工程疫苗的研究.

关键词：幽门螺杆菌 HspA基因大肠杆菌 ltb基因重组融合蛋白免疫学特性 PCR技术基因融合基因表达

猪大肠杆菌不耐热肠毒素ltb基因的克隆及原核表达

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猪大肠杆菌不耐热肠毒素LTB基因的克隆及原核表达

ltb-ureB融合基因原核表达系统的构建及其产物免疫性和佐剂活性的鉴定

中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第四次猪病防控学术研讨会

作者：刘媛左玉柱范京惠河北农业大学动物科技学院

从河北省部分地区病猪中分离大肠杆菌,根据Genbank中登录的大肠杆菌不耐热肠毒素B亚基(ltb)基因序列,设计一对引物,采用PCR技术扩增ltb的编码基因,得到一条375bp的片段。将其连入Simple-T载体上,经酶切,PCR及序列测定法进行鉴定。测序... 详细信息

从河北省部分地区病猪中分离大肠杆菌,根据Genbank中登录的大肠杆菌不耐热肠毒素B亚基(ltb)基因序列,设计一对引物,采用PCR技术扩增ltb的编码基因,得到一条375bp的片段。将其连入Simple-T载体上,经酶切,PCR及序列测定法进行鉴定。测序正确后,将该基因插入到pET-28a(+)载体中构建原核表达载体,将此重组质粒转化***3感受态细胞,并用IPTG诱导,将诱导产物用SDS-PAGE和Western-blot检测。结果显示ltb基因可以在大肠杆菌中高效表达,表达产物分子量约为14ku,与预计的蛋白分子量一致。Western-blot试验证明,该蛋白可以与大肠杆菌免疫血清产生特异性结合反应,具有良好的抗原性,为大肠杆菌亚单位疫苗的研究奠定了基础。

关键词：不耐热肠毒素 ltb基因原核表达

来源： cnki会议评论

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浙江大学学报（理学版） 2005年第3期32卷 327-332页

作者：王媛严杰浙江省中医院浙江杭州310006 浙江大学医学院病原生物学教研室浙江杭州310031

构建lt B- ure B融合基因原核表达系统并对其表达产物的免疫性和佐剂活性进行鉴定.采用PCR和T- A克隆法从幽门螺杆菌(H elicobacter pylori,Hp)临床菌株Y0 6和大肠杆菌4 4 85 1株DNA中获得了ure B和lt B全长基因扩增片段及其克隆,并构建... 详细信息

构建lt B- ure B融合基因原核表达系统并对其表达产物的免疫性和佐剂活性进行鉴定.采用PCR和T- A克隆法从幽门螺杆菌(H elicobacter pylori,Hp)临床菌株Y0 6和大肠杆菌4 4 85 1株DNA中获得了ure B和lt B全长基因扩增片段及其克隆,并构建了lt B- ure B融合基因及其原核表达系统p ET32 a- lt B- ure B- *** BL2 1DE3.在*** BL2 1DE3宿主菌中用不同浓度的IPTG诱导表达,并用Hp全菌抗体的Western blot、EL ISA以及GM1 -EL ISA分别证实了目的重组蛋白(r L TB- Ure B)的免疫性和佐剂活性.与报道的相关序列比较,所克隆的ure B和lt B核苷酸序列同源性分别为96 .88%～97.82 %和99.12 %～99.71% ,氨基酸序列同源性为99.6 5 %～99.82 %和97.5 8%～99.19% . 0 .1～1.0 mm ol/ L 的IPTG均能有效地诱导目的重组蛋白r L TB- Ure B的表达,该蛋白主要以包涵体形式存在,其产量约为细菌总蛋白的35 % .Western blot结果证实r L TB- U re B不仅能与商品化的Hp全菌抗体结合,免疫家兔后也能产生特异性抗体,表明r L TB- U re B有良好的免疫反应性及抗原性.GM1 - EL ISA结果显示r L TB- Ure B能与牛GM1 结合,表明r L TB- Ure B有佐剂活性.以兔抗r L TB- U re B为一抗,发现所检测的10 9株Hp临床分离菌株均表达Ure B;以r L TB- U re B为包被抗原,发现所检测的12 5例Hp感染者血清中均存在U re B抗体;表明U re B广泛存在于不同的Hp菌株中,并有很强的抗原性,也提示r L TB- Ure B确有自然表达U re B的抗原特异性.本文成功地构建了L TB- Ure B融合基因原核高效表达系统,所表达的L TB- U re B融合蛋白有良好的免疫性和佐剂活性,为Hp基因工程疫苗的产业化奠定了坚实的基础.

关键词：幽门螺杆菌大肠杆菌 ureB基因 ltb基因融合基因克隆/表达免疫性/佐剂活性

含有MAR序列的STI-STII-ltb融合基因在苜蓿中的表达

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扬州大学学报（农业与生命科学版） 2007年第2期28卷 83-87页

作者：武冬梅陈创夫祝建波李冀新新疆农垦科学院新疆石河子832000 石河子大学动物科技学院新疆石河子832003 新疆兵团绿洲生态农业重点实验室新疆石河子832003

产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)LT和ST是导致人和动物腹泻的主要病原菌。利用三引物PCR法和酶切实现了STI、STII、ltb基因的融合,ltb基因的5′位于STII基因的3′端,三者在同一阅读框。将融合基因STI-STII-ltb构建到带有核基质结合区序列(MARs... 详细信息

产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)LT和ST是导致人和动物腹泻的主要病原菌。利用三引物PCR法和酶切实现了STI、STII、ltb基因的融合,ltb基因的5′位于STII基因的3′端,三者在同一阅读框。将融合基因STI-STII-ltb构建到带有核基质结合区序列(MARs)的植物表达载体pBI121-MARs中GUS基因的位置。同时构建不含MARs序列的重组质粒。重组质粒pBI121-MARs-STI-STII-ltb、pBI121-STI-STII-ltb通过冻融法转化根癌农杆菌,并通过农杆菌介导法转化杂花苜蓿。转基因苜蓿植株经PCR检测、Southern-blotting分析表明,转基因苜蓿植株基因组中可检测到STI-STII-ltb融合基因;提取转基因苜蓿植株总蛋白质,SDS-PAGE结果显示,转基因植株表达了重组抗原蛋白,且含MAR序列的蛋白表达量要高于不含MAR序列的表达量;Western-dotting免疫检测证实转基因植株表达的重组抗原具有免疫原性。

关键词：苜蓿 MAR序列 STI基因 STII基因 ltb基因

大肠杆菌ltb与霍乱弧菌CTB基因的克隆和表达及鉴定

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浙江大学学报（医学版） 2003年第1期32卷 17-20页

作者：夏肖萍严杰钊守凤毛亚飞李淑萍浙江大学医学院病原生物学教研室浙江杭州310031

目的 :克隆大肠杆菌不耐热肠毒素 B亚单位 (L TB)及霍乱弧菌肠毒素 B亚单位 (CTB)基因 ,构建其表达载体。方法 :采用高保真 PCR分别从 ***4 4 815株与 ***东 74株基因组 DNA中扩增 L TB与 CTB基因 ,T- A克隆后测定核苷酸序列。分别构建 ... 详细信息

目的 :克隆大肠杆菌不耐热肠毒素 B亚单位 (L TB)及霍乱弧菌肠毒素 B亚单位 (CTB)基因 ,构建其表达载体。方法 :采用高保真 PCR分别从 ***4 4 815株与 ***东 74株基因组 DNA中扩增 L TB与 CTB基因 ,T- A克隆后测定核苷酸序列。分别构建 p ET32 a的 ltb及 CTB表达载体 ,在 *** BL2 1DE3宿主菌中用不同浓度的 IPTG诱导表达。采用 SDS- PAGE及 GM1- EL ISA鉴定表达产物。结果 :所克隆的 ltb和 CTB基因与报道的相应核苷酸序列同源性分别为 99.12 %～ 99.71%和 98.5 4 %～ 99.4 2 % ,氨基酸序列同源性分别高达 97.5 8%～99.19%和 96.77%～ 99.19%。p ET32 a- L TB- BL2 1DE3和 p ET32 a- CTB- BL2 1DE3系统表达的融合蛋白产量分别占细菌总蛋白的 30 %和 10 %左右。GM1- EL ISA结果证实 ltb及 CTB融合蛋白均能与牛 GM1结合。结论 :本研究成功地构建了 ltb与 CTB表达系统 ,所表达的 L TB与 CTB融合蛋白具有粘膜免疫佐剂活性。

关键词：大肠杆菌 ltb基因霍乱弧菌 CTB基因分子克隆 ltb融合蛋白 CTB融合蛋白免疫学