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志贺氏菌O-PS的结构改造及党参内生菌胞外多糖的初步研究

志贺氏菌O-PS的结构改造及党参内生菌胞外多糖的初步研究

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作者：曲亚军山东大学

学位级别：硕士

糖类(包括单糖、寡糖和多糖)及糖缀合物广泛存在于生物体内,作为重要的结构组成和信息分子,在许多生物过程中都发挥着重要的作用。细菌表面包被有结构复杂的多糖,包括脂多糖(lps)、荚膜多糖(CPS)、胞外多糖(EPS)三种主要的类型。其中脂... 详细信息

糖类(包括单糖、寡糖和多糖)及糖缀合物广泛存在于生物体内,作为重要的结构组成和信息分子,在许多生物过程中都发挥着重要的作用。细菌表面包被有结构复杂的多糖,包括脂多糖(lps)、荚膜多糖(CPS)、胞外多糖(EPS)三种主要的类型。其中脂多糖共价连接于细胞表面,是革兰氏阴性细菌外壁层的组成部分,由类脂A、核心寡糖和O-抗原三部分组成,包含有多个重复单元,具有高度的结构多样性,是细菌重要的毒力因子。胞外多糖由细菌分泌产生,是一类高分子的碳水化合物聚合物。O-抗原由多拷贝(可多达100个)寡糖重复单位构成,属于多糖抗原,它们与核心寡糖和类脂A共价结合在细菌表面形成脂多糖。O-抗原在不同细菌间存在巨大的多样性,根据O-抗原的结构不同,细菌菌株被分成不同的O-血清型(O-serotype)。越来越多的证据表明O-抗原在关联细菌与宿主环境,保护细菌不受免疫清除中扮演重要角色,且参与细菌感染。痢疾志贺氏菌1型(Shigella dysenteriae serotype 1)会导致严重的志贺氏菌病,具有高死亡率的特点。对痢疾志贺氏菌的专一血清型的O-抗原的抗体已经表明对宿主有保护性。据报道,人的血清中含有多种天然糖抗体,如anti-Rhamnose(Rha)、anti-Mannose(Man)、anti-GalNAc 等,其中对于 anti-α-Galactose(Gal)抗体的研究比较多,例如,合成α-Gal流感疫苗和α-Gal-HIVgp120疫苗,以提高疫苗的免疫原性;制备含有α-Gal表位的肿瘤疫苗用于癌症治疗等。较引人注目的是,近几年的研究发现,人体血清中含有高滴度anti-Rha抗体,甚至高于anti-α-Gal抗体;而且Rha是许多致病菌表面的抗原,因此越来越多的研究者将Rha用于疫苗设计。根据亲和层析的原理,我们从人血清中纯化得到了 anti-Rha抗体,能够特异性的结合Rha。本论文第二章主要是Shigella dysenteriae 1 O-PS在大肠杆菌中的结构重塑。我们将*** 1中负责含Rha的O-抗原合成的四个糖基转移酶,即rfbR(rhamnosyltransferase),rfbQ(rhamnosyltransferase)和 orf9(galactosyl transferase)以及rfp(galactosyltransferase)分别构建入载体pACT3和pET15b中,转入细菌载体*** K-12 W3110中,对*** 1 O-PS进行异源表达。通过热水-苯酚法提取lps,使用Bio-Gel P-2纯化得到O-PS,得到的lps和O-PS通过银染,western blot,质谱和离子色谱等方法进行验证,结果证明细菌载体构建成功,在其表面展示含有Rha抗原的糖结构,该重组菌具有作为鼠李糖载体的潜在价值,具有理论研究意义及应用价值。本论文第三章是党参内生菌14-DS-1胞外多糖的初步研究。党参多糖具有延缓衰老、抗疲劳、抗肿瘤、抗辐射等作用。菌株14-DS-1从党参中分离得到,对菌株进行了 16SrDNA测定与分析,表明14-DS-1属于芽孢杆菌属(Bacillus)。首先,我们对内生菌14-DS-1胞外多糖进行了分离纯化,通过离子色谱分析了胞外多糖的糖组分,结果显示该胞外多糖由6种单糖组成,包括Fucose(Fuc)、Glucose(Glc)和4种修饰化的单糖。其次,对胞外多糖进行了细胞活性的初步测定。本部分研究为党参生物活性机理研究及发现具有生物学活性的多糖组分奠定了基础。

关键词： O-抗原 anti-Rha抗体 lps异源表达细菌载体内生菌胞外多糖

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