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作者：裴静璇南昌大学

学位级别：硕士

目的：观察HMGB1-Abox高表达对肠上皮细胞株SW480和单核细胞株THP-1中lps/tlr4的影响，为以HMGB1-Abox为靶点治疗IBD提供理论和实验依据。方法：㈠lps对SW480细胞HMGB1表达的影响实验分组如下： ①对照组：SW480+0ng/ml lps;②实验... 详细信息

目的：观察HMGB1-Abox高表达对肠上皮细胞株SW480和单核细胞株THP-1中lps/tlr4的影响，为以HMGB1-Abox为靶点治疗IBD提供理论和实验依据。方法：㈠lps对SW480细胞HMGB1表达的影响实验分组如下： ①对照组：SW480+0ng/ml lps;②实验组1：SW480+100ng/ml lps;③实验组2：SW480+1000ng/ml lps;④实验组3：SW480+10000ng/ml lps;培养SW480细胞至对数生长期，给予不同浓度lps分别作用12h、24h收集细胞检测HMGB1的表达(重复3次)。㈡构建和鉴定HMGB1-Abox高表达细胞株 ⑴HMGB1-Abox重组真核质粒的构建及鉴定 ①在GeneBank中查找人HMGB1-A box基因序列，由公司基因合成。 ②将合成的HMGB1-A box基因插入到pEGFP-N1载体，构建重组质粒。扩增及提取重组质粒，鉴定方法采用酶切和测序。 ⑵HMGB1-Abox重组真核质粒在SW480细胞内的表达采用阳脂质体转染技术将pEGFP-N1-HMGB1-A box转染SW480细胞，分别观察有无绿色荧光及荧光强度，并收集细胞检测HMGB1-Abox mRNA表达水平(重复3次)。㈢HMGB1-A box高表达和EP对SW480肠上皮细胞HMGB1、lps/tlr4信号通路及促炎因子的影响实验分组： ①对照组：SW480细胞;②EP组：SW480细胞+EP;③空质粒组：转染空质粒的SW480细胞;④Abox质粒组：转染HMGB1-Abox质粒的SW480细胞上述各组再分为lps及无lps处理。(EP为5mM，预处理1h，lps为1000ng/ml，24h)，24h后收集细胞培养上清及细胞(重复3次)。㈣EP及HMGB1-A box高表达SW480细胞与THP-1细胞共培养对THP-1细胞HMGB1、lps/tlr4信号通路及促炎因子分泌的影响用Transwell系统将SW480细胞和THP-1细胞共培养，实验分组： ①对照组：SW480细胞+THP-1;②EP组：SW480细胞+EP+THP-1;③空质粒组：转染空质粒的SW480细胞+THP-1;④Abox质粒组：转染HMGB1-Abox质粒的SW480细胞+THP-1 上述各组再分为lps处理及无lps处理。(EP为5mM，预处理1h，lps为1000ng/ml，24h)，24h后收集细胞培养上清及细胞(重复3次)。㈤检测方法： ①实时荧光定量PCR方法检测细胞HMGB1、tlr4、MyD88mRNA表达。 ②免疫印迹方法检测细胞HMGB1、tlr4、MyD88、pNF-κB p65蛋白表达。 ③双抗夹心ELISA方法检测细胞培养上清中HMGB1含量。 ④固相多重双抗夹心ELISA方法检测细胞培养上清中IL-1β、TNF-α和IL-6的含量。结果：㈠lps对SW480细胞内HMGB1的影响： ①不同浓度的lps处理SW480细胞12h，SW480细胞HMGB1mRNA表达都有升高，其中lps浓度为100ng/ml组与对照组相比，有统计学差异(Plps处理24h时，SW480细胞HMGB1mRNA表达都有升高，其中1000ng/ml组HMGB1mRNA表达与对照组相比，有统计学差异(P0.05)。 ②lps处理SW480细胞不同时间，24h组HMGB1mRNA表达均高于12h组，但只有1000ng/ml组有统计学意义(Plps的处理时间为24h，作用浓度为1000ng/ml。㈡构建和鉴定HMGB1-Abox高表达SW480细胞 ⑴HMGB1-Abox重组真核表达质粒的构建及鉴定成功构建pEGFP-N1-HMGB1-A box重组表达质粒，酶切后琼脂糖凝胶电泳显示两条带，其分子量大小与预期大小相同。测序分析显示插入片段与PubMed基因文库(GenBank Accession: NM02128.4)中的HMGB1-A box基因序列相似性为100%。 ⑵HMGB1-Abox重组真核质粒在SW480细胞内的表达 HMGB1-A box重组质粒转染SW480细胞后，在荧光显微镜下出现绿色荧光。细胞内HMGB1-Abox mRNA表达高于未转染组(P480细胞HMGB1、lps/tlr4信号通路及促炎因子分泌的影响 ⑴各组细胞内HMGB1mRNA及蛋白表达： HMGB1mRNA和蛋白的表达在无lps处理组之间无统计学差异(P>0.05),在lps处理组EP组显著低于对照组、空质粒组和A

关键词： HMGB1-Abox lps/tlr4信号通路 SW480 THP-1 IBD

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HMGB1-A box对SW480和THP-1细胞lps/tlr4信号通路的影响

HMGB1-A box对SW480和THP-1细胞LPS/TLR4信号通路的影响

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第九届全国免疫学学术大会

作者：谢勇裴静璇王福财周南进南昌大学第一附属医院消化内科江西省消化系病研究所南昌大学免疫学教研室江西省医学科学研究院

背景与目的:高迁移率族蛋白B1(HMGB1)是toll样受体4(tlr4)的内源性配体,它由由Abox和B box两部分组成,其中B box是HMGB1的致炎活性结够域,它激活HMGB1/tlr4信号通路参与炎症性肠病的发病,而A box蛋白与B box虽然有40%的一致性,但其本身... 详细信息

背景与目的:高迁移率族蛋白B1(HMGB1)是toll样受体4(tlr4)的内源性配体,它由由Abox和B box两部分组成,其中B box是HMGB1的致炎活性结够域,它激活HMGB1/tlr4信号通路参与炎症性肠病的发病,而A box蛋白与B box虽然有40%的一致性,但其本身并无诱导炎症因子表达和释放功能,它可通过竞争性地结合HMGB1受体阻断和消弱B box的致炎作用,是HMGB1的天然拮抗剂。本文观察HMGB1-Abox高表达对肠上皮细胞株SW480和单核细胞株THP-1中lps/tlr4的影响,为以HMGBl-A box为靶点治疗IBD提供理论和实验依据。方法:①转染pEGFP-N1-HMGB1-A box肠上皮细胞株SW480,构建HMGB1-A box高表达的肠上皮细胞;②在transwell共培养体系中HMGBl-A box高表达的肠上皮细胞与单核细胞THP1共培养;③用lps处理SW480细胞和共培养体系;④实时荧光定量PCR方法检测细胞HMGB1、tlr4、MyD88 mRNA表达;⑤免疫印迹方法检测细胞HMGB1、tlr4、MyD88、pNF-κB p65蛋白表达;⑥双抗夹心ELISA方法检测细胞培养上清中HMGB1含量;⑦固相多重双抗夹心ELISA方法检测细胞培养上清中促炎细胞因子IL-1β、TNF-α和IL-6的含量。结果:①HMGB1-A box高表达不影响肠上皮细胞株SW480中HMGBl、tlr4、MyD88、pNF-κB p65表达及促炎因子分泌。②THP-1细胞与SW480细胞共培养后,THP-1细胞中HMGBl、tlr4、MyD88、pNFrd3 p65表达在无lps处理组之间无统计学差异(P>0.05),在lps处理组HMGB1、tlr4、MyD88、pNF-κBp65表达在A box转染组显著低于对照组和空质粒组(Plps处理均显著高于相对应的无lps处理组(P480细胞共培养后,培养上清中HMGB1、IL-1β、TNF-α和IL-6的含量在无lps处理组之间无统计学差异(P>0.05);在lps处理组HMGB1、IL-1β、TNF-α和IL-6的含量在A box转染组显著低于对照组和空质粒组(Plps处理组均显著高于相对应的无lps处理组(Plps可激活SW480和THP-1细胞tlr4信号通路及上调HMGB1的表达,促进促炎细胞因子分泌。②HMGB1-A box高表达SW480与THP-1细胞共培养可抑制后者表达和分泌HMGB1及并抑制lps/tlr4信号通路和促炎细胞因子分泌。

关键词： HMGB1-A box lps/tlr4信号通路 SW480 THP-1 IBD

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补肾排毒胶囊对慢性肾脏病肾脏保护作用的机制研究

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时珍国医国药 2024年第9期35卷 2147-2151页

作者：李旭萍刘克成张晶薛国忠柳振华王小英甘肃中医药大学附属医院甘肃兰州7300000 甘肃中医药大学中医临床学院甘肃兰州730000

目的基于肠肾轴理论探讨补肾排毒胶囊作用于肠道屏障调节内毒素(lps)/Toll样受体4(Toll-like receptors 4,tlr4)信号通道对慢性肾脏病(CKD)肾脏的保护作用。方法通过单侧输尿管结扎法建立慢性肾脏病模型。分为空白组(Nomel,NC)、模型组(... 详细信息

目的基于肠肾轴理论探讨补肾排毒胶囊作用于肠道屏障调节内毒素(lps)/Toll样受体4(Toll-like receptors 4,tlr4)信号通道对慢性肾脏病(CKD)肾脏的保护作用。方法通过单侧输尿管结扎法建立慢性肾脏病模型。分为空白组(Nomel,NC)、模型组(Model)、补肾排毒胶囊低剂量组(Low dose group of Bushen Paidu capsule,BSPD-L)、补肾排毒胶囊中剂量组(Medium dose group of Bushen Paidu capsule,BSPD-M)、补肾排毒胶囊高剂量组(High dose group of Bushen Paidui capsule,BSPD-H)、盐酸贝那普利组(Benazepril Hydrochloride group,BH),每日给药1次,28d后取材。HE染色、Mosson染色观察肾脏组织病理改变;ELISA检测半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(Cys C)、硫酸吲哚酚(IS)、生长转化因子-β(TGF-β)、白介素-6(IL-6)含量;生化检测血尿素氮(BUN)、血清肌酐(Scr)、血尿酸(UA)含量;Western blot检测肾、肠组织tlr4蛋白表达水平;RT-PCR检测肾、肠组织tlr4mRNA表达水平;鲎试剂盒动态浊度法内毒素定量检测。结果与NC组相比,Model组大鼠肾小球结构破坏,纤维化明显,视野中基本无完整的肾小球存在,肾小管存在明显的蛋白管型,肾小管上皮细胞脱落,Cys C、IS、TGF-β、IL-6、BUN、Scr、UA含量显著升高(Ptlr4蛋白表达水平明显升高(Ptlr4mRNA表达水平显著升高(Ptlr4蛋白和基因表达水平,改善内毒素水平,其中BSPD-H组和BH组病理恢复最好(Plps/tlr4信号通道,下调炎症因子水平,降低尿毒症毒素含量,改善CKD大鼠肾组织病理形态。

关键词：慢性肾脏病补肾排毒胶囊 lps/tlr4信号通路肠肾轴

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HMGB1-A box和EP对SW480细胞tlr4信号通路的影响

HMGB1-A box和EP对SW480细胞TLR4信号通路的影响

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第九届全国免疫学学术大会

作者：裴静璇黄利兴刘东升周小江周南进谢勇南昌大学第一附属医院消化研究所江西省医学科学研究院

目的:观察HMGBl-A box高表达对SW480肠上皮细胞株lps/tlr4的影响,为以HMGBl-A box为靶点治疗IBD提供理论和实验依据。方法:培养SW480细胞至对数生长期,给予不同浓度lps(0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/m1)分别作用12h、24h收集细胞检测HMGB... 详细信息

目的:观察HMGBl-A box高表达对SW480肠上皮细胞株lps/tlr4的影响,为以HMGBl-A box为靶点治疗IBD提供理论和实验依据。方法:培养SW480细胞至对数生长期,给予不同浓度lps(0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/m1)分别作用12h、24h收集细胞检测HMGB1的表达。HMGB1-Abox高表达和EP(丙酮酸乙酯,HMGB1释放抑制剂)对SW480肠上皮细胞HMGB1、lps/tlr4信号通路及促炎因子的影响,实验分组:①对照组:SW480细胞;②EP组:SW480细胞+EP;③空质粒组:转染空质粒的SW480细胞;④A box质粒组:转染HMGB1-A box质粒的SW480细胞。上述各组再分为lps及无lps处理。(EP为5mM,预处理1h,lps为1μg/ml,24h),24h后收集细胞培养上清及细胞。结果:***对SW480细胞内HMGB1的影响:(1)不同浓度的lps处理SW480细胞12h,SW480细胞HMGB1 mRNA表达都有升高,其中lps浓度为0.1μg/ml组与对照组相比,有统计学差异(Plps处理24h时,SW480细胞HMGB1 mRNA表达都有升高,其中1μg/ml组HMGB1 mRNA表达与对照组相比,有统计学差异(P0.05)。(2)lps处理SW480细胞不同时间,24h组HMGB1 mRNA表达均高于12h组,但只有1μg/ml组有统计学意义(Plps的处理时间为24h,作用浓度为1μg/ml。***和HMGB1-Abox高表达对SW480细胞lps/tlr4信号通路及促炎因子分泌的影响(1)各组细胞内HMGB1 mRNA及蛋白表达:HMGB1 mRNA和蛋白的表达在无lps处理组之间无统计学差异(P>0.05),在lps处理组EP组显著低于对照组、空质粒组和Abox转染组(P0.05);除EP组,各lps处理均显著高于相对应的无lps处理组(Ptlr4 mRNA及蛋白的表达:tlr4 mRNA和蛋白的表达在无lps处理组之间无统计学差异(P>0.05),在lps处理组EP组显著低于对照组、空质粒组和Abox转染组(P0.05);除EP组,各lps处理均显著高于相对应的无lps处理组(Plps处理组之间无统计学差异(P>0.05),在lps处理组EP组显著低于对照组、空质粒组和Abox转染组(P0.05);除EP组,各lps处理均显著高于相对应的无lps处理组(P4)各组细胞培养上清中HMGB1、IL-1β、TNF-α和IL-6的含量:①HMGB1的含量在无lps处理组之间无统计学差异(P>0.05),在lps处理组EP组显著低于对照组、空质粒组和A box转染组(P0.05);除EP组,各lps处理均显著高于相对应的无lps处理组(Plps处理组之间无统计学差异(P>0.05),在lps处理组EP组显著低于对照组、空质粒组和A box转染组(P0.05);除EP组,各lps处理均显著高于相对应的无lps处理组(P480细胞tlr4信号通路及上调HMGB1的表达,促进促炎细胞因子分泌。***可以抑制SW480细胞HMGB1的表达和分泌,并抑制lps/tlr4信号通路及促炎细胞因子分泌。

关键词： HMGB1-A box lps/tlr4信号通路 SW480

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ABRO1基因敲除小鼠骨髓来源巨噬细胞的永生化及其lps/tlr4通路活化的检测

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军事医学 2018年第4期42卷 249-253页

作者：张煊宜詹轶群杨晓明尹荣华军事科学院军事医学研究院生命组学研究所北京102206

目的永生化ABRO1基因敲除(KO)小鼠骨髓来源的巨噬细胞系(BMDM),并确定缺失ABRO1对巨噬细胞lps/tlr4通路活化的影响。方法用p CDH-SV40LT-puro慢病毒分别感染野生型(WT)及ABRO1 KO小鼠的BMDM,连续传代培养>50代,得到永生化细胞系。利用MT... 详细信息

目的永生化ABRO1基因敲除(KO)小鼠骨髓来源的巨噬细胞系(BMDM),并确定缺失ABRO1对巨噬细胞lps/tlr4通路活化的影响。方法用p CDH-SV40LT-puro慢病毒分别感染野生型(WT)及ABRO1 KO小鼠的BMDM,连续传代培养>50代,得到永生化细胞系。利用MTS法和Ed U掺入法检测细胞增殖,AnnexinⅤ/7-AAD双染色后用流式细胞仪检测细胞凋亡。脂多糖(lps)刺激细胞后,Western印迹法检测NF-κB及MAPK信号通路,并用流式微球阵列(CBA)检测细胞产生IL-6、TNF-α的水平。结果成功构建了ABRO1 WT和KO的永生化BMDM(i BMDM)。正常培养下,WT及KO i BMDM细胞增殖能力和细胞凋亡均无明显差异,但撤除血清后,KO i BMDM细胞凋亡明显高于WT。lps刺激后,NF-κB、MAPK信号通路激活及IL-6、TNF-α的产生无明显差异。结论ABRO1缺失不影响lps/tlr4信号通路。敲除ABRO1促进血清撤除诱导的i BMDM凋亡。

关键词： ABRO1 小鼠,基因敲除骨髓巨噬细胞永生化细胞增殖细胞凋亡 lps/tlr4信号通路 Toll样受体4

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药食同源中药复方防治酒精性肝损伤的作用及机制研究

药食同源中药复方防治酒精性肝损伤的作用及机制研究

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作者：李文丽江西中医药大学

学位级别：硕士

酒精性肝损伤,又称酒精性肝病(alcoholic liver disease,ALD)是全国乃至世界范围内的重大健康问题,主要由过量酒精摄入导致肝脏氧化应激损伤和免疫损伤,同时酒精及其代谢产物破坏肠道健康并通过“肠-肝轴”对肝脏造成“二次打击”的过... 详细信息

酒精性肝损伤,又称酒精性肝病(alcoholic liver disease,ALD)是全国乃至世界范围内的重大健康问题,主要由过量酒精摄入导致肝脏氧化应激损伤和免疫损伤,同时酒精及其代谢产物破坏肠道健康并通过“肠-肝轴”对肝脏造成“二次打击”的过程被认为在ALD的发生中起到关键作用。目前并无防治ALD的高安全性特效药物,然而中医药尤其是药食同源中药表现出拮抗ALD的良好效果,若科学配伍组方可实现在日常食养中防治ALD。目的:在中医理论指导下配伍药食同源中药复方(简称复方),探究其防治ALD的作用及机制,为发展中医药食养服务、防治ALD提供理论依据。方法:1.防治ALD的药食同源中药复方拟定。利用中医传承计算平台挖掘《中华医典》中防治ALD的古方数据,分析古代中医药防治ALD的处方用药规律,在此基础上运用中医理论配伍拟定复方。2.药食同源中药复方防治大鼠ALD的作用及机制研究。采用梯度酒精灌胃法建立ALD大鼠模型,同时给予复方干预。从一般体征、血清生化、组织病理角度评价复方对ALD大鼠肝脏和肠道的保护作用。从肠黏膜屏障功能和脂多糖(lipopolysaccharide,lps)/Toll样受体(toll-like receptor,tlr)4通路探究复方防治ALD的机制与“肠-肝轴”的相关性。3.药食同源中药复方对ALD大鼠肠道微生物的影响。对ALD大鼠的盲肠内容物进行生物信息统计分析,根据菌群生物多样性、菌群结构、生化指标相关性和功能预测等分析,从肠道生物屏障角度进一步探究复方防治ALD的机制与“肠-肝轴”的相关性。结果:1.防治ALD的药食同源中药复方拟定。(1)筛选得到处方240首,含中药189味,主要为补虚类、理气类和利水渗湿类,用药归经多属脾、胃、肺经,药性总属温、寒、平性,药味总属辛、苦、温味。关联分析得到30对高频药物组合和28条关联规则。聚类分析得到类方1大黄-栀子-甘草-黄芩-茵陈,类方2白术-茯苓-葛根-陈皮-人参和类方3葛根-葛花-陈皮-甘草-砂仁。(2)类方2、3与东垣葛花解酲汤组成高度吻合,拟结合二者配伍组方,用于ALD的预防与治疗。拟定复方:葛根15 g,茯苓15 g,砂仁10 g,陈皮10g,党参10 g,干姜6 g。2.药食同源中药复方防治大鼠ALD的作用及机制研究。(1)一般体征:复方能改善ALD大鼠毛发枯黄、精神萎靡、反应迟缓、便溏尿黄、不欲饮水、频繁抓毛以及出现醉酒态等症状。(2)血清生化:与正常组比较,模型组大鼠白细胞(white blood cell,WB C)、淋巴细胞数目(lymphocyte number,Lymph#)、单核细胞数目(monocyte number,Mon#)显著升高(P4)乙醇代谢酶:与正常组比较,模型组大鼠血清乙醛脱氢酶(acetaldehyde dehydrogenase,ALDH)浓度降低(Plps、D-乳酸(D-lactic acid,D-LA)浓度显著升高(Plps、D-LA浓度下降(均Ptlr4通路:与正常组比较,模型组大鼠肝脏tlr4、髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88,

关键词：酒精性肝损伤药食同源数据挖掘用药规律肠-肝轴 lps/tlr4信号通路肠道菌群机制研究

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