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INHIBITION OF PROLIFERATION OF HUMAN BREAST CANCER MCF-7 CELLS BY SMALL INTERFERENCE RNA AGAINST lrp16 GENE

Chinese Journal of Cancer Research 2004年第4期16卷 239-245页

作者：韩为东赵亚力李琦母义明李雪宋海静陆祖谦 Department of Molecular Biology Institute of Basic Medicine Department of Endocrinology PLA General Hospital Beijing 100853

Objective: Our previous studies have firstly demonstrated that 17β -E2 up-regulates lrp16 gene expression in human breast cancer MCF-7 cells, and ectopic expression of the lrp16 gene promotes MCF-7 cells proliferation. Here, the effects of the lrp16 gene expression on growth of MCF-7 human breast cancer cells and the mechanism were further studied by establishing two stably lrp16-inhibitory MCR-7 cell lines. Methods: Hairpin small interference RNA (siRNA) strategy, by which hairpin siRNA was released by U6 promoter and was mediated by pLPC-based retroviral vector, was adopted to knockdown endogenous lrp16 level in MCF-7 cells. And the hairpin siRNA against green fluorescence protein (GFP) was used as the negative control. The suppressant efficiency of the lrp16 gene expression was confirmed by Nothern blot. Cell proliferation assay and soft agar colony formation assay were used to determine the status of the cells proliferation. Cell cycle checkpoints including cyclin E and cyclin D1 were examined by Western blot. Results: The results from cell proliferation assays suggested that down-regulation of lrp16 gene expression is capable of inhibiting MCF-7 breast cancer cell growth and down-regulation of the lrp16 gene expression is able to inhibit anchorage-independent growth of breast cancer cells in soft agar. We also demonstrated that cyclin E and cyclin D1 proteins were much lower in the lrp16-inhibitory cells than in the control cells. Conclusion: These data suggest that lrp16 gene play an important role in MCF-7 cells proliferation by regulating the pathway of the G1/S transition and may function as an important modulator in regulating the process of tumorigenesis in human breast.

关键词： Estradiol lrp16 Small interference RNA MCF-7 Proliferation Soft agar assay G1/S control

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Estrogen Receptor α(ERα) Target Gene lrp16 Interacts with ERα and Enhances Receptor's Transcriptional Activity

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Chinese Journal of Cancer Research 2007年第4期19卷 233-237页

作者：韩为东赵亚力吴志强孟元光臧丽母义明 Department of Molecular Biology Institute of Basic Medicine Department of Obstetrics and Gynecology Department of Endocrinology PLA General Hospital

Objective：It has been shown that lrp16 is an estrogen-induced gene through its receptor α（ERα）. Although there is evidence demonstrating that inhibition of lrp16 gene expression in MCF-7 human breast cancer cells partially attenuates its estrogen-responsiveness, the underlying molecular mechanism is still unclear. Here, the effect of lrp16 expression on the ERα signaling transduction was investigated. Methods： Cotransfection assays were used to measure the effect of lrp16 on ERα-mediated transcriptional activity. GST-pulldown and immunoprecipitation （ColP） assays were employed to investigate the physical interaction of lrp16 and ERα. The mammalian two-hybrid method was used to map the functional interaction region. Results： the results of cotransfection assays demonstrated that the transcriptional activities of ERα were enhanced in α lrp16 dose-dependent manner in MCF-7 in the presence of estrogen, however, it was abolished in the absence of E2 in MCF-7 cells. The physical interaction of lrp16 and ERα proteins was confirmed by GST-pulldown in vitro and ColP in vivo assays, which was enhanced by E2 but not dependent on its presence. Furthermore, the results of the mammalian two-hybrid assays indicated that the binding region of ERα to lrp16 located at the A/B AF-1 functional domain and E2 stimulated the binding of lrp16 to the full-length ERα molecule but not to the A/B region alone. Conclusion： These results support a role for estrogenically regulated lrp16 as an ERα coactivator, providing a positive feedback regulatory loop for ERα signal transduction. Based on this function of lrp16, we propose that ERα-positive breast cancer patients with high expression of lrp16 might benefit from targeting lrp16 therapy.

关键词： Estrogen receptorα lrp16 Interaction Coactivator

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lrp16基因在乳腺癌组织中的表达及其临床意义

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癌症 2006年第7期25卷 866-870页

作者：廖代祥韩为东赵亚力蒲永东母义明罗成华李向红中国人民解放军总医院分子生物室北京1008532 中国人民解放军总医院三零九临床部北京100853 中国人民解放军总医院内分泌科北京100853 中国人民解放军总医院普外科北京100853 中国人民解放军总医院病理科北京100853

背景与目的:既往研究表明雌激素通过其受体!直接上调lrp16的表达,lrp16基因的高表达促进乳腺癌细胞的增殖。本研究旨在探讨lrp16基因在乳腺癌组织中的表达状况及其与临床病理特征的关系。方法:收集52例乳腺癌组织及其配对癌旁组织,North... 详细信息

背景与目的:既往研究表明雌激素通过其受体!直接上调lrp16的表达,lrp16基因的高表达促进乳腺癌细胞的增殖。本研究旨在探讨lrp16基因在乳腺癌组织中的表达状况及其与临床病理特征的关系。方法:收集52例乳腺癌组织及其配对癌旁组织,Northernblot与半定量RT-PCR法分别检测22例和30例标本中lrp16mRNA水平。免疫组化法检测肿瘤组织中雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)及Ki-67的表达情况。结果:Northernblot检测结果表明,22例癌组织lrp16mRNA的表达较癌旁组织高2倍的有9例,高表达率为40.9%(9/22)。高表达lrp16的9例中有7例ER阳性,8例PR阳性;而非高表达13例中ER阳性6例,PR阳性5例,两组ER与PR阳性率均有显著性差异(Plrp16高表达的9例中只有1例PR和ER同时阴性,而非高表达的13例中有7例。22例患者中,13例肿瘤直径3.0～4.5cm,其中lrp16基因高表达组占8例;有腋窝淋巴结转移的12例中8例lrp16高表达。8例高表达Ki-67患者中6例lrp16高表达。半定量RT-PCR检测结果表明,30例肿瘤标本中9例(30.0%)lrp16mRNA的表达水平明显高于癌旁组织,9例lrp16高表达者ER、PR均阳性,Ki-67高表达,且瘤体直径均大于3.5cm,均有腋窝淋巴结转移,与非高表达组比较差异有显著性(Plrp16基因表达水平与ER/PR阳性率、细胞增殖活性、肿瘤直径、远处淋巴结转移密切相关,提示lrp16基因可能参与促进乳腺癌的增殖与转移。

关键词：乳腺肿瘤 lrp16 肿瘤转移 RT-PCR Norther blot

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HeLa细胞中lrp16影响电离辐射诱导的NF-κB核转位

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中国生物化学与分子生物学报 2011年第7期27卷 638-643页

作者：马晓星伍志强段玉坤赵亚力李小雷韩为东孟元光解放军总医院妇产科北京100853 解放军总医院基础医学所分子生物室北京100853

前期研究显示抑制lrp16的表达可以明显增加肿瘤细胞对辐射诱导凋亡的敏感性,但具体机制尚不清楚.大量研究表明,NF-κB信号通路在肿瘤产生辐射抵抗中起着重要的作用.为研究lrp16影响肿瘤细胞对辐射敏感性的可能机制,首先通过免疫荧光技... 详细信息

前期研究显示抑制lrp16的表达可以明显增加肿瘤细胞对辐射诱导凋亡的敏感性,但具体机制尚不清楚.大量研究表明,NF-κB信号通路在肿瘤产生辐射抵抗中起着重要的作用.为研究lrp16影响肿瘤细胞对辐射敏感性的可能机制,首先通过免疫荧光技术检测电离辐射刺激后不同时间点NF-κB的核转位情况;然后分别过表达和抑制lrp16的表达,采用Western印迹方法检测NF-κB在核蛋白与浆蛋白中的表达情况、IκB-α总体蛋白水平及磷酸化水平.结果发现,电离辐射后1 h,可见NF-κB明显入核;过表达lrp16可以促进NF-κB入核、提高IκB-α的磷酸化水平、促进IκB-α的降解;反之,抑制lrp16的表达可以抑制NF-κB入核、降低IκB-α的磷酸化水平、阻碍IκB-α的降解.上述研究结果表明,在HeLa细胞中lrp16可以影响电离辐射诱导的NF-κB核转位,该研究为lrp16参与肿瘤细胞产生辐射抵抗现象提供一种可能的机制.

关键词： lrp16 NF-κB 电离辐射核转位

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lrp16通过调控E-钙黏着蛋白的表达促进MCF-7细胞的侵袭生长

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中国生物化学与分子生物学报 2006年第9期22卷 724-732页

作者：韩为东孟元光廖代祥李琦伍志强司艺玲郝好杰母义明赵亚力解放军总医院基础医学所分子生物室北京100853 解放军总医院妇产科北京100853 解放军总医院内分泌科北京100853

lrp16在原代乳腺癌组织中表达水平与雌激素受体α(ERα)表达状态以及腋窝淋巴结侵袭数目密切相关.为研究lrp16基因对乳腺癌MCF7细胞侵袭生长的影响,并探讨涉及的分子机制,采用基质胶黏附实验与Transwell方法,检测内源性lrp16表达抑制MCF... 详细信息

lrp16在原代乳腺癌组织中表达水平与雌激素受体α(ERα)表达状态以及腋窝淋巴结侵袭数目密切相关.为研究lrp16基因对乳腺癌MCF7细胞侵袭生长的影响,并探讨涉及的分子机制,采用基质胶黏附实验与Transwell方法,检测内源性lrp16表达抑制MCF7细胞的体外黏附、侵袭生长与迁移特征.结果表明,抑制lrp16在MCF7细胞中的表达,降低了细胞的体外黏附、侵袭与迁移能力;采用FVB小鼠进行的实验性转移试验结果显示,抑制lrp16显著降低了MCF7细胞的肺转移结节数目;为探索可能的分子机制,采用Western印迹方法,检测了lrp16对乳腺癌转移相关分子MMP2,MMP9,CD44和E钙黏着蛋白表达的影响,结果在lrp16抑制的MCF7细胞中只有E钙黏着蛋白蛋白表达上调.进一步的Northern印迹与免疫组化实验结果表明,抑制lrp16可上调MCF7细胞中E钙黏着蛋白基因的mRNA与蛋白表达水平;共转染与双荧光素酶方法检测lrp16对E钙黏着蛋白基因启动子的表达调控效应,结果显示,lrp16抑制E钙黏着蛋白基因基因5′近端启动子的转录激活,该抑制效应选择性存在于内源性ERα阳性细胞,并且依赖于雌激素的存在;染色质免疫共沉淀方法(ChIP)检测ERα与E钙黏着蛋白基因启动子的相互作用,结果显示,在lrp16基因表达缺陷的MCF7细胞中,ERα抗体沉淀到E钙黏着蛋白基因启动子的DNA序列;上述研究结果表明,抑制lrp16基因表达,削弱了激素依赖型乳腺癌细胞的侵袭生长能力,其分子机制涉及了lrp16通过ERα介导对E钙黏着蛋白基因基因转录激活的调控.

关键词： lrp16 E-钙黏着蛋白雌激素受体α MCF-7 侵袭生长

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Reduced Expression of the lrp16 Gene in Mouse Insulinoma (MIN6) Cells Exerts Multiple Effects on Insulin Content, Proliferation and Apoptosis

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Journal of Huazhong University of Science and Technology(Medical Sciences) 2012年第2期32卷 190-198页

作者：李晓瑾薛冰王煊孙连庆张婷婷曲玲邹效漫母义明 Department of Endocrinology Chinese PLA General Hospital

This study assessed the effects of leukemia-related protein 16 (lrp16) on the regulation of pancreatic functions in mouse insulinoma (MIN6) cells. Cells with down-regulated expression of lrp16 were obtained by a shRNA interference strategy. Insulin content and glucose-stimulated insulin secretion (GSIS) were examined by radioimmunoassay. Western blotting was applied to detect protein expression. Glucose-stimulated sub-cellular localization of PDX-1 was immunocytochemically determined. Cell proliferation and apoptosis were detected by flow cytometry. Our results showed that lrp16 regulated insulin content in MIN6 cells by controlling expression of insulin and insulin transcription factors. lrp16 gene silence in MIN6 cells led to reduced cell proliferation and increased apoptosis. The observation of phosphorylation of serine-473 Akt and the localization of PDX-1 to the nucleus under glucose-stimulation exhibited that lrp16 was a component mediating Akt signaling in MIN6 cells. These results suggest that lrp16 plays a key role in maintaining pancreatic β-cell functions and may help us to understand the protective effects of estrogen on the functions of pancreatic β-cells.

关键词： lrp16 MIN6 insulin Akt signaling proliferation apoptosis

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lrp16与ERα相互作用增强ERα介导的转录活性

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中国生物化学与分子生物学报 2007年第7期23卷 566-573页

作者：韩为东伍志强臧丽赵亚力孟元光李琦司艺龄郝好杰母义明解放军总医院基础医学所分子生物室北京100853 解放军总医院内分泌科北京100853 解放军总医院妇产科北京100853

lrp16是一个雌激素(E2)通过受体α(ERα)诱导表达的靶基因,lrp16不仅促进人乳腺癌MCF-7细胞的增殖,而且促进细胞的侵袭生长,但对lrp16作用的分子机制尚不清楚.首先,检测到lrp16表达缺陷明显削弱了MCF-7细胞对E2的反应性增殖能力;采用Nor... 详细信息

lrp16是一个雌激素(E2)通过受体α(ERα)诱导表达的靶基因,lrp16不仅促进人乳腺癌MCF-7细胞的增殖,而且促进细胞的侵袭生长,但对lrp16作用的分子机制尚不清楚.首先,检测到lrp16表达缺陷明显削弱了MCF-7细胞对E2的反应性增殖能力;采用Northern印迹与Western印迹法,进一步检测到抑制lrp16表达,明显损害了ERα靶基因对E2诱导上调的反应性,这些基因包括了cyclinD1,c-myc,c-fos,MTA3,pS2和维甲酸受体α基因(RARα)等;以上结果提示,lrp16参与了ERα介导的信号途径.将ERα模式启动子报告基因3×ERE-TATA-Luc,ERα以及lrp16表达载体共转染MCF-7与HeLa细胞.结果发现,lrp16增强了ERα对报告基因的转录激活,并呈现对lrp16的剂量依赖性;进而采用GST-pulldown以及免疫共沉淀方法证实了lrp16与ERα之间的直接相互作用,该作用不依赖于E2的存在,但可被E2增强;采用哺乳动物双杂交方法进一步证实了ERα与lrp16相互作用位点存在于A/B区的激活功能域-1(AF-1).以上结果表明,lrp16是ERα的一个共激活因子,通过相互作用,lrp16增强了ERα介导转录活性.该研究为lrp16促进ERα阳性乳腺癌细胞增殖与侵袭生长提供了合理的分子解释.

关键词：雌激素受体α lrp16 相互作用共激活因子

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lrp16结合poly(ADP-ribose)关键位点的识别

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中国生物化学与分子生物学报 2013年第11期29卷 1048-1053页

作者：柏苗苗王春萌伍志强梅倩李小雷李祥赵亚力韩为东解放军总医院基础医学研究所分子生物学研究室北京100853

lrp16作为macro domain家族成员,可识别、结合poly(ADP-ribose),参与DNA损伤修复的早期反应.但究竟lrp16通过其何种氨基酸位点识别、结合poly(ADP-ribose)(PAR)尚不十分清楚.本研究首先通过对lrp16蛋白的结构分析,查找lrp16结合PAR的候... 详细信息

lrp16作为macro domain家族成员,可识别、结合poly(ADP-ribose),参与DNA损伤修复的早期反应.但究竟lrp16通过其何种氨基酸位点识别、结合poly(ADP-ribose)(PAR)尚不十分清楚.本研究首先通过对lrp16蛋白的结构分析,查找lrp16结合PAR的候选氨基酸位点,然后利用丙氨酸扫描技术构建系列lrp16(点)突变体,并且进行原核蛋白表达与纯化,将获得的蛋白质进行斑点杂交实验,检测lrp16突变体蛋白与PAR的结合活性.测序结果显示,lrp16点突变基因序列成功插入到原核表达载体pGEX-6p-1中;斑点杂交实验显示,lrp16中第160位D和第161位I突变成A后,其与PAR结合能力明显减弱,而第181位G、183位V、184位D同时突变为A,lrp16与PAR的结合活性有部分减弱.结果表明,lrp16中第160位和第161位的氨基酸是其与PAR结合的关键位点.

关键词： lrp16 多聚腺苷二磷酸核糖丙氨酸扫描

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lrp16对乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响

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中国生物化学与分子生物学报 2003年第5期19卷 672-676页

作者：韩为东李雪岭卢学春徐周敏于力李明母义明解放军总医院基础医学研究所分子生物学研究室北京100853 大连中心医院中心实验室大连116033 解放军总医院血液科北京100853 解放军总医院内分泌科北京100853

用Northern印迹方法检测雌二醇 (17β E2 )对lrp16mRNA表达的时间及剂量依赖性调控作用 .构建lrp16基因启动子序列调控的萤光素酶报告子 (pS0 ) ,并与雌激素受体α和 β(ERα和ERβ)表达载体共转染COS 7和MCF 7细胞后测定萤光素酶活性 .... 详细信息

用Northern印迹方法检测雌二醇 (17β E2 )对lrp16mRNA表达的时间及剂量依赖性调控作用 .构建lrp16基因启动子序列调控的萤光素酶报告子 (pS0 ) ,并与雌激素受体α和 β(ERα和ERβ)表达载体共转染COS 7和MCF 7细胞后测定萤光素酶活性 .将lrp16基因的表达载体转染MCF 7细胞 ,测定过表达lrp16对细胞的生长特性的影响 .17β E2 使MCF 7细胞中lrp16mRNA表达水平增加 ,增加幅度未显示出 17β E2 培养时间和剂量的依赖性 .pS0 与ERα表达载体共转染细胞的相对萤光素酶活性较非共转染组 (对照组 )及pS0 ERβ表载体共转染组升高 5～ 10倍 .lrp16基因过表达促进MCF 7细胞的增殖 .研究表明 ,雌激素可能通过ERα上调乳腺癌MCF

关键词： lrp16 乳腺癌细胞增殖雌二醇

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雌激素通过lrp16基因5′侧翼GC富含区上调其转录的分子机制

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中国生物化学与分子生物学报 2006年第8期22卷 627-634页

作者：司艺玲韩为东赵亚力李琦宋海静于力母义明解放军总医院基础医学研究所分子生物室北京100853 解放军总医院血液科北京100853 解放军总医院内分泌科北京100853

lrp16是一个明确的雌激素(E2)反应性靶基因,已往研究在lrp16基因上游调控区鉴定了一个E2反应性1/2ERE/GC富含的ERα作用位点(-676bp到-214bp;命名为A区).为进一步鉴定雌激素上调lrp16基因表达的最大化反应区域,对lrp16基因上游调控区进... 详细信息

lrp16是一个明确的雌激素(E2)反应性靶基因,已往研究在lrp16基因上游调控区鉴定了一个E2反应性1/2ERE/GC富含的ERα作用位点(-676bp到-214bp;命名为A区).为进一步鉴定雌激素上调lrp16基因表达的最大化反应区域,对lrp16基因上游调控区进行缺失突变,通过相对荧光素酶活性分析观察到lrp16基因的一段5′近端侧翼序列(-213bp到-24bp;命名为B区)具有明显的E2反应性.通过与A区比较,认为B区最大化的呈递了E2对lrp16基因的转激活效应.序列分析表明,B区缺乏经典的ERE元件,而包含多个富含GC序列.针对Sp1的siRNA实验结果提示,Sp1参与了E2对该区域的转激活.针对GC富含区进一步的缺失突变,及荧光素酶活性分析,识别了一段30bp(-213bp到-184bp)的序列在B区呈递E2反应活性中发挥核心作用.超级凝胶电泳实验结果表明,Sp1蛋白与这段30bp的DNA序列在体外存在直接结合作用.染色质免疫共沉淀实验结果证实,ERα、Sp1与B区存在E2依赖性相互作用.本文在lrp16的5′-侧翼区识别了一段最大化呈递E2活性的DNA片段.机制研究表明,在E2存在条件下,ERα通过Sp1与该区域的直接作用上调lrp16基因的表达.

关键词：雌激素雌激素受体α lrp16 Sp1

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