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猪囊尾蚴排泄分泌抗原lrrc15蛋白对仔猪树突状细胞活化的影响

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中国人兽共患病学报 2023年第7期39卷 675-681页

作者：王怡李丽竹肖世玉周必英遵义医科大学第一临床学院遵义563000 遵义医科大学寄生虫学教研室遵义563000

目的探讨猪囊尾蚴排泄分泌抗原(Excretory secretory antigen, ESA)富含亮氨酸重复序列结构域(Leucine-rich repeat containing 15, lrrc15)蛋白对仔猪树突状细胞(Dendritic cell, DC)成熟活化的影响。方法收集正常仔猪DC体外诱导、培... 详细信息

目的探讨猪囊尾蚴排泄分泌抗原(Excretory secretory antigen, ESA)富含亮氨酸重复序列结构域(Leucine-rich repeat containing 15, lrrc15)蛋白对仔猪树突状细胞(Dendritic cell, DC)成熟活化的影响。方法收集正常仔猪DC体外诱导、培养,获得成熟与未成熟DC(immature DC, imDC)。在正常仔猪未成熟DC中,分别加入lrrc15蛋白、ESA刺激,将lrrc15组作为实验组;同时建立ESA对照组、LPS阳性对照组、lrrc15+LPS阳性对照组、LPS+ESA阳性对照组和培养基阴性对照组。流式细胞术检测DC表面标志物MHC-Ⅱ、CD80、CD86的表达量;ELISA检测DC细胞培养上清TNF-α、IL-6、IL-10、IL-12的分泌水平。结果与未刺激DC组相比,lrrc15蛋白组诱导DC表面标志物CD80、CD86、MHC-Ⅱ表达均增加。在LPS存在情况下,lrrc15蛋白也能诱导CD80、CD86、MHC-Ⅱ分子上调;ELISA检测结果显示,与1640培养基组、LPS组和ESA组相比,lrrc15蛋白组均诱导IL-6、IL-10、IL-12、TNF-α分泌降低,lrrc15蛋白组与1640培养基组相比IL-6(t=7.529,Plrrc15蛋白组与LPS组相比IL-6(t=26.663,Plrrc15蛋白组与ESA组相比IL-6(t=6.343,P0.05)。结论 lrrc15蛋白能诱导DC成熟活化,并抑制DC相关细胞因子的分泌,但能否通过其他途径诱导Th细胞分化还需进一步分析。

关键词：猪囊尾蚴排泄分泌抗原 lrrc15 树突状细胞

lrrc15通过透明质酸通路促进特发性肺纤维化的作用研究

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LRRC15通过透明质酸通路促进特发性肺纤维化的作用研究

作者：韩棕远河南师范大学

学位级别：硕士

研究背景:特发性肺纤维化（Idiopathic Pulmonary Fibrosis,IPF）是一种病因不明,发病机制不明确的纤维化疾病,中位生存期在3-5年。lrrc15是一种跨膜蛋白,属于lrrc超家族的成员,其结构具有特殊的15段富含亮氨酸重复序列,与其同家族的成... 详细信息

研究背景:特发性肺纤维化（Idiopathic Pulmonary Fibrosis,IPF）是一种病因不明,发病机制不明确的纤维化疾病,中位生存期在3-5年。lrrc15是一种跨膜蛋白,属于lrrc超家族的成员,其结构具有特殊的15段富含亮氨酸重复序列,与其同家族的成员通过其胞外富含亮氨酸重复序列与纤连蛋白、层粘连蛋白和胶原在内的一系列细胞外基质（Extracellular matrix,ECM）蛋白相互作用,在细胞-细胞、细胞-基质之间起连接作用,以及在炎症,细胞粘附,信号转导,DNA损伤修复中发挥重要作用,但是目前关于lrrc15在肺纤维化中的作用机制仍不明确。研究目的:前期研究发现,lrrc15在纤维化的肺组织中高表达,本研究以博来霉素（Bleomycin,BLM）诱导的小鼠肺纤维化模型,上皮细胞（A549）和成纤维细胞（MRC-5）损伤模型,从体内和体外水平探讨了lrrc15在肺纤维化中的作用及其具体的调节机制,研究结果将为后续的临床研究提供技术支持和实验材料,同时也可为IPF靶向药物的研发提供重要的理论基础。研究方法和结果:首先,从GEO数据集中我们发现lrrc15在肺纤维化患者肺组织中高表达。免疫荧光染色结果证实,BLM处理的小鼠肺组织中,lrrc15的表达量显著增加,并且与成纤维细胞标志蛋白α-平滑肌肌动蛋白（alpha smooth muscle actin,α-SMA）以及上皮细胞标志蛋白SPC均有共定位现象。同时,在HO诱导的肺泡上皮细胞（A549）以及TGF-β诱导的成纤维细胞（MRC-5）损伤中,lrrc15的表达量均明显增加。在此基础上,构建了lrrc15过表达质粒,结果显示,lrrc15在上述两种细胞中表达量均极显著上调（plrrc15在肺纤维化中的作用,我们首先基因富集分析,发现lrrc15与上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）呈显著正相关。进一步在A549细胞中通过q RT-PCR和Western blot实验验证了过表达lrrc15在转录和翻译水平上能明显抑制E-cadherin表达,促进Vimentin的表达。Transwell实验证明,过表达lrrc15能够促进细胞迁移（plrrc15能够显著促进细胞增殖（plrrc15后,细胞凋亡比例明显增加（plrrc15能够通过促进Fibronectin以及CollagenⅠ的表达造成细胞外基质沉积,胶收缩实验证明lrrc15能够明显促进成纤维细胞激活。为了进一步探究lrrc15在肺纤维化中的作用机制,首先通过q RT-PCR和Western blot实验检测了透明质酸结合蛋白2（Hyaluronan binding protein 2,HABP2）、透明质酸合成酶2（Hyaluron synthase 2,HAS2）、CD44以及CD168等与透明质酸合成和转运相关分子的表达变化。结果表明,过表达lrrc15能够促进上述分子在m RNA以及蛋白水平的表达水平增加。而联合使用透明质酸合成抑制剂4-甲基伞形酮（4-Methylumbelliferone,4-MU）在转录和翻译水平均能够显著抑制lrrc15引起的HABP2、HAS2、CD44、CD168以及细胞外基质成分Fibronectin、CollagenⅠ的表达水平升高。上述结果进一步证实,lrrc15通过促进透明质酸合成及转运,进而诱导成纤维细胞的活化以及细胞外基质的沉积。研究结论:在肺纤维化过程中,lrrc15能够促进在上皮细胞的迁移、增殖、凋亡以及上皮-间质转化,能够诱导成纤维细胞中透明质酸的胞内合成和胞外转运及降解,导致成纤维细胞活化和ECM的沉积,最终促进肺纤维化的进程。

关键词： lrrc15 特发性肺纤维化 C57BL/6小鼠博来霉素 A549细胞 MRC-5细胞透明质酸

lrrc15在上皮性卵巢癌微环境中的表达及意义

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LRRC15在上皮性卵巢癌微环境中的表达及意义

作者：朱晓瑛青岛大学

学位级别：硕士

目的:探讨富含亮氨酸重复序列(leucine rich repeat containing,lrrc)蛋白质超家族成员在上皮性卵巢癌(epithelial ovarian carcinoma,EOC)肿瘤微环境中的表达情况与预后意义。探讨lrrc15作为肿瘤诊断和治疗的新靶点,其表达水平与EOC免... 详细信息

目的:探讨富含亮氨酸重复序列(leucine rich repeat containing,lrrc)蛋白质超家族成员在上皮性卵巢癌(epithelial ovarian carcinoma,EOC)肿瘤微环境中的表达情况与预后意义。探讨lrrc15作为肿瘤诊断和治疗的新靶点,其表达水平与EOC免疫浸润的关系。在此基础上进一步分析其对卵巢癌(ovarian cancer,OC)原发性铂耐药的影响。方法:1、应用R软件分析公共数据库TCGA(n=427)、GTEx(n=88)和GEO数据集(GSE40266和GSE40595)中OC患者的临床资料和转录谱,获得lrrc超家族在高级别浆液性卵巢癌(high-grade serous ovarian cancer,HGSC)组织中具有高表达特征的差异基因(differentially expressed gene,DEG)。使用GEPIA2、Kaplan-Meier Plotter、Gene MANIA、Linked Omics、TIMER2.0、UCSC Xena等公共在线数据库进一步分析差异基因与临床预后、免疫浸润的关系,构建蛋白互作(protein-protein interaction,PPI)网络。2、构建Nomogram预后模型。通过单变量、多变量Cox回归分析分析,将年龄、分期和lrrc15表达水平等临床病理因素纳入预后列线图。3、通过实时荧光定量逆转录聚合酶链锁反应(real time quantitative reverse transcription polymerase chain reactions,q RT-PCR)检测由TGF-β1诱导48h前后的MRC-5细胞系中lrrc15的m RNA表达水平。4、收集2014年1月至2021年12月就诊于青岛大学附属医院进行手术治疗的EOC患者的肿瘤组织,对他们进行随访。已确定20例原发性铂耐药病例,并从患者库中随机匹配30例铂敏感病例,共50例肿瘤组织样本。所有患者均获得知情同意。通过免疫组化(immunohistochemistry,IHC)技术检测上述样本中lrrc15、PDPN、CD8的表达水平并分析其与原发性铂耐药的关系。通过绘制受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC),评价lrrc15在EOC中的诊断价值。结果:1、公共数据库综合分析发现lrrc15和lrrc32在HGSC间质和CAF中差异表达并显著富集于TGF-β蛋白家族相关通路,提示lrrc超家族可能参与TGF-β在HGSC进展中的促肿瘤作用。只有lrrc15在完整肿瘤组织(包括间质和实质)中仍高表达,lrrc32在OC肿瘤组织中总体表达呈下降趋势。lrrc15高表达与更差的临床预后相关。在免疫浸润方面,lrrc15高表达与肿瘤相关成纤维细胞浸润呈正相关,与CD8T细胞、B细胞浸润负相关(P均lrrc15、PDPN的m RNA表达水平,发现lrrc15与PDPN(podoplanin)一致,均在TGF-β1诱导48h后的MRC-5细胞系中显示出更高的表达(Plrrc15总是在与PDPN相同的位置表达,lrrc15在基质组分中具有更广泛的阳性表达。CD8T细胞浸润随着晚期OC患者组织中lrrc15表达的增加而减少。Spearman相关分析表明,lrrc15与PDPN表达呈正相关,与CD8表达呈负相关(Plrrc15的表达有助于PDPNCAF的增殖,抑制了CD8+T细胞的浸润,促进了免疫抑制微环境的形成。5、进一步的统计分析表明铂耐药组lrrc15和PDPN的表达显著高于铂敏感组,而CD8的表达则相反(Plrrc15的预测能力在预测耐药性和敏感性结果方面相对准确(AUC=0.818,CI=0.699-0.938)。结论:1、lrrc超家族中lrrc15、lrrc32可能参与TGF-β通路在HGSC进展中的促肿瘤作用。2、lrrc15作为一种间质高表达生物标志物,与EOC临床预后不良相关,可促进免疫抑制微环境的形成。3、lrrc15可能是逆转OC原发性铂耐药的潜在治疗靶点。

关键词： lrrc15 卵巢癌肿瘤微环境免疫浸润铂耐药

miRNA-146a-5p通过降低lrrc15的表达抑制骨肉瘤细胞增殖、侵袭及转移

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miRNA-146a-5p通过降低LRRC15的表达抑制骨肉瘤细胞增殖、侵袭及...

作者：李金鑫南华大学

学位级别：硕士

目的:探索miRNA-146a-5p通过调控lrrc15的表达对骨肉瘤细胞增殖、侵袭和转移的影响。方法:(1)通过miRNA公共数据库,预测可能作用于lrrc15的上游miRNA,通过生物信息学分析得出与lrrc15结合保守度最高的miRNA。(2)通过实时荧光定量PCR检... 详细信息

目的:探索miRNA-146a-5p通过调控lrrc15的表达对骨肉瘤细胞增殖、侵袭和转移的影响。方法:(1)通过miRNA公共数据库,预测可能作用于lrrc15的上游miRNA,通过生物信息学分析得出与lrrc15结合保守度最高的miRNA。(2)通过实时荧光定量PCR检测预测得到的miRNA-146a-5p在骨肉瘤细胞株Saos-2、MG-63及人成骨细胞h FOB1.19中的表达水平,明确其与骨肉瘤的相关性。(3)将miRNA-146a-5p模拟物及抑制物分别转染至骨肉瘤细胞株Saos-2当中,通过实时荧光定量PCR检测其转染效率。待完成转染后,利用Western-blot技术检测lrrc15蛋白的表达变化情况。细胞划痕实验检测miRNA-146a-5p的表达改变对于骨肉瘤细胞株迁移能力的影响,CCK-8法研究miRNA-146a-5p的表达改变对于骨肉瘤细胞株增殖能力的影响,Transwell实验研究miRNA-146a-5p的表达改变对于骨肉瘤细胞株侵袭能力的影响。结果:(1)利用Targetscan、miRDB、miRcode三个公共数据库检索与lrrc15相关的miRNA,并通过venn在线网站分析三个数据库的共同靶基因,发现包括miRNA-146a-5p在内,共有三个miRNA被预测为lrrc15的上游靶向miRNA。生物信息学的结果显示,miRNA-146a-5p与lrrc15的结合位点具有最高保守度。这表明,miRNA-146a-5p与lrrc15之间存在靶向关系,miRNA-146a-5p可能是lrrc15的上游miRNA。(2)实时荧光定量PCR(RT-q PCR)发现,与人成骨细胞(OB)h FOB1.19相比,miRNA-146a-5p在骨肉瘤细胞株Saos-2、MG-63中呈低表达(Plrrc15蛋白的表达量明显下降(Plrrc15蛋白的表达水平明显上调(Plrrc15的表达抑制骨肉瘤细胞增殖、侵袭及转移。

关键词：骨肉瘤 miRNA-146a-5p lrrc15 增殖侵袭转移

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lrrc15在斑马鱼胚胎血管发育中的作用

交通医学 2022年第5期36卷 441-445页

作者：刘伟葛晓娟刘东陈昌盛南通大学生命科学学院江苏226019

目的:探究lrrc15基因在斑马鱼胚胎发育中的表达及其在血管发育中的作用。方法:采用全胚胎原位杂交技术检测lrrc15基因在斑马鱼胚胎发育过程中的时空表达谱,显微注射吗啉修饰的反义寡核苷酸(morpholino oligos,MO)至内皮细胞被特异标记... 详细信息

目的:探究lrrc15基因在斑马鱼胚胎发育中的表达及其在血管发育中的作用。方法:采用全胚胎原位杂交技术检测lrrc15基因在斑马鱼胚胎发育过程中的时空表达谱,显微注射吗啉修饰的反义寡核苷酸(morpholino oligos,MO)至内皮细胞被特异标记的转基因斑马鱼中下调lrrc15的表达,利用共聚焦显微成像技术观察和分析胚胎血管发育的变化。结果:在受精后19、24、36和48 h均检测到lrrc15基因在斑马鱼尾静脉丛的表达,受精后24 h表达最高。下调lrrc15的表达导致斑马鱼尾静脉丛发育缺陷。结论:lrrc15基因在斑马鱼胚胎发育中主要参与调控尾静脉丛形成,该基因的缺陷可导致尾静脉丛发育异常,提示lrrc15基因在血管发育尤其是血管新生中的重要性,可为今后肿瘤治疗提供潜在的靶点。

关键词： lrrc15 血管发育原位杂交斑马鱼

lrrc15对卵巢癌细胞和卵巢癌PARP抑制剂耐药细胞生物学行为影响的研究

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LRRC15对卵巢癌细胞和卵巢癌PARP抑制剂耐药细胞生物学行为影响的...

作者：苏悦华中科技大学

学位级别：硕士

【目的】上皮性卵巢癌有发病率高、早期不易就诊诊断、复发及耐药发生率高等特点,现已成为女性肿瘤的第五大杀手。卵巢癌的一线治疗是初次减瘤术与铂类为基础的化疗结合。而目前批准用于卵巢癌的PARP抑制剂已有三种。他们可用作BRCA突... 详细信息

【目的】上皮性卵巢癌有发病率高、早期不易就诊诊断、复发及耐药发生率高等特点,现已成为女性肿瘤的第五大杀手。卵巢癌的一线治疗是初次减瘤术与铂类为基础的化疗结合。而目前批准用于卵巢癌的PARP抑制剂已有三种。他们可用作BRCA突变的复发性卵巢癌患者的后线治疗以及卵巢癌的维持治疗,其中尼拉帕利的维持治疗既可用于BRCA突变人群,又可应用于没有BRCA突变的患者。然而对于靶向药的耐药性和机制研究,目前讨论的较少。lrrc15是LRR超家族的成员,它是由15个富含亮氨酸的重复序列组成的一种Ⅰ型跨膜蛋白。以往研究表明lrrc15在多种肿瘤组织中高表达,而在相应正常组织中低表达。这种差异表达可能参与促进乳腺癌、骨肉瘤等的进展和转移,目前lrrc15在卵巢癌中的影响尚不明确。本研究将探讨lrrc15在卵巢癌中的表达以及lrrc15对卵巢癌细胞及卵巢癌PARP抑制剂耐药细胞的影响。【方法】通过挖掘TCGA数据库以及GTEx数据库中关于卵巢浆液性囊腺癌的数据,得到lrrc15在不同组织中的表达,进而对结果富集分析,同时通过KMplot及TCGA数据库分析得到lrrc15与卵巢癌患者预后的关系。用Western blot和RT-q PCR验证上述数据。用慢病毒转染细胞使得细胞敲减或过表达lrrc15。建立卵巢癌细胞奥拉帕利耐药株来模拟卵巢癌病人对PARP抑制剂的耐药。用划痕实验、克隆形成实验以及transwell侵袭实验验证lrrc15对卵巢癌细胞的影响。根据数据库筛选出与lrrc15相关的miRNA并验证。最后在裸鼠卵巢原位成瘤来观察敲减lrrc15对卵巢癌和卵巢癌奥拉帕利耐药细胞的作用。【结果】(1)lrrc15存在差异表达,其在卵巢癌中高表达,并且lrrc15的表达与预后相关;(2)lrrc15可能在高级别浆液性卵巢癌中高表达,在透明细胞癌中则低表达;(3)lrrc15高表达促进卵巢癌细胞的侵袭和转移;(4)建立了CAOV3-OR和OVCAR8-OR这两株卵巢癌奥拉帕利耐药细胞;(5)降低lrrc15表达可使卵巢癌细胞对奥拉帕利的敏感性增高;(6)lrrc15可能通过调节miR-146a-5p从而参与卵巢癌细胞PARP抑制剂耐药的过程。

关键词：卵巢癌 PARP抑制剂耐药 lrrc15

lrrc15通过自噬调节特发性肺纤维化的作用研究

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LRRC15通过自噬调节特发性肺纤维化的作用研究

作者：李盼河南师范大学

学位级别：硕士

特发性肺纤维化(Idiopathic Pulmonary Fibrosis,IPF)是一种致病原因不明、进行性、慢性不可逆的间质性肺疾病。以肺泡上皮细胞损伤、成纤维细胞积聚、细胞外基质异常沉积和蜂窝状肺为主要特征。患者多预后不良,中位生存期3-5年。lrrc15... 详细信息

特发性肺纤维化(Idiopathic Pulmonary Fibrosis,IPF)是一种致病原因不明、进行性、慢性不可逆的间质性肺疾病。以肺泡上皮细胞损伤、成纤维细胞积聚、细胞外基质异常沉积和蜂窝状肺为主要特征。患者多预后不良,中位生存期3-5年。lrrc15是lrrc超家族的成员,其成员是蛋白-蛋白和蛋白-基质相互作用的纽带,与炎性反应相关,在细胞粘附、信号转导、DNA修复等过程中有重要作用。但是目前关于lrrc15在IPF的作用及调节机制未见有相关文献报道。本研究以博来霉素诱导C57BL/6小鼠肺纤维化和A549细胞损伤为研究模型,从体内和体外2个方面探讨了lrrc15在IPF中的作用和调节机制。为了研究lrrc15在IPF中的调控作用。我们构建了C57BL/6小鼠和A549细胞博来霉素损伤模型。在此基础上首先检测了临床IPF患者和小鼠肺组织的形态学变化,结果表明,两种组织呈现间质性肺炎的特点:成纤维细胞增多,炎性细胞浸润,细胞外基质沉积。免疫组化检测了lrrc15在上述两种组织中的表达,结果表明,lrrc15主要在细支气管和终末细支气管上皮细胞表达,并且在IPF肺组织中表达量增多。Western Blot和q RT-PCR检测了小鼠和A549细胞BLM损伤模型中lrrc15的表达,结果同样表明,与各自的对照组相比,BLM处理后,lrrc15的表达量明显增加,差异性显著或极显著(Plrrc15可能与IPF相关。然后我们设计合成lrrc15干涉片段瞬转入A549细胞中,Western Blot和q RT-PCR检测lrrc15的表达,结果指出,lrrc15的表达显著降低,差异性极显著(Plrrc15的表达可以部分恢复BLM引起的细胞活性降低。以上结果说明,lrrc15在IPF中表达量增多,干扰lrrc15的表达可以抑制BLM造成的肺泡上皮细胞损伤。为进一步探究lrrc15调控IPF的机制,我们首先检测了BLM处理A549细胞后自噬的变化情况。Western Blot结果表明,BLM处理A549细胞24h和48h后,LC3-II呈现先上升,后下降的趋势,p62呈现一直上升的趋势。GFP-RFP-LC3双荧光标记检测发现,BLM处理后LC3自噬小体的数量增多。进一步用si RNA lrrc15处理A549细胞,Western Blot结果发现,LC3-Ⅱ、ATG5、ATG7自噬关键蛋白的表达增加,P62蛋白表达下调;转染GFP-RFP-LC3双荧光质粒,激光共聚焦显微镜检测发现自噬流增强。以上结果说明在IPF中,抑制lrrc15可以增强自噬。综上所述,lrrc15在IPF中表达量增加;lrrc15可以促进IPF的进程;lrrc15通过抑制自噬来调节IPF。本研究为进一步阐明IPF的机制提供必要的理论依据。

关键词： lrrc15 特发性肺纤维化(IPF) 博来霉素小鼠 A549细胞自噬