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植物乳杆菌lp-1上清调控肠道钙离子抗PEDV作用研究

植物乳杆菌LP-1上清调控肠道钙离子抗PEDV作用研究

引用

作者：阚子斐西南大学

学位级别：硕士

猪流行性腹泻(Porcine Epidemic Diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起猪的一种急性高度接触性肠道传染性疾病。临床症状为呕吐、严重腹泻、脱水并最终导致仔猪死亡。该病对哺乳期仔猪具有极... 详细信息

猪流行性腹泻(Porcine Epidemic Diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起猪的一种急性高度接触性肠道传染性疾病。临床症状为呕吐、严重腹泻、脱水并最终导致仔猪死亡。该病对哺乳期仔猪具有极高的感染率,感染后致死率高达95%以上,给养猪业带来极大地危害。从2010年起,PEDV疫苗的免疫效果越来越差,免疫后的猪群同样爆发PEDV且出生仔猪死亡率高达90%以上。在如此大环境下急需探寻新方法来防治PED。益生菌能通过调节宿主肠道黏膜免疫系统维持肠道内环境微生物稳态,提高营养物质吸收效率,维持肠道菌群平衡,起到保护肠道健康的功能。已有研究表明,多种益生菌代谢产物具有抗病毒作用且能调节大鼠小肠上皮细胞中的钙离子浓度,本实验室前期成功分离得到一株植物乳杆菌,命名为lp-1,前期试验表明该菌株上清液能够抑制PEDV感染,但具体机制还未知。Ca作为细胞内信号转导过程中重要的第二信使,是维持和调节机体生理功能的必需元素。当Ca稳态遭到破坏时,将会引发疾病和代谢紊乱。有研究表明一些病毒感染之后,能调控细胞内钙离子水平或钙离子通道以达到促进自身感染和复制的目的。目前尚不明确PEDV感染过程中能否引起钙离子浓度上升促进自身复制。基于此,探究Ca在PEDV感染过程中作用,植物乳杆菌lp-1上清是否通过调控Ca抗病毒,这两点为PEDV的防治的新方法提供理论基础。本论文的内容及结果如下:植物乳杆菌lp-1上清抗PEDV-LJX株作用研究:测定植物乳杆菌lp-1生长曲线,确定12h为上清的最佳获取时间。MTT法检测lp-1s1/4倍稀释为IPEC-J2细胞的最大无毒剂量,Western-blot检测发现1/4倍稀释为抗PEDV最佳浓度且具有浓度依赖性。lp-1s处理IPEC-J2细胞在8h、12h、24h时能显著降低PEDV N蛋白表达,TCID结果表明在12h、24h、48h时lp-1s预处理组能显著降低病毒滴度。表明植物乳杆菌lp-1上清具有良好的抗PEDV作用。细胞外Ca浓度变化对PEDV复制研究:用火焰原子吸收法建立Ca浓度标准曲线,用火焰原子吸收法检测细胞外Ca浓度,PEDV感染后细胞外Ca浓度低于空白对照组。用钙离子荧光探针Fluo-3AM检测细胞内Ca浓度,PEDV感染组细胞内Ca荧光强度都极显著高于空白对照组的Ca荧光强度。MTT法检测EGTA细胞毒性,用EGTA螯合细胞外Ca,绝对荧光定量PCR方法检测IPEC-J2细胞中PEDV M基因拷贝数,Western-blot方法检测PEDV N蛋白表达量,EGTA预处理组PEDV M基因拷贝数和N蛋白表达量都显著低于PEDV组。为了确定EGTA对PEDV增殖的影响,在用EGTA处理细胞后加入Ca Cl补充细胞外钙离子,绝对荧光定量PCR、Western-blot检测发现添加Ca Cl后能回复PEDV M基因拷贝数和N蛋白表达量。用钙离子通道抑制剂盐酸苄普地尔处理细胞,发现盐酸苄普地尔预处理组能降低PEDV M基因拷贝数和N蛋白表达量。利用钙螯合剂BAPTA-AM预处理IPEC-J2细胞,发现BAPTA-AM预处理也能降低PEDV M基因拷贝数和N蛋白表达量。这些结论说明细胞内外Ca在PEDV感染过程中起着重要作用。植物乳杆菌lp-1上清调控钙离子抗PEDV作用研究:用火焰原子吸收法检测细胞外Ca浓度,在2h、8h、24h、48h时lp-1s能恢复由于PEDV感染引起的细胞外Ca浓度降低。用钙离子荧光探针Fluo-3AM检测细胞内Ca浓度,lp-1s处理组能降低由于PEDV感染引起的钙离子浓度异常升高。用相对荧光定量检测TRPV6的表达量,PEDV组能升高TRPV6的表达量,lp-1s预处理组能降低在PEDV感染情况下TRPV6的表达。用Western-blot检测TRPV6的表达量在6h和24h时lp-1s能够降低在PEDV感染情况下TRPV6的蛋白表达。用相对荧光定量检测PMCA1b的表达量,lp-1s能够升高在PEDV感染情况下PMCA1b的表达。用Western-blot检测PMCA1b的表达量在6h和12h两个时间点lp-1s能够升高在PEDV感染情况下PMCA1b的蛋白表达。结果表明植物乳杆菌lp-1上清能调控TRPV6和PMCA1b来减少进入细胞内Ca量达到抗PEDV的作用。干扰TRPV6和PMCA1b影响PEDV复制初步研究:转染质粒在24h达到稳定转染的状态,使用Western-blot检测干扰效率为40%左右。使用钙离子探针Fura-2AM检测干扰TRPV6和PMCA1b后细胞内Ca浓度,在干扰PMCA1b后会降低细胞膜对钙离子的通透性,减少钙离子向细胞外排出,一定程度增加细胞内钙离

关键词：猪流行性腹泻病毒 Ca2+ lp-1s TRPV6 PMCA1b

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基于JAK-sTAT1信号通路探讨植物乳杆菌上清抗TGEV感染的机制

基于JAK-STAT1信号通路探讨植物乳杆菌上清抗TGEV感染的机制

引用

作者：王凯西南大学

学位级别：硕士

猪传染性胃肠炎(Transmissible gastroenteritis,TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)引起的一种以严重腹泻、呕吐和脱水为临床症状的急性、高度接触性肠道传染病。其对两周龄以内的仔猪有极高的致死... 详细信息

猪传染性胃肠炎(Transmissible gastroenteritis,TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)引起的一种以严重腹泻、呕吐和脱水为临床症状的急性、高度接触性肠道传染病。其对两周龄以内的仔猪有极高的致死率,给养猪业带来极大的危害。现有的TGEV疫苗并不能产生理想的防治效果,因此以新方法防治猪传染性胃肠炎显得尤为重要。益生菌普遍存在于动物肠道中,有助于促进肠道蠕动、维持肠道稳态。目前研究表明多种益生菌可发挥抗病毒作用。本课题组前期成功分离并鉴定出一株植物乳杆菌,将其命名为lp-1,试验发现经该菌株上清(lp-1 supernatant,lp-1s)处理后,sT细胞能对TGEV感染产生明显的抑制作用。但lp-1s作用于猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)是否能抑制TGEV在该细胞内增殖,其具体机制目前尚无文献报道。本试验通过探究lp-1s作用于IPEC-J2细胞是否能对TGEV在该细胞内复制产生抑制效果,并进一步检测lp-1s处理后的IPEC-J2细胞感染TGEV不同时间点细胞诱导IFN-β水平,胞内sTAT1磷酸化、p-sTAT1核易位情况及部分IsGs转录及蛋白表达产生的影响,初步阐明lp-1s通过影响IPEC-J2细胞内JAK-sTAT1信号通路发挥抗TGEV的作用机制。主要研究内容如下:1、lp-1s处理后IPEC-J2细胞内TGEV的复制情况(1)MTT法检测发现1/4倍稀释lp-1s为作用IPEC-J2细胞的最大无毒剂量;利用Western-blot检测发现lp-1s在IPEC-J2细胞中抗TGEV效果具有浓度依赖性,最佳浓度剂量为1/4倍稀释。(2)1/4倍稀释的lp-1s作用于IPEC-J2细胞后感染TGEV GFP Miller(MOI=0.1)株,在不同时间点通过倒置荧光显微镜观察TGEV GFP Miller株的荧光强度,发现lp-1s预处理组荧光数目明显少于未处理组;TCID检测结果显示24h、48h lp-1s处理组较同时间点TGEV攻毒组均有极显著差异(P1)。利用绝对荧光定量PCR、Western-blot分别检测IPEC-J2细胞中TGEV Miller N基因的病毒拷贝数和N蛋白的表达量,发现12h lp-1s预处理组较TGEV攻毒组N基因拷贝数有显著差异(0.011)。2、lp-1s处理后IPEC-J2细胞内IFN-β诱导情况、sTAT1磷酸化水平及核易位情况将IPEC-J2细胞分为三组分别为植物乳杆菌上清预处理攻毒、攻毒组和空白对照组不同时间点收集细胞液上清,利用ELIsA试剂盒检测不同组份细胞诱导IFN-β产生水平,结果发现不同时间段中植物乳杆菌上清预处理组诱导IPEC-J2细胞产生IFN–β水平较TGEV感染组均有极显著差异(P1)。利用Western-blot技术检测三组不同时间点sTAT1蛋白磷酸化水平发现,lp-1s处理组感染TGEV后期(24h8h)sTAT1磷酸化水平较TGEV感染组有极显著差异(P1)。通过激光共聚焦显微镜发现,在12h lp-1s处理组感染TGEV后p-sTAT1核易位水平较TGEV感染组有显著差异(0.01lp-1s处理组感染TGEV较TGEV直接感染组p-sTAT1核易位水平有极显著差异(P1)。3、lp-1s处理后IPEC-J2细胞内部分IsGs转录水平及ZAP、PKR蛋白表达情况按上述将IPEC-J2分为三组,利用相对荧光定量PCR检测不同时间点胞内部分IsGs基因的转录水平。结果发现这些基因在TGEV感染后24h-48h,lp-1s预处理组IsGs转录水平较TGEV攻毒组均有极显著差异(0.011、Mx2的转录水平在24h均达到最高值,PKR、ZAP、OAsL、IsG15的基因转录水平与时间呈正相关,在48h达到峰值。Western-blot结果显示24h lp-1s处理后感染TGEV组胞内PKR蛋白表达水平在24h、48h较TGEV感染组有极显著差异(P1);ZAP蛋白表达水平在24h、48h较TGEV感染组有显著差异(0.01lp-1s处理后攻毒组p-PKR/β-Tubulin比值显著高于TGEV攻毒组(0.01lp-1s处理后攻毒组p-

关键词：猪传染性胃肠炎病毒 lp-1s 干扰素-β 信号传导及转录激活因子干扰素刺激基因

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