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Muscle Magnetic Resonance Imaging in Patients with Various Clinical Subtypes of lmna-Related Muscular Dystrophy

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Chinese Medical Journal 2018年第12期131卷 1472-1479页

作者： Hui-Ting Lin Xiao Liu Wei Zhang Jing Liu Yue-Huan Zuo Jiang-Xi Xiao Ying Zhu Yun Yuan Zhao-Xia Wang Department of Neurology Peking University First Hospital Beijing 100034 China Department of Radiologyl Peking University First Hospitall Beijing 1000341 China

Background： lmna-related muscular dystrophy can manifest in a wide variety of disorders, including Emery-Dreifuss muscular dystrophy （EDMD）, limb-girdle muscular dystrophy （LGMD）, and lmna-associated congenital muscular dystrophy （L-CMD）. Muscle magnetic resonance imaging （MRI） has become a useful tool in the diagnostic workup of patients with muscle dystrophies. This study aimed to investigate whether there is a consistent pattern of MRl changes in patients with lmna mutations in various muscle subtypes. Methods： Twenty-two patients with lmna-related muscular dystrophies were enrolled in this study. M RI of the thigh and/or calf muscles was performed in them. The muscle MRI features of the three subtypes were compared by the Mann-Whitney U-test. The relationship between the clinical and MRI findings was also investigated by Spearman＇s rank analyses. Results： The present study included five EDMD, nine LGMD, and eight L-CMD patients. The thigh muscle MRI revealed that the fatty infiltration of the adductor magnus, semimembranosus, long and short heads of the biceps femoris, and vasti lnuscles, with relative sparing of the rectus femoris, was the predominant change observed in the EDMD, LGMD, and advanced-stage L-CMD phenotypes, ahhough the involvement of the vasti muscles was not prominent in the early stage of L-CMD. At the level of the call; six patients （one EDMD, four LGMD, and one L-CMD） also showed a similar pattern, in which the soleus and the medial and lateral gastrocnemius muscles were most frequently observed to have fatty infiltration. The fatty infiltration severity demonstrated higher scores associated with disease progression. with a corresponding rate of 1.483 ＋ 0.075 × disease dnration （X）（r = 0.444, P - 0.026）. It was noteworthy that in six L-CMD patients with massive inflammatory cell infiltration in muscle pathology, no remarkable edema-like signals were observed in muscle MRI. Conclusions： EDMD, LGMD and advanced-staged L-CMD subtypes showed similar pattern of muscle MRI changes, while early-

关键词： Emery-Dreifuss Muscular Dystrophy Limb-Girdle Muscular Dystrophy Congenital Muscular Dystrophy lmna Muscle Magnetic Resonance Imaging

Identification of a New Lamin A/C Mutation in a Chinese Family Affected with Atrioventricular Block as the Prominent Phenotype

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Journal of Huazhong University of Science and Technology(Medical Sciences) 2010年第1期30卷 103-107页

作者：吴小艳王擎桂乐刘木根张贤钦金润铭李伟闫露杜戎王秋芬祝建芳杨钧国 Department of Pediatrics Union HospitalTongji Medical CollegeHuazhong University of Science and Technology Human Genome Research Center Union HospitalTongji Medical CollegeHuazhong University of Science and Technology Center for Human Genome Research and College of Life Science and Technology Huazhong University of Science and Technology Department of Molecular Cardiology Cleveland ClinicCleveland Electrocardiogram Lab Jinshan Hospital

Even though mutations in lmna have been reported in patients with typical dilated cardio-myopathy(DCM)and atrioventricular block(AVB)previously,the purpose of this study was to disclose this novel genetic abnormality in one Chinese family with the atypical phenotype of progressive AVB followed by DCM with normal QRS interval.Genome-wide linkage analysis mapped the AVB gene in this family to a marker at chromosome 1q21.2,where the lmna gene was located.Direct DNA sequence analysis revealed a heterozygous G t...

关键词： atrioventricular block dilated cardiomyopathy lmna

利用CRISPR/Cas9系统构建lmna基因突变 AC16人心肌细胞系

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广西师范大学学报（自然科学版） 2023年第3期41卷 163-170页

作者：邹镭邢兵杨柳广西师范大学生命科学学院广西桂林541006 珍稀濒危动植物生态与环境保护教育部重点实验室(广西师范大学) 广西桂林541006

lmna基因突变引发核纤层蛋白(LaminA/C)及其互作蛋白表达异常,引起机体一系列生理学反应,导致核纤层蛋白病发生,目前其具体致病机制尚不清楚。本文利用CRISPR/Cas9技术,选取符合sgRNA筛选原则的致病突变位点,成功构建了携带lmna突变Q517... 详细信息

lmna基因突变引发核纤层蛋白(LaminA/C)及其互作蛋白表达异常,引起机体一系列生理学反应,导致核纤层蛋白病发生,目前其具体致病机制尚不清楚。本文利用CRISPR/Cas9技术,选取符合sgRNA筛选原则的致病突变位点,成功构建了携带lmna突变Q517X的细胞系,并对突变细胞系与LaminA/C相连或互作的LaminB1、PCNA、P53、PKCα等基因的RNA表达水平与蛋白表达水平及突变细胞核膜骨架形态进行检测,发现:Q517X突变细胞的LaminB1、P53、PCNA基因mRNA表达量显著降低约70%;LaminA/C蛋白几乎不表达,PKCα、LaminB1、P53等蛋白的表达量分别降低75%、60%、80%。结果表明,Q517X突变通过改变AC16人心肌细胞lmna相关基因的表达进而影响细胞核正常骨架结构与功能。

关键词： lmna 核纤层蛋白核纤层蛋白病 CRISPR/Cas9 基因编辑

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lmna突变细胞系的构建及突变影响研究

LMNA突变细胞系的构建及突变影响研究

作者：邹镭广西师范大学

学位级别：硕士

研究目的:近年来,随着我国老龄化程度不断增加,老年疾病中心脑血管类疾病发病率和死亡率日益升高,受到越来越多的重视。心肌病属于心脏系统性疾病,相比于一般心肌病,遗传性心肌病的病程进展得更快,且症状也更加严重,而由lmna基因突变所... 详细信息

研究目的:近年来,随着我国老龄化程度不断增加,老年疾病中心脑血管类疾病发病率和死亡率日益升高,受到越来越多的重视。心肌病属于心脏系统性疾病,相比于一般心肌病,遗传性心肌病的病程进展得更快,且症状也更加严重,而由lmna基因突变所导致的扩张型心肌病更与猝死风险直接相关。lmna基因是人体内核纤层蛋白编码基因中的一种,主要负责编码lamin A/C蛋白。核纤层蛋白属于核中间丝家族,是核纤层的主要组成成分。核纤层蛋白与核孔复合体及其它核膜蛋白一起构成了核膜骨架结构,能够参与维持细胞核结构与功能的完整性和稳定性。研究表明,核纤层蛋白通过与核内其它蛋白结合或互作发挥生物力学功能、基因调控功能及信号传递等功能。核纤层蛋白编码基因lmna突变会引发一系列包括EDMD、DCM、CMT2B1、HGPS、FPLD2等,被统称为核纤层蛋白病综合征。特别是lmna基因单碱基突变造成的遗传性DCM,猝死率高,疾病进程快,无法治愈,且目其致病机制还不明确。随着基于CRISPR/Cas9技术的单碱基基因编辑技术的快速发展,其编辑窗口不断扩大,编辑效率不断提高,给人类遗传性疾病的治疗带来了新的希望。本研究通过利用单碱基编辑系统编辑携带lmna单碱基突变的体外模型,并对其细胞功能,基因表达,蛋白表达水平进行检测,进而确定lmna突变在核纤层蛋白综合征中的作用途径,以期为lmna突变相关疾病的治疗策略提供新的参考与思路。研究方法:(1)首先通过结合lmna突变数据库,NCBI数据库及sg RNA设计数据库,筛选出合适的sg RNA序列,并通过环形PCR与Golden Gate的方法将其插入sg RNA模板质粒,再通过脂质体转染的方法将其导入AC16心肌细胞,最后通过嘌呤酶素筛选,Sanger测序与有限稀释法挑选出单克隆突变细胞系并扩大培养。(2)利用荧光定量与蛋白免疫印迹技术对突变细胞系与lmna互作或与细胞增殖功能相关基因的表达情况进行检测。并将突变细胞系送样进行转录组测序检测。(3)通过免疫荧光染色与CCK-8试剂处理的方法,检测突变细胞的细胞形态、细胞核膜骨架结构与细胞增殖能力的变化。研究结果:(1)通过PCR产物电泳与测序的方法鉴定,本研究成功构建了Q517X与L92F两个lmna单碱基突变细胞系。(2)通过q PCR与WB检测及转录组学测序分析的方法,本研究发现lmna单碱基突变降低了核骨架结构蛋白lamin A/C、lamin B1,emerin及与细胞增殖能力相关蛋白P53与PKC-α的表达。转录组分析结果表明lmna突变Q517X对部分功能基因的表达调控发挥重要作用。(3)免疫荧光染色发现lmna突变细胞的核膜出现空泡并且细胞核骨架结构不完整;CCK-8试剂检测发现Q517X与L92F突变都会降低细胞的增殖能力,且Q517X降低的更明显。研究结论:本研究通过使用CBE单碱基编辑技术,靶向编辑了两个已被报道会造成laminopathies中DCM的lmna单碱基突变,成功构建了lmna单碱基突变细胞系。并发现,突变细胞系中lamin互作蛋白及与laminopathies相关蛋白的基因表达及蛋白合成出现异常,推测lmna突变通过改变基因表达与调控、蛋白质表达与功能及细胞核膜的结构与功能等途径,最终影响到正常细胞机构与功能,并进一步诱发DCM等相关疾病,综合考虑其应与特定信号通路的表达调控改变及细胞核结构功能异常具备很强的相关性。

关键词： lmna 核纤层蛋白核纤层蛋白病扩张型心肌病单碱基编辑

一房颤相关lmna基因突变p.R133Q的分子遗传研究

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一房颤相关LMNA基因突变p.R133Q的分子遗传研究

作者：胡冬萍华中科技大学

学位级别：硕士

心房颤动(atrial fibrillation,AF)是最常见的心律失常。房颤的发生与维持与心房结构重构和电重构有关,心房结构重塑包括炎症、细胞肥大、心房扩张和纤维化,它们作为致心律失常的底物(substrate)累积,导致异常电信号的形成和传导。电重... 详细信息

心房颤动(atrial fibrillation,AF)是最常见的心律失常。房颤的发生与维持与心房结构重构和电重构有关,心房结构重塑包括炎症、细胞肥大、心房扩张和纤维化,它们作为致心律失常的底物(substrate)累积,导致异常电信号的形成和传导。电重构包括影响心房心肌激活和传导的离子通道特性的改变,间隙连接的功能障碍或损伤可能导致心律失常。目前房颤的遗传基础尚不清楚,本课题中,通过对房颤病人进行遗传分析,发现一个lmna基因突变p.R133Q,并且对该突变进行一系列功能分析,分析其导致房颤的可能分子机制。主要结果如下:Ⅰ.通过对孤立性房颤患者DNA进行测序,鉴定出一个lmna基因杂合错义突变 p.R133Q。Ⅱ.将带有EGFP标签的lmna-WT和lmna-R133Q质粒转入AC16细胞,分析p.R133Q突变对核纤层蛋白定位的影响。免疫荧光结果显示p.R133Q突变导致lmna突变体蛋白定位异常,在核膜及核内出现异常聚集。Ⅲ.将带有RFP标签的lmna-WT和lmna-R133Q质粒转入AC16细胞,分析p.R133Q突变对核膜完整性以及核质运输的影响。发现在正常条件或压力应激条件下该突变均不影响核膜完整性,也不影响经典的核质运输。Ⅳ.为检测lmna p.R133Q突变影响的下游信号通路,进行了 RNA-seq分析。KEGG 分析显示 NF-kappa B signaling pathway、TNF signaling pathway 和MAPK signaling pathway等出现明显富集。随后进行了验证,发现MAPK通路显著激活,而且与细胞存活(cell viability)相关。Ⅴ.为检测lmna p.R133Q突变对电重构的影响,分析了 p.R133Q突变对一系列离子通道和缝隙连接蛋白表达的影响。结果显示突变导致Kir 2.1(KCNJ2)mRNA和蛋白表达上调,Cx43(GJA1)蛋白表达下调;进一步分析Cx43表达下调的可能机制,发现在mRNA水平,p.R133Q突变不影响Cx43 mRNA稳定性(Actinomycin D处理),不影响Cx43 mRNA的核质运输;在蛋白水平,p.R133Q突变不影响Cx43蛋白稳定性(放线菌酮,MG132 以及 Chloroquine 处理),p.R133Q 突变也不通过 MAPK、Wnt/βcatenin通路或者微管运输途径影响Cx43蛋白表达。主要结论:Ⅰ.lmna基因p.R133Q突变是一个与房颤相关的遗传变异。Ⅱ.lmna基因p.R133Q突变可能通过下调Cx43蛋白表达导致心律失常的发生。

关键词：房颤 lmna Cx43 突变

山羊β防御素124单克隆抗体制备及其相互作用蛋白的筛选和鉴定

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山羊β防御素124单克隆抗体制备及其相互作用蛋白的筛选和鉴定

作者：黄鑫芸山西农业大学

学位级别：硕士

β防御素是一种多功能的阳离子肽,是先天免疫系统中关键组成部分,具有抗菌、抗病毒活性、抗肿瘤活性、促精子成熟等作用。本课题组发现山羊β防御素124(Goat beta-defensin 124,gBD124)可以通过p38MAPK/AP1信号通路调控附睾头细胞趋化... 详细信息

β防御素是一种多功能的阳离子肽,是先天免疫系统中关键组成部分,具有抗菌、抗病毒活性、抗肿瘤活性、促精子成熟等作用。本课题组发现山羊β防御素124(Goat beta-defensin 124,gBD124)可以通过p38MAPK/AP1信号通路调控附睾头细胞趋化因子和细胞因子的表达,但未发现与gBD124结合的蛋白;此外由于缺少β防御素单克隆抗体,下一步试验受限。因此本试验将gBD124基因进行克隆,在原核系统中表达并纯化,将纯化重组gBD124蛋白免疫小鼠,利用小鼠单克隆杂交瘤技术将脾细胞和骨髓瘤细胞融合筛选得到特异性单克隆抗体细胞株。利用制备的gBD124单克隆抗体进行免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)试验,联合质谱筛选与gBD124蛋白相互作用蛋白,并将Co-IP与Western blot结合进行相互作用蛋白的鉴定。主要试验结果如下:(1)对山羊附睾gBD124基因进行载体构建,成功构建pET32a/gBD124载体,使用NiSmart Beads进行纯化,用重组牛肠激酶切除标签后获得纯化gBD124蛋白。将纯化gBD124蛋白免疫小鼠,细胞融合后获得5株能够稳定分泌gBD124单克隆抗体且效价高的单团细胞1B4、1C5、2E9、7E2和8C7,腹水制备的gBD124单克隆抗体1B4细胞株效价最高为1.12×10。(2)将制备得到的gBD124单克隆抗体固定在树脂上进行Co-IP试验,与质谱联用筛选与gBD124蛋白相互作用的蛋白,从山羊附睾头组织蛋白中筛选出3个互作蛋白分别为核纤层蛋白A/C(Lamin A/C,lmna)、热休克蛋白90α(Heat shock protein 90 alpha family class A member 1,HSP90AA1)和膜突蛋白(Moesin,MSN)。免疫荧光共定位结果显示gBD124和HSP90AA1共定位在细胞质中,gBD124和lmna共定位在细胞核中;Co-IP与Western blot结果表明gBD124抗体固定的Co-IP复合物中有HSP90AA1蛋白无lmna蛋白,说明HSP90AA1是gBD124相互作用蛋白。(3)通过荧光定量PCR和Western blot对山羊附睾组织中gBD124和HSP90AA1定量分析发现,gBD124在输出小管和附睾头1的表达量较高,显著高于附睾其他组织(P<0.05);HSP90AA1也在附睾头中的表达量较高(P<0.05)。综上所述,本试验成功构建gBD124原核表达系统,获得gBD124纯化蛋白并制备gBD124单克隆抗体,筛选并鉴定发现了gBD124的互作蛋白HSP90AA1。

关键词：山羊 β防御素124 单克隆抗体 Co-IP 蛋白相互作用 HSP90AA1 lmna 免疫荧光共定位

扩张型心肌病致病基因lmna新突变E82K的发现及其功能的初步研究

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中华心血管病杂志 2005年第10期33卷 875-879页

作者：王虎郑维越王继征王晓健甄一松宋雷邹玉宝惠汝太中国医学科学院中国协和医科大学阜外心血管病医院中德实验室北京100037

目的检测中国人家族性扩张型心肌病核纤层蛋白A(Lamin A)基因(lmna)突变情况并初步探索突变基因功能。方法(1)用基因测序的方法扫描1个中国人扩张型心肌病家系(50名成员)lmna基因的12个外显子,对照为60例正常志愿者。(2)构建野生及突变L... 详细信息

目的检测中国人家族性扩张型心肌病核纤层蛋白A(Lamin A)基因(lmna)突变情况并初步探索突变基因功能。方法(1)用基因测序的方法扫描1个中国人扩张型心肌病家系(50名成员)lmna基因的12个外显子,对照为60例正常志愿者。(2)构建野生及突变lmna基因的真核表达载体并分别转染HEK293细胞后,用0.8mmol/L过氧化氢刺激24h,观察各组细胞凋亡率的差异。结果(1)该家系先证者lmna基因第1号外显子第244位碱基位置发生G→A转换,其编码氨基酸由谷氨酸(E)变为赖氨酸(K)。(2)给予0.8mmol/L过氧化氢刺激24h后,转染突变lmna基因表达载体的细胞组凋亡率(29.13±1.24)%显著高于其他细胞组(Plmna基因E82K错义突变的患者临床表型呈现症状重、发病早、预后差的临床特点,且部分患者合并Ⅱ°～Ⅲ°房室传导阻滞,该突变所促进的细胞凋亡可能是导致扩张型心肌病的原因之一。

关键词：心肌病,充血性突变 lmna

在散发型腓骨肌萎缩症患者中未检测出lmna基因突变(英文)

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北京大学学报（医学版） 2006年第1期38卷 78-79页

作者：宋书娟章远志陈彪王曼捷王越英张远锦闫明 Nanbert ZHONG 北京大学医学遗传中心首都医科大学宣武医院神经科北京大学第三医院神经科

Objective: To intensively investigate sporadic CMT patients, we have analyzed the lmna gene in this study in a series of 32 unrelated CMT patients. Methods: Twelve exons of the lmna gene were amplified from genetomic DNA. PCR products of each exon were analyzed by single strand conformational polymorphism (SSCP). Results: No abnormal SSCP pattern, suggesting no mutation in our CMT patients, was detected. Conclusion: The CMT diseases resulted from the mutations of lmna gene were rare.

关键词：夏科-马里-图斯病基因 lmna 突变散发型腓骨肌萎缩症

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核纤层蛋白病——一个基因,多种疾病

北京大学学报（医学版） 2005年第1期37卷 96-99页

作者：宋书娟章远志 Nanbert ZHONG 北京大学医学部医学遗传学系北京100083

Laminopathies are genetic diseases that encompass a wide spectrum of phenotypes with diverse tissue pathologies and result mainly from mutations in the lmna gene encoding nuclear lamin A/C. To date, at least 9 different human diseases, which superficially seem to share little with one another, result from lmna mutations. The position of the mutation within lmna appears to be associated with the phenotypes. This review gives an overview of genotype-phenotype relationship and describes recent advances in animal models and pathogenic mechanisms.

关键词：核纤层蛋白质类遗传性疾病先天性基因 lmna 动物模型