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CRISPR/Cas9介导的一个水稻育性控制基因的定点编辑

CRISPR/Cas9介导的一个水稻育性控制基因的定点编辑

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作者：梁衍玲四川农业大学

学位级别：硕士

水稻(Oryzasativa L.)是我国三大粮食作物之一,全球近一半人口,包括几乎整个东亚和东南亚,均以稻米为主食,所以水稻的质和量与当下备受关注的粮食安全问题有着密不可分的联系。水稻的育性对水稻的产量起着决定性作用,尽管有关水稻雄配... 详细信息

水稻(Oryzasativa L.)是我国三大粮食作物之一,全球近一半人口,包括几乎整个东亚和东南亚,均以稻米为主食,所以水稻的质和量与当下备受关注的粮食安全问题有着密不可分的联系。水稻的育性对水稻的产量起着决定性作用,尽管有关水稻雄配子体的发育的研究取得了长足的进展,但其分子机制研究还尚显不足。拟南芥作为模式植物,在雄配子体发育的分子机制研究方面较水稻成熟。其中,ACOS5(ACYL-COA SYNTHETASE5)是拟南芥花药中特异表达的一个基因,是控制拟南芥花粉发育的关键基因之一,该基因编码一种脂酰辅酶A合成酶,是一个保守并且具有特殊功能的蛋白。CRISPR/Cas系统是近几年兴起的基因组编辑技术,该技术利用RNA引导Cas9蛋白核酸酶在特定的基因位点上进行切割和修饰,较ZFN和TALEN基因组编辑技术操作性更简便,突变效率更高,而且易在转基因植株TO代得到纯合的突变体和在不同的基因位点同时引入突变。Type II型CRISPR/Cas系统目前研究的最为深入,并广泛应用于多种生物。本实验拟通过利用CRISPR/Cas9的定点敲除系统,将通过氨基酸同源序列分析而发现的与拟南芥ACOS5基因一致性达61.8%的水稻基因LOC 进行靶向编辑。利用农杆菌介导的遗传转化体系将所构CRISPR/Cas9载体pCAS9-Os04g24530-sgRNA转入水稻受体日本晴并对所获的转基因敲除阳性植株进行测序比对和表型验证。具体研究结果如下:1.通过氨基酸同源序列分析,对比水稻和拟南芥同源氨基酸序列,拟南芥ACOS5与水稻基因LOC Os04g24530一致性达61.8%,且通过ACOS5的进化树分析,二者处于进化树同一分枝;2.为了保证CRISPR/Cas9敲除水稻基因LOC 靶位点的特异性,根据gramene网站上公布的该基因的序列,在该基因的第一个外显子上设计了一个CRISPR/Cas9靶位点,该位点PAM序列附近gC含量较高;3.将设计好的靶点连入CRISPR/Cas9载体中,并通过农杆菌介导的遗传转化系统将载体转入水稻受体日本晴愈伤组织中,经过潮霉素筛选、分化和生根,最终获得抗性植株143株;4.通过对潮霉素基因片段的扩增,最终获得阳性植株29株,转基因阳性率20.28%。PCR扩增含有CRISPR/Cas9靶位点的基因片段,扩增产物连入pEasy-Blunt载体进行单克隆测序分析,获得5株TO代敲除阳性植株,敲除阳性率 17.24%;5.5株突变体植株的突变方式表明:这5株突变体在基因的CRISPR靶位点有三种类型的突变:插入g、插入A和缺失g。其中,Plant4-1为bi-allelic,插入g和插入A;Plant4-2为bi-allelic,缺失g和插入A;Plant4-3为插入A纯合体;Plant4-4为杂合突变体,插入g;Plant4-5为杂合突变体,插入A;测序结果表明这三种突变类型的靶基因编码蛋白在N端出现异常且编码提前终止,表明靶标基因被成功定点编辑;6.田间观察发现,Plant4-4和Plant4-5自交正常结实;Plant4-1、Plant4-2和Plant4-3这3株TO代突变体表型一致,均表现花药发育异常、碘染无花粉、套袋不结实、做母本杂交正常结实,表明靶标基因被成功定点敲除。同时,此基因缺失导致水稻雄性不育,与ACOS5突变体在拟南芥中表型一致。该结果证实LOCs04g24530基因为水稻雄配子体正常发育的必须基因,与ACOS5同源。

关键词：水稻 locos04g24530 ACOS5 CRISPR/Cas9 雄性不育

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